Extracto
El motor de la proteína kinesin superfamilia de proteínas (kifs) están implicados en la progresión del cáncer. El agotamiento de una de las KIFs, KIF14, podría retrasar la transición de la metafase a la anafase-, lo que resulta en un estado binucleada, lo que mejora la progresión del tumor; Sin embargo, la correlación exacta entre KIF14 y la progresión del cáncer sigue siendo ambigua. En este estudio, el uso de la pérdida de heterocigosidad y matriz de análisis de hibridación genómica comparativa, se observó una pérdida de 30% en las regiones circundantes KIF14 en el cromosoma 1q en adenocarcinomas de pulmón. Además, los niveles de expresión de proteína de KIF14 en 122 adenocarcinomas de pulmón también indicaron que aproximadamente el 30% de los adenocarcinomas mostró KIF14 baja regulación en comparación con la expresión en las células epiteliales bronquiales de los homólogos normales adyacentes. Además, la reducción de la expresión de ARNm de KIF14 o proteínas se correlacionó con la pobre supervivencia global (p = 0,0158 y & lt; 0,0001, respectivamente), y los niveles de proteína también se correlaciona inversamente con la metástasis (P & lt; 0,0001). La sobreexpresión de KIF14 en células de adenocarcinoma de pulmón inhibió el crecimiento independiente de anclaje
in vitro Opiniones y xenoinjerto crecimiento tumoral en
in vivo
. La sobreexpresión y silenciamiento de KIF14 también inhibe o mejora la migración de células del cáncer, la invasión y la adhesión a la matriz extracelular proteínas laminina y colágeno IV. Por otra parte, se han detectado las moléculas de adhesión cadherina 11 (CDH11) y la molécula de adhesión celular de melanoma (MCAM) como carga a KIF14. La sobreexpresión y silenciamiento de KIF14 mejoradas o reducidas el reclutamiento de CDH11 en la fracción de membrana, lo que sugiere que KIF14 podría actuar a través de moléculas de adhesión de reclutamiento a la membrana celular y la modulación de adhesivo celular, migratorio y propiedades invasivas. Por lo tanto, KIF14 podría inhibir el crecimiento tumoral y la metástasis del cáncer en adenocarcinomas de pulmón
Visto:. Hung P-F, Hong T-M, Hsu Y-C, Chen H-Y, Chang Y-L, Wu C-T, et al. (2013) La proteína KIF14 Motor inhibe el crecimiento tumoral y la metástasis del cáncer de adenocarcinoma de pulmón. PLoS ONE 8 (4): e61664. doi: 10.1371 /journal.pone.0061664
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Octubre, 2012; Aceptado: March 12, 2013; Publicado: 23 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Hung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por subvenciones del Consejo Nacional de Ciencia de la República de China (NSC98-2628-B-002-086-MY3, NSC100-2321-B-002-071, y NSC100-3112-B-006-005) y Nacional Universidad de Taiwán (NTU101R7601-2 y NTU102R7601-2). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El kinesin (KIF) superfamilia se compone de proteínas motoras que orgánulos de transporte, proteínas y mRNA en una adenosina-5'-trifosfato (ATP) - y de manera dependiente de microtúbulos [1], [2]. Existen más de 45 miembros de la superfamilia KIF, que se dividen en 13 subfamilias de acuerdo con su orientación, el dominio y la función [3]. KIF14, un miembro de la familia kinesin-3, contiene un motor y un dominio forkhead-asociado, y esta proteína juega un papel importante en la citocinesis y en la segregación, congression y la alineación de los cromosomas [4] - [6]. El agotamiento de KIF14 podría causar un retardo de tiempo en la transición de la metafase a la anafase-, inhibir la citocinesis y producir un estado binucleada [7], [8]. Otros estudios han demostrado que KIF14 podría promover la citocinesis eficiente a través de interacciones con citron quinasa (CIK) y el regulador de la proteína de la citocinesis 1 (PRC1) [7].
La citocinesis es la etapa final del ciclo celular en la que el dos células hijas completamente separados [9]. La evidencia creciente sugiere que la citocinesis aberrante podría generar células tetraploides inestables, dando lugar a aneuploidía, que finalmente se convierte en la carcinogénesis [9] - [11]. Muchos de los componentes que regulan la citocinesis se han identificado, y algunas moléculas, incluyendo KIFs, han sido claramente asociado con el cáncer. Por ejemplo, KIF2 y KIF15 han sido identificadas como antígenos tumorales en el cáncer de mama [12], [13]; KIF13A se sobreexpresa en algunos retinoblastomas [14]; KIF20A está regulado en el cáncer de páncreas [15]; KIF3 y KIF4 han sido identificados como genes supresores de tumores en el cáncer gástrico [16], [17]; y la expresión de KIF10 se reduce en el carcinoma hepatocelular [18]. Además, se ha informado de que algunos miembros de la familia, incluyendo KIF KIF3, KIF4 y KIF22, tienen papeles conflictivos en la tumorigénesis [16], [17], [19] - [23].
El cáncer de pulmón es la causa más común de muerte por cáncer, especialmente en Asia, y representa el 17% del total de muertes en todo el mundo con cáncer [24], [25]. Los estudios recientes se han centrado en el papel de las proteínas de quinesina, como KIF3, KIF5B y KIF14, en la progresión del cáncer de pulmón; sin embargo, los mecanismos detallados que subyacen a las funciones de estas proteínas siguen sin estar claros [16], [26] - [28]. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar el papel de kinesin motor proteínas en el adenocarcinoma de pulmón.
En este estudio, se evaluó el papel potencial de KIF14 en el adenocarcinoma de pulmón utilizando la pérdida de heterocigosidad (LOH) y la matriz comparativa hibridación genómica (CGH) analiza de 138 adenocarcinomas de pulmón en el cromosoma 1q, que es donde se encuentra KIF14. Además, también se examinó la expresión de la proteína de KIF14 en muestras de tejido de pacientes con adenocarcinoma de pulmón 122 utilizando tinción inmunohistoquímica. La expresión del ARNm y la proteína KIF14 se correlacionaron con las tasas de supervivencia global y la metástasis en estos pacientes. también Disecamos el mecanismo molecular de KIF14, que media la supresión de la invasión de células de cáncer, la migración y la adhesión. Estos resultados sugieren que KIF14 podría inhibir el crecimiento tumoral y la metástasis del cáncer de adenocarcinoma de pulmón.
Resultados
Expresión KIF14 en pacientes con cáncer de pulmón
Para evaluar el papel potencial de la quinesina en el pulmón adenocarcinoma, examinamos primero la frecuencia de LOH en los cromosomas utilizando marcadores de microsatélites, y observamos que LOH se produjo entre los marcadores D1S1660 (40,0% LOH y 86,7% de inestabilidad de microsatélites (MI)) y D1S213 (31,6% LOH y 60,5% MI), que son situado cerca de KIF14 en el cromosoma 1q (Figura 1A). Para confirmar estos resultados, se realizó alta densidad CGH array en una cohorte independiente de 138 adenocarcinomas de pulmón [29]. Los datos indicaron que casi el 25% (22,5% y 26,8%) la pérdida de las dos sondas de localización dentro de KIF14 y 5% (2,9% y 6,5%) de ganancia se produjo en los pacientes (Figura 1B y Tabla 1).
(a) la pérdida de heterocigosidad (LOH) y la inestabilidad de microsatélites (MI) analiza cerca de la ubicación de KIF14 en el adenocarcinoma de pulmón primario. El cromosoma 1 ideograma que muestra los marcadores de microsatélites en correspondencia sobre 1q de acuerdo con la base de datos de localización; Se indican el número de pacientes y el porcentaje. (B) Los perfiles de alteración del número de copias del cromosoma 1. La ubicación KIF14 se indica en el cromosoma 1q32.1. (C) El patrón de expresión de la proteína de KIF14 se examinó mediante inmunohistoquímica con anticuerpos anti-KIF14 en mucosa bronquial (panel izquierdo) normales y muestras de tumores primarios (media y panel derecho). aumento original × 200.
A continuación examinó la expresión de KIF14 en muestras de tejido y tejidos normales adyacentes de 122 adenocarcinomas de pulmón mediante inmunohistoquímica. La especificidad del anticuerpo KIF14 se confirmó mediante la competencia antígeno KIF14 usando inmunotransferencia e inmunohistoquímica (Figura S1), y las características clínicas de estos pacientes se resumen en la Tabla 2. Estos resultados mostraron que KIF14 se expresa fuertemente en las células epiteliales bronquiales normales (Figura 1C ). El análisis adicional indicó que 30,3% de los adenocarcinomas mostró KIF14 baja regulación en los tumores en comparación con las células epiteliales bronquiales en contrapartes normales adyacentes y que 18,0% de los adenocarcinomas mostró una expresión de KIF14 mayor que en la mucosa bronquial normal (Tabla 1). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que KIF14 podría tener una mayor pérdida (~ 30%) que la ganancia (3-6%) en los adenocarcinomas de pulmón.
baja expresión de KIF14 se asocia a peor supervivencia global en adenocarcinoma de pulmón los pacientes
Para investigar más a fondo si la expresión de KIF14 en el adenocarcinoma de pulmón se correlaciona con los resultados clínicos, los niveles de mRNA de KIF14 en muestras tumorales de pacientes con adenocarcinoma de pulmón 53 se determinaron usando el tiempo real de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa reacción en cadena. Las características clínicas de estos pacientes se resumen en la Tabla S1. Los pacientes con baja expresión de KIF14 exhibieron supervivencia global peor que aquellos con alta expresión de KIF14 (Figura 2A, P = 0,0158). El análisis multivariado de regresión de Cox de riesgos proporcionales indicó que la expresión de KIF14 (hazard ratio [HR] = 0,341, 95% intervalo de confianza [IC] = 0,179-0,652; p = 0,0011) y el estadio de la enfermedad (HR = 1.962 IC, 95% = 1,311-2,936 ; P = 0,0010) fueron factores independientes asociados con la supervivencia global de los pacientes con adenocarcinoma de pulmón (Tabla S2)
(a) la expresión del ARNm de baja KIF14 se asocia a peor supervivencia global en los pacientes con adenocarcinoma de pulmón.. Los niveles de ARNm de KIF14 se midieron utilizando cuantitativa en tiempo real RT-PCR de muestras de tumores primarios. Se utilizó el valor medio para dividir a los pacientes en bajo (línea roja) y alta (línea azul) grupos de expresión KIF14 (rango, P = 0,0158 log). expresión de la proteína (B) bajo KIF14 se asoció con la supervivencia global pobres en una cohorte independiente de pacientes con adenocarcinoma de pulmón. Los pacientes se dividieron en dos grupos de acuerdo con la inmunorreactividad de los anticuerpos KIF14. El valor de corte fue de 70% en las secciones del tumor que muestran inmunorreactividad con los anticuerpos. De Kaplan-Meier análisis se utiliza para estimar la supervivencia global en los pacientes con adenocarcinoma de pulmón según la expresión de KIF14 (log rank, P & lt; 0,0001). análisis (C) Porcentaje de el estado metastásico en grupos de alto y bajo de expresión de KIF14. Los pacientes de ambos grupos de alto y bajo de expresión de KIF14 se dividen además en base a la presencia de metástasis; y el número de cada subgrupo se muestran como un porcentaje mediante análisis estadístico (prueba de chi-cuadrado, P & lt; 0,0001). (D) La expresión de KIF14 en el adenocarcinoma de pulmón humano predijo la aparición de metástasis. curvas de supervivencia libre de metástasis de 122 pacientes con adenocarcinoma de pulmón estratificados por baja (línea roja) y (línea azul) la expresión de alto valor proteico KIF14 (log rank, P & lt; 0,0001) guía empresas
Para extender nuestro análisis a la proteína. los niveles de expresión, se utilizó la inmunohistoquímica para examinar la expresión de KIF14 en muestras de tumor de 122 pacientes con adenocarcinoma de pulmón en una cohorte independiente. De acuerdo con nuestros resultados previos, los pacientes con niveles bajos de expresión de KIF14 tenían peor supervivencia global de los pacientes con altos niveles de expresión de KIF14 (P & lt; 0,0001; Figura 2B). Los análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox multivariado reveló que los factores pronósticos independientes fueron KIF14 expresión (HR = 0,37; IC del 95% = 0,18 a 0,76; p = 0,0006) y el estadio de la enfermedad (HR = 5,38; IC del 95% = 2.82 a la 9.88; P & lt ;. 0,0001) (Tabla 3) guía empresas
KIF14 se correlacionó negativamente con metástasis en pacientes de adenocarcinoma de pulmón
además, investigó si los niveles de expresión de la proteína de KIF14 en las muestras de tumor se correlacionaron negativamente con la metástasis del cáncer en los pacientes. Los resultados de 122 adenocarcinomas de pulmón mostró que 29 de los 63 pacientes con baja expresión de la proteína KIF14 tenían metástasis del cáncer. Sin embargo, sólo 6 de los 59 pacientes con alta expresión de KIF14 desarrollaron metástasis del cáncer (Figura 2C, P & lt; 0,0001). La estimación de Kaplan-Meier de libre de metástasis-la supervivencia también mostró que los pacientes con baja expresión de KIF14 tenían una tasa de supervivencia libre de metástasis significativamente peor que aquellos con alta expresión de KIF14 (Figura 2D, P & lt; 0,0001). Estos resultados indican que KIF14 podría ser un supresor tumorigénico y metastásico en el adenocarcinoma de pulmón.
La sobreexpresión de KIF14 en células de adenocarcinoma de pulmón inhibió el crecimiento independiente de anclaje in vitro y la formación de tumores de xenoinjerto
in vivo
Nuestras observaciones apoyan la hipótesis de que KIF14 actúa como un supresor tumoral en el adenocarcinoma de pulmón. Para examinar esta hipótesis adicional, se evaluó primero la expresión de la proteína KIF14 endógeno en bajo invasiva CL1-0 y células de adenocarcinoma de pulmón CL1-5 de alto invasiva (Figura S2A). Hemos observado que la proteína de KIF14 en células CL1-0 fue mayor que en las células CL1-5. Para examinar los cambios en la progresión del cáncer de
in vitro
y
in vivo
[30], se establecieron líneas celulares que expresan KIF14 bandera de etiquetado estables de células CL1-5 y silenciada-KIF14 CL1- 0 células, y el patrón de expresión de la proteína se confirmó mediante inmunotransferencia (Figura 3A y 3B). En la detección de la tasa de proliferación de las células, se observó ninguna diferencia significativa entre los controles de vector de sólo y las líneas celulares de KIF14-overexpressing (Figura 3C), pero no se observó reducción de la proliferación en las células KIF14-silenciado en comparación con el control shLacZ (Figura 3D, P & lt; 0,0001). Basado en la evidencia que muestra que el crecimiento celular independiente de anclaje podrían estar asociadas con potencial tumorigénico [31], [32], se analizó aún más el crecimiento de las líneas celulares estables en agar blando. Los resultados indicaron que el número de colonias formadas se redujo cuando KIF14 se sobreexpresa en las células CL1-5 (Figura 3E) y aumenta cuando KIF14 fue silenciado en CL1-0 células (Figura 3F). Posteriormente, las líneas celulares estables se trasplantaron por vía subcutánea en ratones SCID para explorar el efecto de KIF14 sobre el crecimiento tumoral
in vivo
. La sobreexpresión de KIF14 redujo significativamente el crecimiento del tumor en comparación con los controles (Figura 3G, a la derecha; P = 0,0021). Las imágenes representativas de los ratones /por vectores y KIF14#2-inoculados CL1-5 se muestran (Figura 3G, izquierda).
(A) Las líneas celulares que expresan constitutivamente KIF14 se establecieron a través de la transfección de pCMV-7.1- 3-3 × Flag-KIF14 en células CL1-5. Las colonias individuales se seleccionaron usando geneticina, y la expresión de la proteína KIF14 se evaluó mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-FLAG; actina se utilizó como control interno. El asterisco y la punta de flecha indican la banda no específica y Bandera-KIF14, respectivamente. (B) la expresión de KIF14 fue derribado en células CL1-0 usando la infección lentiviral shRNA. Después de la selección con puromicina durante dos semanas, los patrones de expresión de proteína KIF14 se evaluaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-KIF14; actina se utilizó como control interno. (C y D) Efectos de la sobreexpresión KIF14 y el silenciamiento de la proliferación de células tumorales cultivadas. El número de células se calculó a los tiempos indicados después de la siembra. Las barras de error representan desviaciones estándar de la media. No se observaron diferencias significativas en las tasas de proliferación entre las diferentes líneas celulares mediante análisis ANOVA de una sola vía (C). (E y F) el crecimiento independiente del anclaje de líneas celulares que sobreexpresan KIF14-y -silencing fueron evaluados por la formación de colonias en agar blando. Las barras de error representan las desviaciones estándar de tres experimentos independientes realizados por triplicado. sobreexpresión reduce el crecimiento del tumor (G) KIF14. Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea en los flancos con CL1-5 /vector y CL1-5 /KIF14 células#2. Panel izquierdo: fotografías final del tumor a los 35 días después de la inyección subcutánea-. Panel derecho: El volumen medio del tumor a los 35 días después de la inyección subcutánea, se calculó, y los animales fueron sacrificados posteriormente. Las barras representan la media ± desviación estándar de seis ratones por grupo (ANOVA de una vía, p = 0,0021).
manipulación de los niveles de expresión alterados KIF14 la migración, invasión y adhesión de adenocarcinoma de pulmón Líneas Celulares
Debido a que la expresión de KIF14 se correlacionó negativamente con la metástasis en pacientes, el próximo investigó si KIF14 afectada la metástasis de las células cancerosas. Un ensayo de cicatrización de heridas se utilizó para detectar las capacidades de migración de las células que expresan KIF14. expresión KIF14 reduce la migración de células CL1-5, mientras que la caída de la expresión de proteína KIF14 en células CL1-0 aumento de la migración celular (todos P & lt; 0,05; Figura 4A y 4B, izquierda). Para confirmar los resultados obtenidos a partir de las células CL, se examinaron los niveles de expresión de KIF14 en otras líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón (Figura S2B) y sobreexpresa KIF14 en células A549 con baja proteína KIF14 endógeno y silenciados KIF14 en células H1299 con niveles relativos elevados de proteína KIF14. La expresión y la proliferación de proteína KIF14 tasas de estas células se muestran en la Figura S3. Se obtuvieron resultados similares usando líneas de células adicionales en comparación con las células CL (todos P & lt; 0,05; Figura 4A y 4B, derecha).
(A) células CL1-5 con células de sobreexpresión KIF14 y A549 permanentes transitoriamente infectadas con lentivirus codificación no etiquetado de larga duración KIF14 se analizaron para determinar la capacidad migratoria de células en un ensayo de cicatrización de heridas. Los datos muestran que el número de células migratorias, y los valores de p se calcularon en relación a los controles de vectores utilizando sólo Estudiante de
t-test
. ensayo de células CL1-0 y H1299 (B) de curación de heridas con silenciamiento KIF14. También se calculó el número de células migratorias. (C y D) la sobreexpresión KIF14 reduce la invasión de células. La capacidad de invasión de KIF14 estable o transitoriamente infectados y líneas de células silenciadas-KIF14 se midió usando un ensayo de cámaras de Boyden modificada. Las células invasoras se indican con tinción de yoduro de propidio y se cuantificaron (n = 3). la adhesión celular (E) KIF14 sobreexpresión mejorada. Una placa de 96 pocillos se recubrió con laminina y colágeno IV. Un total de 3 × 10
4 células se sembraron en una placa de 96 pocillos, se incubaron a 37 ° C durante 1 hora y la actividad se calculó utilizando adhesivo cristal violan la tinción. Alta absorbencia a 540 nm indicó la adhesión celular mejorada.
A continuación evaluó las propiedades invasivas de estas líneas celulares utilizando ensayos de cámara de Boyden modificadas. la sobreexpresión de KIF14 en CL1-5 y células A549 reducida invasividad de las células 11,6-64,9% en comparación con los controles de vector de sólo (P & lt; 0,05; Figura 4C). Por el contrario, la caída de la expresión de KIF14 endógeno en CL1-0 y células H1299 aumentaron invasión de células de 1,4 a 2,3 veces (p & lt; 0,05; Figura 4D).
En general, la adhesión celular es un mecanismo complejo implicado en una variedad de procesos, incluyendo la migración celular y la invasión [33]. Debido a que estos datos indican que la expresión de KIF14 podría afectar las capacidades migratorias e invasivas de líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón, se investigó más a fondo si la adhesión celular se vio afectada después de la modulación de KIF14. De acuerdo con nuestra hipótesis, los datos mostraron que la sobreexpresión de KIF14 aumento de la adhesión a la matriz extracelular de proteínas, laminina y colágeno IV, tanto en las células CL1-5 y A549; Por otra parte, silenciando KIF14 reduce la adherencia tanto en las células CL1-0 y H1299 (Figura 4E).
KIF14 podría regular la contratación de adhesivo molécula CDH11 a la membrana celular de adenocarcinoma de pulmón líneas celulares
Debido KIF14 inhibe la migración celular, invasión y adhesión
in vitro
y la metástasis del cáncer de
in vivo
, quisimos determinar si los cambios en la función motora en las células podrían conducir a cambios fisiológicos. Por lo tanto, hemos investigado potencialmente socios de KIF14 usando la base de datos de interacción de proteínas 9,0 cadena asociada (http://string.embl.de/) e identificó los dos conocidos proteínas asociadas, y PRC1 CIK [7], y dos proteínas adicionales, cadherina 11 (CDH11) y molécula de adhesión celular de melanoma (MCAM), que fueron potencialmente asociada con KIF14 (Figura S4). Debido CDH11 y MCAM son importantes moléculas de adhesión asociados con la tumorigénesis y metástasis [34], [35], la hipótesis de que KIF14 podría afectar a la adhesión celular y la migración a través de estas moléculas de carga. Para confirmar esta hipótesis, se analizó en primer lugar si KIF14 podría asociarse con CDH11 y MCAM utilizando co-inmunoprecipitación. Los resultados mostraron que el HA-etiquetados CDH11 y MCAM asocian con proteínas KIF14 marcado con FLAG (Figura 5A). inmunoprecipitación endógena también confirmó las asociaciones entre KIF14 y CDH11
in vivo gratis (Figura 5B). Las distribuciones de KIF14 y proteínas CDH11 o MCAM se examinaron en las células H1299 utilizando la tinción de inmunofluorescencia. Los resultados mostraron que las proteínas CDH11 y MCAM pueden co-localizar en compartimentos comunes con la proteína KIF14, y la expresión de CDH11 y MCAM se observó principalmente en la periferia de la célula cuando se sobreexpresa KIF14 (Figura 5C). Como KIF14 es una proteína de motor que participa en el transporte de moléculas, exploramos además si la expresión de KIF14 podría regular la localización de CDH11. Se aislaron las proteínas de la fracción de membrana y analizamos la expresión de CDH11 partir de líneas celulares que sobreexpresan KIF14 y silenciados-KIF14. Las cantidades de HA-CDH11 en la fracción de membrana se cuantificaron a través de la normalización con la cantidad en lisados de células totales, y los resultados mostraron que la sobreexpresión de KIF14 aumentó la expresión de CDH11 en la fracción de membrana en comparación con las células control (Figura 5B, a la izquierda ). En contraste, el agotamiento de KIF14 expresión reducida CDH11 en la superficie celular en comparación con los controles no silenciado (Figura 5B, derecha). También se examinó la distribución de CDH11 endógena en CL1-5 /vector, CL1-5 /KIF14#2, CL1-0 /shLacZ y CL1-0 /shKIF14 células, y los resultados fueron similares a los datos anteriores (Figura S5).
(A) KIF14 asociado con CDH11 y MCAM. El lisado de las células HEK293T transfectadas con los plásmidos indicados se utilizó en ensayos de inmunoprecipitación exógenos. La inmunotransferencia se realizó con los anticuerpos indicados. Actina se utilizó como control interno. (B) El lisado de las células H460 se utilizó en ensayos de inmunoprecipitación endógenas. La inmunotransferencia se realizó con los anticuerpos indicados. (C) La distribución de CDH11 y MCAM cambiaron con la sobre-expresión de KIF14. células H1299 fueron co-transfectadas con HA-CDH11 o HA-MCAM y GFP-KIF14, se fijaron y se hibridaron usando anticuerpos anti-HA. La señal se capturó usando un microscopio confocal (ampliación original, 1.000 ×). (D) células HEK293T fueron co-transfectadas con HA-CDH11 y Flag-KIF14 o siKIF14 y, posteriormente, se aisló la fracción de membrana. La proteína en la fracción de membrana celular total y se analizó el lisado a través de inmunotransferencia. Las cantidades de HA-CDH11 en la fracción de membrana se cuantificaron a través de la normalización con la cantidad en el total de lisados celulares. Hsp90 se utilizó como un marcador citosol.
Discusión
Estos resultados demostraron que las proteínas KIF14 motor actúa como un tumor y supresor de la metástasis en el adenocarcinoma de pulmón. Se observó una mayor pérdida de ganancia de cerca en el cromosoma 1q32 KIF14 (Figura 1) y se encontró que los pacientes con baja expresión de KIF14 exhibieron supervivencia global y libre de metástasis peor en comparación con los pacientes que expresan altos niveles de KIF14 (Figura 2). La sobreexpresión de KIF14 en células de cáncer de pulmón, inhibió el crecimiento independiente de anclaje
in vitro Opiniones y xenoinjerto formación de tumores en
in vivo gratis (Figura 3). Además, la modulación de la expresión de KIF14 inhibe la migración celular, la invasión y la adherencia a través de la asociación con y el aumento de la expresión en la membrana de la proteína de carga, CDH11 (Figura 4 y 5). Por lo tanto, KIF14 podría ser un objetivo potencial para el tratamiento del adenocarcinoma de pulmón.
Resultados
cromosoma mala segregación en la citocinesis aberrante y aneuploidía. se evita este fenómeno en las células normales a través de la detención del ciclo celular y la apoptosis; Sin embargo, las células tumorales muestran un aumento de las tasas de aneuploidía, que podrían estar asociados con pobres resultados clínicos [36] - [41]. funciones KIF14 en la segregación cromosómica y la citocinesis, y su agotamiento podrían dar lugar a una binuclear o el estado multi-nucleares [4], [5], [7], [8]. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la aneuploidía se desarrolla en la carcinogénesis [9] - [11], [42]. En este estudio, la sobreexpresión o el silenciamiento de KIF14 en células reducido o incrementado, respectivamente, el crecimiento independiente de anclaje
in vitro
, y la sobreexpresión KIF14 reducción del crecimiento del tumor
in vivo gratis (Figura 3). Estos resultados son consistentes con los de un estudio previo en el que la expresión silenciada de KIF14 en células de cáncer de páncreas produjo un aumento de la supervivencia independiente del anclaje [43]. Aparte de KIF14, muchos otros reguladores citocinesis también se han reportado como genes supresores de tumores, incluyendo KIF1A, KIF1B, KIF3, KIF4, KIF10, Von Hippel-Lindau proteína del síndrome (pVHL) y BRCA2 [16] - [18], [44] - [47]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que una deficiencia KIF14 podría promover la aneuploidía, resultando en la formación de tumores, y que KIF14 podría actuar como un supresor de tumores en el cáncer de pulmón.
Progresión
cáncer es un proceso complejo que implica el crecimiento celular, la membrana basal la degradación, la migración celular, invasión, adhesión y metástasis [48], [49]. Los resultados obtenidos en el presente estudio mostraron que KIF14 no sólo estaba involucrado en la tumorigénesis, pero también participó en la adhesión celular, la migración y la invasión (Figura 3 y 4). Inmunoquímica indicó que los niveles de expresión de KIF14 se correlacionaron negativamente con la metástasis del cáncer en los pacientes (Figura 2C y 2D). En líneas celulares CL, los niveles de proteína KIF14 se asociaron inversamente con la capacidad invasora de células (Figura S2A). Estas observaciones fueron similares a las de un informe anterior en el que la expresión de KIF14 se correlacionó negativamente con Matrigel y la invasión del nervio en el cáncer de páncreas [43]. Por lo tanto, KIF14 podría actuar como un supresor de metástasis en el adenocarcinoma de pulmón.
En particular, los resultados de la
in vitro
ensayos in fueron ligeramente discordante. Los datos obtenidos en el presente estudio sugieren que KIF14 silenciamiento reduce la proliferación celular (Figura 3), lo que podría reflejar retardos de fase M y fracasos citocinesis. Sin embargo, la sobreexpresión de KIF14 no afectó significativamente la proliferación celular en comparación con el control. Además, examinó la distribución de KIF14 y los fenómenos de células en cada fase, y los datos indicaron que ningún defecto específico ocurrió con KIF14 sobreexpresión (datos no publicados). Por lo tanto, el silenciamiento o sobreexpresión de KIF14 reducidos o no afectar a la proliferación celular, pero aumentar o disminuir la formación de colonias; tales efectos se consideran como habilidades de células transformar. La sobreexpresión de KIF14 (KIF14 2 #) en las células CL1-5 reduce fuertemente la formación de colonias, la migración celular y la invasión, y la ligera expresión de KIF14 (KIF14#1) la formación de colonias ligeramente reducida y la migración celular y la invasión fuertemente reducida (Figura 3 y 4). Estos resultados sugieren que la proteína de KIF14 afecta a la transformación celular y la invasión a diferentes grados. Proponemos que el ligero aumento de la expresión de la proteína KIF14 en CL1-5 /KIF14#1 en las células estables también promueve la migración celular dramática mediante la inhibición del transporte de carga de varias proteínas importantes que intervienen en la migración celular y la invasión.
A pesar de que es KIF14 una proteína motor importante que participa en la citocinesis a través de interacciones con PRC1 y citron quinasa, el papel de KIF14 en otras funciones aún no está claro [7]. Los resultados obtenidos en el presente estudio mostraron que KIF14 podría regular la migración celular y la adhesión a través de asociaciones con CDH11 y MCAM; este aumento en la localización de la membrana de CDH11 en líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón es un hallazgo novedoso con respecto a la función de KIF14 (Figura 5). Estos resultados son similares a los de un informe en el que KIF13 participó en el transporte del receptor de manosa-6-fosfato desde el citosol a la membrana plasmática [50]. Estos datos indican que KIFs podrían regular diferentes funciones celulares cambiando la localización de diferentes proteínas de carga.
Estos resultados apoyan la hipótesis de que KIF14 actúa como un supresor de tumores y el inhibidor de la metástasis en el adenocarcinoma de pulmón. El papel de KIF14 en la progresión del cáncer se ha discutido en los últimos años. Corson et al., Kim et al. y Wang et al. mostró que KIF14 es altamente expresado en retinoblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, carcinoma hepatocelular, glioma y algunos tumores de pulmón [28], [51] - [55]. El uso de análisis de CGH array, Corson et al. observado un aumento de 20% en los tumores de pulmón y bronquios en una amplia zona del cromosoma 1q31-1q32 [51]; Sin embargo, en el presente estudio, se realizaron análisis de CGH array y observó una pérdida del 25% (22,5% y 26,8%) de las dos sondas de localización dentro de KIF14 y una ganancia de 5% (2,9% y 6,5%) en los adenocarcinomas de pulmón. Para explorar esta discrepancia, que también examinó la expresión de mRNA de KIF14 en nuestra cohorte del estudio utilizando los cebadores y la sonda de Corson y otros estudios de.. Similar a los resultados mostrados en la Figura 1B, los pacientes con baja expresión de KIF14 exhibieron peor supervivencia global en comparación con los pacientes con alta expresión de KIF14. Corson et al. también silenciado KIF14 usando siRNA en líneas celulares de tumor de pulmón e indicó que KIF14 silenciar la proliferación celular reducida y la formación de colonias [28]. En el presente estudio, se silenció a la expresión de KIF14 mediante la entrega lentiviral de shKIF14 y obtuvieron resultados similares para la proliferación, pero los resultados opuestos con respecto a la formación de colonias. Curiosamente, no queda claro por qué se obtuvieron resultados diferentes para el mismo gen; Sin embargo, hay varias posibles explicaciones para estos fenómenos. 1. Diferencia en KIF14 etiquetas de proteínas: Theriault y col. o reutilizada EGFP C-terminal y KIF14 con etiqueta myc en ensayos de proliferación y formación de colonias, y etiquetada EGFP-KIF14 mostraron efectos más suaves que KIF14 marcado con Myc [54]. Por lo tanto, se generaron construcciones de tipo salvaje KIF14 no etiquetados y examinamos los efectos sobre la invasión de células; los resultados fueron similares a los de KIF14 Bandera de etiquetado (Figura 4C). También generó C-terminal de KIF14 Bandera de etiquetado para examinar la migración celular, y los datos fueron similares a los obtenidos con N-terminal Bandera de etiquetado y no etiquetada KIF14 (datos no muestran). 2. Las diferencias étnicas: un estudio reciente indica explícitamente que la ocurrencia, causa, estado de mutación del gen, la supervivencia, el pronóstico y el tratamiento del cáncer de pulmón eran diferentes en Asia y los EE.UU. [56]. 3. Un gen o una proteína podrían desempeñar papeles duales o múltiples en la función fisiológica. Por ejemplo, factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) actúa ya sea como un supresor de tumores o un tumor de promotor en diferentes condiciones durante la progresión del cáncer [57], [58], y transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) tiene