Extracto
Una combinación de imagen del cáncer molecular específica y la terapia es una nueva estrategia para mejorar el diagnóstico del cáncer y reducir al mínimo los efectos secundarios de los tratamientos convencionales . Aquí, hemos generado una proteína recombinante, EC1-gluc-p53C, mediante la fusión de péptido EC1, un ligando artificial de ErbB2, con
Gaussia
luciferasa (gluc) y un péptido p53-activación, p53C. EC1-gluc-p53C se expresó y se purificó a partir de
E. coli BL21
.
in vitro
experimentos mostraron que EC1-gluc-p53c se mantuvo estable en la actividad luminiscente y dirigidos selectivamente a las células BT474 que sobreexpresa ErbB2 de imágenes de bioluminiscencia. Por otra parte, la CE 1-gluc-p53C internalizado en las células BT474 ejerce su función de reactivar p53 y proliferación celular significativamente inhibido. En los ratones portadores de tumores, la formación de imágenes de bioluminiscencia ErbB2-objetivo y efecto terapéutico de EC1-gluc-p53C también se observaron específicamente en tumores BT474 pero no en los tumores MCF7, que no sobreexpresan ErbB2. Por lo tanto, el presente estudio demuestra EC1-gluc-p53C sea un reactivo teranóstico focalización efectiva ErbB2 de imágenes de bioluminiscencia y la terapia del cáncer
Visto:. Han XJ, Sun LF, Nishiyama Y, Feng B, Michiue H, Seno M, et al. (2013) La proteína ErbB2 teranóstico Orientación para la bioluminiscencia por Imágenes y Terapia para el cáncer. PLoS ONE 8 (9): e75288. doi: 10.1371 /journal.pone.0075288
Editor: Xiaoyuan Chen, NIH, Estados Unidos de América
Recibido: 18 de abril de 2013; Aceptado: August 12, 2013; Publicado: 17 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Han et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la subvención-en-ayudas para jóvenes científicos (B) del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes y Cultura de Japón (n: 21790202, http: //www.waseda.jp/rps/en/manual/kaken hi_honbun.html) y por la subvención-en-ayudas a la Investigación Científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (n: 22.00119, http: //www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ErbB2 es un miembro del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de la familia de receptores de tirosina quinasas, también llamada la familia ErbB. La familia ErbB incluye cuatro miembros, ErbB1, ErbB2, ErbB3 y ErbB4. Hay varios ligandos endógenos para los receptores ErbB con la excepción de ErbB2 [1]. La actividad de la tirosina quinasa de ErbBs puede ser activado por ligandos endógenos y los homo- o hetero-dimerización de receptores ErbB, que está implicado en la regulación de la proliferación celular y la supervivencia celular [1-3]. Además, ErbB2 se ha implicado en la patogénesis y progresión tumoral [4-6]. Clínicamente, la sobreexpresión de ErbB2 se asocia con aproximadamente 30% de los cánceres de mama, cánceres de ovario [7] y otros tipos comunes de cáncer, incluyendo de pulmón, gástrico, y cáncer oral [8]. La sobreexpresión también se asocia con las metástasis, la resistencia terapéutica y el mal pronóstico del cáncer [9-11]. Por lo tanto, ErbB2 puede ser una diana molecular prometedora para formación de imágenes y tratamiento del cáncer usando anticuerpos monoclonales y vectores de péptido de segmentación [12,13]. En un estudio de presentación de fagos, se identificaron varios pequeños péptidos cíclicos artificiales con afinidad específica para ErbB2. EC1, uno de estos péptidos artificiales, unido al dominio extracelular de ErbB2 en las células vivas y las muestras frescas congeladas humanos de cáncer de mama [14]. Por otra parte, EC1 conjugado con biotina y la proteína recombinante EC1-eGFP retenido afinidad por ErbB2 y se internaliza por las células de cáncer que sobreexpresa ErbB2 [14,15]. Recientemente, se informó de formas divalentes y multivalentes de ligando EC1-Fc en liposomas para mejorar la afinidad por ErbB2 y mejorar la internalización [16]. Por lo tanto, el péptido EC1 puede ser un ligando artificial potencial para la orientación ErbB2.
en la patogénesis tumoral, varias mutaciones anormales se encuentran en los genes supresores de tumores. Uno de los genes supresores de tumores más conocidos es
p53
, que es un importante regulador de la apoptosis y el gen más comúnmente mutado en el cáncer [17,18]. Restauración de la actividad de p53 se ha demostrado ser un medio eficaz para el tratamiento de células cancerosas con mutaciones de p53 [19,20]. En nuestros estudios anteriores [21-23], una p53 recombinante de longitud completa fue entregado con éxito en células humanas malignas de glioma, oral y células de cáncer de vejiga mediante la fusión con poli-arginina, un péptido de penetración celular (CPP). Se encontró que la p53 recombinante de longitud completa tuvo un efecto inhibidor significativo sobre la proliferación de células cancerosas. Sin embargo, el gran tamaño molecular y la degradación rápida por la vía de la ubiquitina-proteasoma influenciados en gran medida la eficiencia de la transducción de la proteína y el efecto de la p53 en las células cancerosas transducidas [24]. El C-terminal de p53 es un tema de dominio rico en lisina a una variedad de modificaciones postraduccionales [25,26]. Un péptido derivado de la C-terminal activa unión a ADN específica con p53
in vitro
a través de un mecanismo desconocido [27]. Se informó de que el péptido C-terminal de p53 derivado (p53C) indujo apoptosis rápida en células de cáncer de mama con mutaciones de p53 endógenos o sobreexpresa p53 de tipo salvaje (wt), pero no era tóxico para las líneas celulares humanas malignas que contienen p53 en peso [28 ]. Además, el péptido p53C fusionado con CPP inhibe la proliferación de células cancerosas mediante la reactivación de p53 endógeno, y aumenta significativamente la vida útil en modelos animales de carcinomatosis peritoneal terminal y cáncer de vejiga
in vivo
[29-31]. Estos estudios demuestran la reactivación de la proteína p53 por el péptido p53C ser un medio prometedor para la terapia del cáncer.
Imágenes de bioluminiscencia se está convirtiendo en una forma relativamente sencilla, rentable y extremadamente sensible para monitorear los procesos biológicos dinámicos en intacta células y animales que viven [32]. En los últimos años, la tecnología se ha desarrollado rápidamente con mejoras en la prensa de luciferasa y la instrumentación [33]. Las luciferasas más comunes de imágenes de bioluminiscencia incluyen
Firefly
luciferasa (Fluc),
Renilla luciferasa
(Rluc) y
Gaussia
luciferasa (gluc). Cada luciferasa tiene propiedades distintas en la aplicación de imágenes de bioluminiscencia. Fluc (62 kDa) cataliza la oxidación de luciferina para producir bioluminiscencia en presencia de O
2, magnesio y ATP [34]. Rluc (36 kDa) y gluc (19,9 kDa) catalizan la descarboxilación oxidativa de coelenterazina para emitir luz independiente de ATP. Sin embargo, Rluc tiene un rendimiento cuántico inferior a Fluc, y también la eficiencia enzimática menos [35,36]. Gluc produce aproximadamente 200- (
in vivo
) a 1000 veces (
in vitro
) más bioluminiscencia en células de mamífero que Fluc y Rluc [37]. Por lo tanto, su pequeño tamaño molecular (19.9kDa), la independencia de la ATP y la fuerte emisión hacer gluc mucho más adecuado para imágenes de bioluminiscencia
e in vitro
in vivo
[38,39].
El concepto de "teranóstico" se originó por Funkhouser en 2002 de uno de sus comentarios [40]. Theranostics se define como un material que combina las modalidades de terapia y de diagnóstico por imagen al mismo tiempo dentro de la misma dosis. El objetivo de teranóstico es donar materiales con la capacidad de monitorizar el tejido tratado y la eficacia en el período a largo plazo [41]. teranóstico reactivos se han desarrollado rápidamente en la década anterior, especialmente después de la aparición de nuevas sondas ópticas y biomoléculas potentes para la orientación y la terapia. En el presente estudio, una nueva proteína ErbB2 bioluminiscencia de metas se construyó mediante la fusión con EC1 gluc y el péptido p53C. Dos líneas celulares de carcinoma de mama humano, MCF7 sin expresión de ErbB2 y BT474 que sobreexpresan ErbB2, se emplearon para evaluar el papel de EC1-gluc-p53C en imágenes de bioluminiscencia específico y la terapia del cáncer. Hemos observado que EC1-gluc-p53C no sólo dirigido ErbB2 de imágenes de bioluminiscencia, sino que también inhibe selectivamente la proliferación celular y el crecimiento tumoral del BT474
in vitro
y
in vivo
. Los presentes resultados indican que EC1-gluc-p53C puede ser un reactivo teranóstico prometedora orientación ErbB2 de imágenes de bioluminiscencia y la terapia.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y detección de la expresión de ErbB2
las líneas celulares MCF7 y BT474 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). células BT474 llevan una mutación sin sentido (E285K) en el gen p53 [42], mientras que las células MCF7 con la sobreexpresión de p53 en peso [28]. células BT474 se cultivan en un medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 mg de penicilina-estreptomicina /ml (P /S). células MCF7 fueron cultivadas en medio DMED suplementado con 10% de FBS y 100 mg /ml P /S. Los medios, FBS y P /S fueron de Invitrogen. Todos los cultivos se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C con una atmósfera que contiene 5% de CO
2.
La expresión de ErbB2 en las células MCF7 y BT474 se examinó por inmunotransferencia Western. Brevemente, las células MCF7 y BT474 en placas de 35 mm se lavaron una vez con PBS, y se rasparon en 1 x tampón de muestra de SDS. Los lisados celulares se sometieron a 6% de SDS-PAGE, y a inmunotransferencia con anticuerpo de conejo anti-ErbB2 (1: 1000; Cell Signaling) durante la noche a 4 ° C. anticuerpo secundario conjugado con HRP (Sigma-Aldrich) se utilizó a 1: 2000. señales de inmunotransferencia fueron detectados por el sistema de imagen 5000 Versa Doc (Bio-Rad) con un kit de detección de quimioluminiscencia (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA).
Construcción de plásmidos
El plásmido fue adquirido pGLuc LUX Biotechnology Ltd (Escocia, Reino Unido). El gen gluc se amplificó a partir del plásmido usando un cebador sentido (5'-GGATCCGAAACCAACTGAAAACAATGAAG-3 ') y el cebador antisentido (5'-GTCGACATCACCACCGGCACCCTTTAT-3'). El producto de PCR se ligó en el vector pCR2.1 TOPO (Invitrogen) para la amplificación, y volvió a clonar en el vector pET52b (Invitrogen) para construir gluc-pET52b. Se prepararon los siguientes oligonucleótidos sentido y antisentido (Hokkaido System Science, Japón) con sitios de enzimas de resistencia apropiados para EC1 o p53C péptido; para CE1; 5'-GGGTGGACTGGCTGGTGCCTGAATCCAGAAGAATCTACTTGGGGATTCTGTACTGGATCTTTCGGTGGAGGTAGTTCAG-3 '(sentido, subrayado indica
Sam
I y
Bam HI sitios
) y 5'-GATCCTGAACTACCTCCACCGAAAGATCCAGTACAGAATCCCCAAGTAGATTCTTCTGGATTCAGGCACCAGCCAGTCCACCC-3' (antisentido, subrayado indica
Bam
HI y
Sam
sitios), y para p53C; 5'-TCGACGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAAGGCGC-3 '(sentido, subrayado indica
Sal
Ⅰand
No
Ⅰsites), y 5'-GGCCGCGCCTTTTTTATGGCGGGAHHTAGACTGACCCTTTTTGGACTTCAGGTGGCTGGAGTGAGCCCTGCTCCCG-3' (sentido, subrayado indica
No
ⅰand
Sal
ⅰsites). Los oligonucleótidos para EC1 y p53C fueron modificados por fosforilación en 5 '. Los oligonucleótidos sentido y antisentido (10 pmol cada uno) se co-incubaron a 95 ° C durante 10 min, y se recoció a temperatura ambiente para formar ADN de doble cadena. El ADN de doble cadena para EC1 o p53C se ligó a gluc-pET52b tratado con las enzimas de resistencia apropiados para la construcción de EC1-gluc-pET52b o EC1-gluc-p53C-pET52b. La mutagénesis dirigida se introdujo a BamHI en EC1-gluc y EC1-gluc-p53C utilizando un kit QuikChange (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores para la mutagénesis fueron 5'-GTGGAGGTAGTTCAGGAACCAAACCAACTG-3 '(sentido, subrayado indica el nucleótido mutado), 5'-CAGTTGGTTTGGTTCCTGAACTACCTCCAC-3' (antisentido). Gluc, gluc-EC1 y CE1-gluc-p53C se subclonaron en pGEX-6P-1 entre el
Bam HI y
Eco RI
sitios para la purificación de proteínas. Las secuencias de los plásmidos construidos se confirmaron usando un secuenciador ABI 3100.
Expresión y purificación de proteínas recombinantes
La expresión y purificación de proteínas recombinantes se realizaron como se describe anteriormente [21]. En pocas palabras,
E. coli
BL21 (DE3) transformada con el plásmido para la gluc, EC1-gluc o EC1-gluc-p53C se cultivó en un medio LB que contiene 100 mg /ml de ampicilina a 37 ° C. Cuando la DO600 alcanzó 0,6, la expresión de las proteínas GST-fundido fue inducida por la adición de isopropilo 0,2 mM 1-tio-β-D-galactopiranósido a 25 ° C durante la noche. Las proteínas de fusión se purificaron utilizando una columna de glutatión Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare). Para escindir la GST de las proteínas de fusión, las proteínas purificadas se trataron adicionalmente con PreScission proteasa (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las proteínas recombinantes fueron sometidos a 15% de SDS-PAGE, y se confirmaron mediante tinción con azul brillante de Coomassie y la inmunotransferencia con anti-conejo
Gaussia
suero de luciferasa (1: 1000, Nanolight). Las proteínas fueron finalmente dializados contra PBS, y las concentraciones se determinaron usando un kit de ensayo de proteínas (Bio-Rad Laboratories). Las alícuotas de la proteína se almacenaron a -80 ° C antes de su uso.
Preparación de coelenterazina (CTZ)
El sustrato para gluc se preparó como se describe anteriormente [32]. Brevemente, CTZ (Nanolight) se disolvió en metanol acidificado (1 gota de HCl concentrado (12,4 N) en 10 ml de metanol) a una concentración de 5 mg /ml. Las alícuotas de 100 pl fueron almacenadas a -80 ° C. Para formación de imágenes de luminiscencia, las alícuotas de CTZ (5 mg /ml) se diluyeron con PBS (que contiene 5 mM de NaCl, pH 7,2) para una mayor salida de luz y una mayor estabilidad.
Los ensayos de la actividad luminiscente y la estabilidad de las proteínas recombinantes
para determinar la actividad luminiscente de las proteínas purificadas, 2μg de cada proteína se transfirió a una placa de 96 pocillos. La bioluminiscencia se midió usando un luminómetro de placas (MicroLumat LB 96V más, las tecnologías de Berthold) después de la adición de 10 l de CTZ (20 M). actividad bioluminiscente se informó en unidades relativas de luz (RLU) medida con un tiempo de integración de 10 segundos y calculados como RLU por micromol para cada proteína. Los valores para EC1-gluc y CE1-gluc-p53C se normalizaron con gluc.
La estabilidad de las proteínas recombinantes se evaluó como se describe anteriormente [38]. Las alícuotas de la proteína se incubaron con un volumen igual de suero de ratón (Sigma) a 37 ° C. En cada punto de tiempo, se extrajeron muestras de imágenes de bioluminiscencia y transferencia Western. En el análisis de la estabilidad de la bioluminiscencia, el porcentaje de la cantidad inicial de RLU en cada punto de tiempo se trazan para cada proteína. Para detectar la degradación de las proteínas después de la incubación con suero, muestras retiradas en cada punto de tiempo se sometieron a electroforesis en 15% de gel de acrilamida SDS-PAGE, y a inmunotransferencia con anti-conejo
Gaussia
suero de luciferasa a una dilución de 1: 1000. HRP-conjugado anticuerpo secundario (conejo, Sigma-Aldrich) se utilizó a 1: 2000
Imágenes de bioluminiscencia
in vitro
, internalización por células que sobreexpresan ErbB2 y WST-1 ensayo
.
Para obtener imágenes de bioluminiscencia células
in vitro
, MCF7 y BT474 se cultivaron en placas con fondo de vidrio de 35 mm. Para mejorar la adherencia de las células MCF7 y BT474, todos los platos con fondo de vidrio fueron pre-recubiertas con laminina (Roche). células MCF7 y BT474 se incubaron con 1μM de cada proteína durante 24 h. Después de tres lavados con DMEM, se detectó la bioluminiscencia con una Olympus Luminoview LV (microscopio Bio-luminiscencia) 200 inmediatamente después de la adición de 1 mg /ml CTZ en DMEM libre de suero. Las imágenes fueron adquiridas y analizadas con el software Metamorph (Molecular Devices).
Para examinar la internalización de proteínas fusionadas-EC1 en ErbB2 que sobreexpresan las células cancerosas, las células BT474 se incubaron con 1 M de gluc, gluc-EC1 o EC1- gluc-p53C. En el bloqueo de estudio, las células BT474 se trataron con anticuerpo anti-ErbB2 contra dominio extra-celular de ErbB2 (de pollo, 1,0 mg /ml, Abcam) 1 h antes de la incubación con EC1-gluc o EC1-gluc-p53C. Después de 24 h, las células se lavaron con PBS tres veces y tripsinizaron. El lisado celular se preparó y se sometió a 15% SDS-PAGE. La internalización de la proteína de fusión se inmunotransferencia con anti-conejo
Gaussia
suero luciferasa. β-actina se utilizó como control endógeno.
Para evaluar el efecto terapéutico de EC1-gluc-p53C
in vitro
, se determinó la viabilidad celular usando un ensayo de WST-1 como se describe anteriormente [ ,,,0],21]. Después de 3,0 × 10
3 MCF7 y 1,0 × 10
4 BT474 células se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano, que se cultivaron en DMEM o medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10% durante 24 h. Después las células se complementan con 1μM de proteína o PBS (day0) y se cultivaron adicionalmente 96 h (Day4). La viabilidad celular desde el día 0 al día 4 se midió usando el ensayo de WST-1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Applied Science). Para determinar el efecto dependiente de la dosis de EC1-gluc-p53C sobre la proliferación de células BT474, la proteína se utilizó a 0,1 ~ 2,0 M, y el ensayo de WST-1 se llevó a cabo en días 4.
Ensayo Reportero La transactivación de p53 impulsada
El reportero de ensayo se realizó como se ha descrito anteriormente [22]. En pocas palabras, el informador de luciferasa vector que contiene un fragmento de 2,4 kpb de la p21 humana pGL2-básico (Promega)
WAF1
promotor fue un regalo de los Dres. T. Akiyama (Universidad de Tokio) y K. Yoshikawa (Universidad de Osaka). células BT474 cultivaron hasta 80% de confluencia en placas de 35 mm de diámetro fueron transfectadas con el vector informador de la luciferasa por lipofectamina 2000 (Invitrogen). Después de 24 h, las células se incubaron con 1μM de gluc, EC1-gluc, EC1-gluc-p53C o el mismo volumen de PBS durante 24 horas, y se cultivaron adicionalmente en medio nuevo 2 h antes de la celda de la cosecha. El lisado celular se utilizó para medir la actividad de luciferasa con un luminómetro y Luciferase Assay System (Promega). La actividad de fondo de la luciferasa fue sustraído en todos los experimentos. Cinco experimentos independientes se realizaron para cada condición.
Preparación de tumor-teniendo ratones
ratones Nude (Balb /c Slc-nu /nu, hembra, de 6 ~ 8 semanas) se compraron de Charlesriver , Japón. El plan de experimentos con animales fue revisado y aprobado por el comité de ética de la experimentación con animales de la Universidad de Okayama bajo el ID de Oku-2.010.378, Oku-2011400. pellets de 17β-estradiol (0,72 mg; Innovative Research of America) se implantaron 4 días antes del trasplante de células tumorales y permanecieron en el lugar hasta el final del estudio. Las células MCF7 y BT474 cultivadas se lavaron dos veces con PBS, typsinized, y se recogieron por centrifugación. Las células (5,0 × 10
6 células) suspendidas en Matrigel (BD Bioscience) se trasplantaron por vía subcutánea en ambos flancos de ratones anestesiados con intraperitonealmente inyección de 5 mg /100 g de solución de pentobarbital en condiciones asépticas. Los ratones con tumores desarrollados por 10 ~ 14 días se utilizaron para
in vivo
experimentos. Durante el desarrollo de tumores, la respiración y la actividad de comportamiento se monitorizaron dos veces al día para evaluar el dolor en ratones. Los experimentos se detuvieron de inmediato si los ratones aparecieron significativo de los síntomas de dolor. Todos los ratones se sacrificaron mediante inyección intraperitoneal de 15 mg 100 g solución /pentobarbital después de los experimentos.
La expresión de ErbB2 en MCF7 y BT474 xenoinjertos fue confirmada por inmunofluorescencia (IF) de tinción. rebanadas en parafina de los tumores se prepararon con un espesor de 5 micras. En primer lugar, las observaciones histológicas de los tumores xenoinjertados se hicieron usando H & amp; E tinción. SI tinción se realiza entonces con el anticuerpo anti-ErbB2 (01:50; Cell Signaling). El anticuerpo secundario fue conjugado con Cy3 anti-IgG de conejo (1: 100; Invitrogen, Molecular Probes). El núcleo fue contra el teñidas con 0,1 mg /ml de Hoechst 33248 (Sigma) durante 5 min. No se observaron señales de fluorescencia utilizando un microscopio láser confocal (FV300, Olympus).
retención de localización tumoral de EC1-gluc-p53C en xenoinjertos tumorales
A continuación, 30 l de EC1-gluc-p53C proteínas (0,5 g /l) se inyectó por vía intratumoral en xenoinjertos de MCF7 y BT474 en ratones desnudos. A la 1, 3, 6, 12 y 24 horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados. Los tumores fueron extirpados e inmediatamente se fijaron con 4% de paraformaldehído. rebanadas en parafina de los tumores MCF7 y BT474 se prepararon a 10 micras. La tinción de inmunofluorescencia se realizó para analizar la distribución de EC1-gluc-p53C en los tumores. La tinción de inmunofluorescencia se realizó de acuerdo a las instrucciones que acompañan el conejo anti-
Gaussia
suero luciferasa. El anticuerpo secundario fue conjugado con FITC de IgG de conejo (1: 100, Invitrogen, Molecular Probes). No se observaron señales de fluorescencia utilizando un microscopio láser confocal (FluoView, Olympus, Japón).
Imágenes de bioluminiscencia
in vivo
Para obtener imágenes de bioluminiscencia
in vivo
, 30 l de proteína EC1-gluc-p53C (0,5 g /l) se inyectaron por vía intratumoral en los xenoinjertos de MCF7 y BT474 establecidos en ratones desnudos. A las 6, 8, 12 y 24 horas después de la inyección, los ratones se obtuvieron imágenes por inyección a través de una vena de la cola con 100 l de solución de CTZ (3 mg /Kg) bajo anestesia utilizando una cámara CCD enfriada (IVIS Lumina-II, Caliper Life Sciences ) como se describe anteriormente [39]. La intensidad bioluminiscente de la región seleccionada sobre el tumor se registró como fotones máximos s
-1 cm
-2 estereorradián
-1.
Efecto de la CE1-gluc-p53C sobre el crecimiento tumoral se permitió
MCF7 y BT474 xenoinjertos en ambos costados de ratones desnudos creciendo hasta un volumen promedio de ~ 100 mm
3 ± 10 mm
3 se obtuvo antes de la inyección de proteínas. A continuación, 30 l de la proteína recombinante purificada (0,5 mg /l) o 30 l de PBS se inyectó por vía intratumoral en MCF7 y BT474 xenoinjertos todos los días durante 5 días. Los ratones se controlaron diariamente y su volumen tumoral se midió usando calibradores vernier digitales semanas dos veces. Durante todo el curso de la terapia en el experimento carga tumoral murió ningún ratón. El volumen del tumor se calculó según la fórmula: volumen tumoral = L x W
2 × 0,5 (L es el diámetro más largo, W es el diámetro más corto)
El análisis estadístico
Datos. se muestran como la media ± desviación estándar o media ± SEM Los datos se analizaron utilizando la prueba t de Student para comparar dos condiciones o ANOVA seguido de comparaciones planificadas de múltiples condiciones, y P & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Purificación y caracterización bioquímica de. las proteínas recombinantes
las tres construcciones de proteína GST fusionadas se expresan en
E. coli BL21
y se purificó utilizando una columna de glutatión Sepharose 4 Fast Flow. Después de la purificación, la etiqueta de GST se escindió por PreScission proteasa para cosechar gluc, EC1-gluc y EC1-gluc-p53C como se muestra en la Figura 1a. Gluc y CE1-gluc se utilizaron como control de las proteínas. Coomassie tinción con azul brillante reveló la pureza de las tres proteínas a ser & gt; 80%. Los tamaños moleculares de gluc, gluc-EC1 y CE1-gluc-p53C fueron de aproximadamente 20, 23 y 25 kDa, respectivamente (Figura 1b). En la transferencia Western, las principales bandas de gluc, gluc-EC1 y CE1-gluc-p53C y bandas menores adicionales correspondientes a las proteínas GST-fundido se observaron (Figura 1c). Por otra parte, una pérdida de la actividad bioluminiscente se indujo por la fusión de EC1 y el péptido p53C con gluc. Una reducción de aproximadamente el 30% y el 50% se detectó en la actividad bioluminiscente de EC1-gluc y CE1-gluc-gluc p53C comparación con, respectivamente (Figura 1d).
a) Esquema de la purificación de EC1-gluc -p53C con el sistema de expresión de GST. La etiqueta de GST fue escindida por la proteasa PreScission después de la purificación. b) Coomassie tinción con azul brillante de las proteínas purificadas después del 15% de SDS-PAGE. El carril 1 ~ 4 son marcador, gluc, gluc-EC1 y CE1-gluc-p53C, respectivamente. c) Las proteínas purificadas después del 15% de SDS-PAGE se detectaron mediante transferencia Western con anti-conejo
Gaussia
suero luciferasa. Los carriles 1 ~ 3 son gluc, gluc-EC1 y CE1-gluc-p53C, respectivamente. d) las actividades bioluminiscentes de las proteínas purificadas. Cada proteína (2 g) se evaluó utilizando un luminómetro de placas. Los valores bioluminiscentes de EC1-gluc y CE1-gluc-p53C se normalizaron con gluc. n = 6 cada uno, * p & lt;.
0,01
La estabilidad de gluc, gluc-EC1 y CE1-gluc-p53C se evaluó mediante incubación en suero de ratón a 37 ° C. La estabilidad de gluc se mejoró por la fusión de EC1 y p53C. La vida media de la actividad luminiscente de gluc se determinó como 18,6 horas, mientras que la de CE1-gluc y EC1-gluc-p53C fue 189,5 y 216 horas, respectivamente (Figura 2A). Como resultado, la actividad bioluminiscente de EC1-gluc-p53C alcanzó 92% de la de gluc a 3 h después de la incubación en suero (Figura 2b). Además, la degradación de las tres proteínas en el suero también se examinó por transferencia de Western usando el anticuerpo anti-gluc. Las tres proteínas eran estables frente a la degradación cuando se incubaron en suero a 37 ° C (Figura 2c). Estos resultados sugieren que la actividad bioluminiscente y la estabilidad de EC1-gluc-p53C ser adecuados para su aplicación tanto
in vitro
y
in vivo
.
Las proteínas se incubaron con un volumen igual de suero de ratón a 37 ° C fueron retiradas en los puntos de tiempo indicados para la evaluación de la actividad bioluminiscente (a) y Western Blot (c). b) La actividad bioluminiscente de EC1-gluc-gluc p53C y se examinó 3 h después de la incubación en el suero. Los valores bioluminiscentes de EC1-gluc-p53C se normalizaron con gluc. n = 6 cada uno.
objetivos EC1-gluc-ErbB2 p53C de imágenes de bioluminiscencia
in vitro
Dos líneas celulares de carcinoma de mama humano, MCF7 y BT474, eran utilizado para evaluar el ErbB2-dirigida de imágenes
in vitro
. La sobreexpresión de ErbB2 en BT474 se confirmó por transferencia Western, mientras que la expresión de ErbB2 en células MCF7 era indetectable (Figura 3a). Para detectar la bioluminiscencia ErbB2-dirigida, las células MCF7 y BT474 se trataron con 1 M de las proteínas recombinantes. Se detectó una señal fuerte en las células BT474 que sobreexpresan ErbB2-incubadas con EC1-gluc y CE1-gluc-p53C (Figura 3b, Figura S1). En contraste, no se observó bioluminiscencia significativa en las células MCF7 incubadas con cada proteína (Figura 3b, Figura S1). Además, la internalización de las proteínas recombinantes también se observó en células BT474 incubadas con EC1-gluc y EC1-gluc-p53C, y la internalización de proteínas fusionadas-EC1 era principalmente indetectable, cuando el dominio extra-celular de ErbB2 fue bloqueado por anti- anticuerpo ErbB2 (Figura 3c). Estos resultados sugieren que EC1-gluc y CE1-gluc-p53C conservan afinidad por ErbB2, y se internalizan en las células que sobreexpresan ErbB2-
in vitro
.
a) La expresión de ErbB2 en MCF7 y BT474 Células. El lisado celular de las dos líneas de células se sometió a 6% de SDS-PAGE y inmunotransferencia con anticuerpo anti-ErbB2. β-actina se utilizó como control endógeno. b) Imágenes de bioluminiscencia
en
in vitro
. Las células incubadas con 1 M de EC-gluc-p53C se lavaron con medio de cultivo sin suero. Las imágenes fueron adquiridas con un microscopio de bioluminiscencia inmediatamente después de la adición de 1 mg /ml CTZ. I y III, las imágenes de bioluminiscencia; II y IV, las imágenes de contraste de fase. Bar = 100 micras. c) La internalización de proteínas fusionadas-EC1 en células BT474 que sobreexpresan ErbB2. Las células se incubaron con 1 M de proteína durante 24 h, carril 1: gluc; carril 2: EC-gluc-p53C; carril 3: EC-gluc; carril 4: anti-ErbB2 + EC1-gluc-p53C; carril 5: anti-ErbB2 + EC-gluc. La internalización de la proteína de fusión se inmunotransferencia con anti-conejo
Gaussia
suero luciferasa. β-actina se utilizó como control endógeno.
EC1-gluc-p53C inhibe selectivamente la proliferación de células BT474 que sobreexpresa ErbB2
ensayo de WST-1 se utilizó para evaluar el efecto de la proteínas recombinantes sobre la proliferación de células MCF7 y BT474. EC1-gluc-p53C inhibió significativamente la proliferación de células BT474 MCF7 pero no en el día 3 y 4 (Figura 4a). Las proteínas de control, gluc y CE1-gluc, no tuvieron un efecto significativo sobre la proliferación de ninguna línea celular (Figura 4a). Por otra parte, el efecto de EC1-gluc-p53C sobre la proliferación de BT474 era dependiente de la dosis (Figura 4b). Además, los resultados de ensayo de indicador de luciferasa de transactivación p53 impulsada indicaron que el péptido p53C era activa y reactiva p53 endógeno cuando internalizado en las células BT474 (Figura 4c). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el efecto inhibidor de EC1-gluc-p53C sobre la proliferación de células de cáncer tiene una propiedad ErbB2-focalización y se debe a la eficacia del péptido p53C en la proteína de fusión.
a) Tiempo cambios dependientes de proliferación de MCF7 (panel superior) y BT474 células (panel inferior). Las células fueron suplementados con 1 mM de cada proteína recombinante o PBS (control) en el día 0 y se cultivaron adicionalmente 96 h (día 4). La proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de WST-1 cada 24 h. ♦, PBS (control); ■, gluc; ▲, EC1-gluc; ×, EC1-gluc-p53C. n = 6 cada uno. * P & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01 vs control. b) Efecto dependiente de la dosis de EC1-gluc-p53C sobre la proliferación de células BT474. Las células BT474 se trataron con EC1-gluc-p53C a diversas concentraciones o PBS (Cont.), y el ensayo de WST-1 se llevó a cabo en el día 4. n = 6 cada uno. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0.01. c) p53 impulsada por la actividad transcripcional de p21 con el
WAF1
ensayo indicador de luciferasa. BT474 transfectadas con el vector informador de luciferasa se incubaron con 1μM de gluc, EC1-gluc, EC1-gluc-p53C o PBS durante 24 h. p21
WAF1
actividades reportero de luciferasa en las células se midieron con el sistema de ensayo de luciferasa. Los datos se presentan como la media ± E.E.M.
n
= 5 en cada grupo; ** P & lt; 0.01.
EC1-gluc-p53C objetivos ErbB2 de imágenes de bioluminiscencia
in vivo
Para los experimentos
in vivo
, hemos preparado los ratones con MCF7 y BT474 tumores xenoinjertados en ambos flancos. Las observaciones histológicas de los tumores se hicieron usando H & amp; E tinción (Figura S2a). Alta expresión de ErbB2 en tumores BT474 también fue confirmada por tinción con IF (Figura S2b). Para evaluar la propiedad de ErbB2-focalización de EC1-gluc-p53C
in vivo
, la retención de EC1-gluc-p53C en los tumores después de la inyección intratumoral fue examinado por tinción IF con anticuerpo anti-gluc. EC1-gluc-p53C era detectable en los tumores BT474 hasta 24 h después de la inyección. Por el contrario, EC1-gluc-p53C sólo se detectó débilmente en MCF7 tumores de hasta 6 h después de la inyección (Figura 5). El resultado sugiere que el tiempo de retención de EC1-gluc-p53C a ser mucho más largo en BT474 que los tumores MCF7. Basado en el tiempo de retención de EC1-gluc-p53C en los tumores, imágenes bioluminiscentes se adquirieron 6, 8, 12 y 24 h después de la inyección de la proteína. La señal se detectó en tumores BT474 durante hasta 24 h, mientras que era indetectable en los sitios del tumor MCF7 8 h después de la inyección de proteína (Figura 6). Estos resultados sugieren que la propiedad ErbB2-focalización de EC1-gluc-p53C facilita su retención en los tumores y BT474 imágenes de bioluminiscencia
in vivo
.
En los puntos de tiempo indicados después de la inyección intratumoral de EC1-gluc -p53C, los ratones murieron y se extirparon los tumores. Los tumores fueron fijadas inmediatamente con PFA al 4%. rebanadas en parafina de los tumores se prepararon con un espesor de 10 micras.