Extracto
El cáncer de próstata (CaP) es la segunda causa de muerte por cáncer en los EE.UU.. La muerte por CaP se debe principalmente a la metástasis. MAP quinasa quinasa 4 (MAP2K4) se sobreexpresa en lesiones invasivas de CaP en los seres humanos, y puede ser inhibida por terapias de moléculas pequeñas que demuestran actividad favorable en los estudios de fase II. Sin embargo, el papel de MAP2K4 en la regulación del comportamiento metastásico es controvertido y desconocido. Para investigar, hemos diseñado líneas celulares humanas que sobreexpresan CaP ya sea de tipo salvaje o MAP2K4 activa constitutiva. implantación ortotópico en ratones demostró MAP2K4 aumenta la formación de metástasis a distancia. Constitutiva MAP2K4 activo, aunque no de tipo salvaje, aumenta el tamaño del tumor y las células tumorales circulantes en la sangre y la médula ósea. Complementaria
in vitro
estudios establecen la sobreexpresión MAP2K4 estable promueve la invasión celular, pero no afecta el crecimiento celular o la migración. MAP2K4 sobreexpresión aumenta la expresión de la proteína de choque térmico 27 (HSP27) y la proteína proteasa de producción, con el efecto más grande sobre las metaloproteinasas de matriz 2 (MMP-2), ambos
in vitro
y en muestras tumorales de ratón. Además, los aumentos mediados por MAP2K4 en la invasión de células dependen de la proteína de choque térmico 27 (HSP27) y MMP-2, pero no sobre inmediata objetivos de abajo, MAPK p38 de MAP2K4 o JNK. Demostramos que MAP2K4 aumenta la metástasis PCa humana, y prolongado sobre la expresión induce cambios a largo plazo en vías de señalización celular que conducen a la independencia de p38 MAPK y JNK señalización. Estos resultados proporcionan una explicación mecanicista de los estudios en humanos que vinculan los aumentos de HSP27 y MMP-2 a la progresión de la enfermedad metastásica. MAP2K4 se valida como una importante diana terapéutica para inhibir la metástasis PCa humana
Visto:. Pavese JM, Ogden IM, Voll EA, Huang X, Xu L, Jovanovic B, et al. (2014) La proteína activada por mitógenos quinasa quinasa 4 (MAP2K4) promueve la metástasis del cáncer de próstata humano. PLoS ONE 9 (7): e102289. doi: 10.1371 /journal.pone.0102289
Editor: Chih-Hsin Tang, de la Universidad Médica de China, Taiwán
Recibido: 1 de mayo de 2013; Aceptado: 17 Junio 2014; Publicado: 14 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Pavese et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud (NIH) de RCB, CA122985 y próstata SPORE CA90386, y JMP, NIH T32 AG000260 "Formación descubrimiento de nuevos fármacos en los trastornos relacionados con la edad", y por el Walter S. y Lucienne Driskill Graduados programa de Ciencias de la vida de la Universidad Northwestern. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más comúnmente diagnosticado en los Estados Unidos los hombres, y la segunda forma más común de muerte por cáncer [1]. Mientras que más del 90% de los individuos con CaP localizado no va a morir de su enfermedad, los pacientes con enfermedad metastásica tienen un diagnóstico terminal y la gran mayoría morirán de CaP [2]. La comprensión de cómo se regula la diseminación metastásica del CP humano es de importancia biológica fundamental. Este conocimiento nos permitirá identificar a los pacientes en situación de riesgo, y por lo tanto en la necesidad de la intervención, y proporcionará la base para el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas.
Activada por mitógeno
proteína quinasa quinasa 4 (MAP2K4, también conocido como MKK4, MEK4, o SEK1) es una proteína quinasa de especificidad dual que fosforila la serina y treonina, así como residuos de tirosina. MAP2K4 es un miembro de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) vía de señalización y por lo general activa dos objetivos de abajo, p38 mitogen-activated proteína quinasa (MAPK p38) y c-Jun N-terminal quinasa (JNK) [3]. El papel de MAP2K4 en la progresión del cáncer de PCa humana y el desarrollo de metástasis, en particular, es motivo de controversia. MAP2K4 se encuentra en 17p11.2 segmento cromosómico, que puede perderse a una velocidad de aproximadamente 7 a 10% en cánceres epiteliales humanos, en particular los cánceres de ovario y de mama [4], [5] Por esta razón, se supuso inicialmente para ser un supresor de tumores. En un modelo de rata de CaP, utilizando células que carecen de un segmento cromosómico que contiene MAP2K4, restauración específica de proteína MAP2K4 reduce CaP metástasis en el pulmón después de la inyección flanco de estas células [6]. En ese modelo, el aumento de MAP2K4 crecimiento también retardada de células metastásicas que llegan a los pulmones, probablemente debido a G1 detención del ciclo celular [7].
Sin embargo, otros estudios indican que MAP2K4 imparte un fenotipo pro-metastásico, y el apoyo la noción de que aumentaría la metástasis. MAP2K4 activa MAPK p38, que impulsa muchos pasos de la cascada metastásica, incluyendo transición epitelial a mesenquimal (EMT), la invasión celular y la colonización metastásica (revisado en [8]). expresión MAP2K4 se aumenta en alto grado prostática neoplasia intraepitelial lesiones (HGPIN) tanto en el modelo TRAMP basado en murino de CaP espontánea, así como en muestras humanas [9]. Además, la expresión MAP2K4 se incrementa a principios de invasiva, es decir, CaP, las lesiones en los seres humanos, y aumento de la expresión MAP2K4 se correlaciona significativamente con un mayor estadio patológico [9]. Curiosamente, en estos y otros estudios, los niveles de MAP2K4 A continuación, se disminuyó en la etapa metástasis tarde, lo que indica que el aumento MAP2K4 es crítico para los primeros pasos de la cascada metastásica [10]. Esta influencia sobre los primeros pasos se confirma en
in vitro
estudios. El uso de varias líneas normales de la próstata y el cáncer de humanos diferentes de células y la expresión transitoria de ingeniería MAP2K4, nuestro grupo demostró que MAP2K4 aumenta la invasión celular, una indicación fundamental de la progresión metastásica
in vitro
[11]. También se identificaron MAP2K4 como un importante objetivo terapéutico de los inhibidores de compuestos pequeños. Específicamente, hemos demostrado que MAP2K4 era el objetivo terapéutico del compuesto pequeño, 4 ', 5,7-trihydroxyisoflavone (genisteína), por sus efectos sobre la inhibición de la invasión [11], [12], y que la genisteína inhibe la metástasis PCa humana en una modelo murino ortotópico [13]. A través de una serie de estudios relacionados, hemos identificado la vía, factor de crecimiento transformante (TGF) β → MAP2K4 → proteína p38 MAPK → choque térmico 27 (HSP27) → matriz de tipo metaloproteinasa 2 (MMP-2) → invasión de células CaP humana, y que se inhibe por la genisteína [11] - [16]. Se demostró además que la administración genisteína prospectivo para los seres humanos con CaP localizado disminuye la expresión de MMP-2 en el tejido de la próstata [11]. Con
in vivo en modelos animales, la expresión alterada MAP2K4 puede alterar la metástasis en otros cánceres epiteliales humanas. En particular, otros grupos han mostrado MAP2K4 disminuye el crecimiento del tumor metastásico caída en modelos de ratón de cáncer de mama y de páncreas [17], [18].
Dada la expresión alterada de MAP2K4 y relevancia pronóstica en los seres humanos, su
in vitro
efectos sobre células de la próstata humanos, y variadas respuestas en ratas y líneas celulares de cáncer epiteliales humanas, es importante para determinar específicamente el papel de MAP2K4 en la regulación del comportamiento metastásico de PCa humana. Aunque MAP2K4 es un objetivo terapéutico de la genisteína, la genisteína ejerce muchos efectos diferentes. Por lo tanto a pesar de la inhibición de la metástasis PCa humana de la genisteína, el papel de MAP2K4 en la regulación de la formación de metástasis no puede determinarse a partir de estos hallazgos. La incertidumbre sobre el papel de MAP2K4 en la regulación de la metástasis del cáncer de próstata humano se incrementa aún más por los estudios de la mayoría de los diferentes tipos de cáncer que apoyan ya sea un supresor de la metástasis [6], [7], [19] - [21], o la función estimuladora [9], [11], [17], [18]. Es importante destacar que ninguno ha examinado el papel de MAP2K4 en la regulación del comportamiento metastásico de PCa humana.
En el presente estudio, se demuestran varios hallazgos novedosos. En primer lugar, MAP2K4 aumentó la metástasis PCa humana. MAP2K4 aumentó el crecimiento del tumor
in vivo
, pero no
in vitro
. Bajo la presión de expresión crónica, que emula la situación clínica, MAP2K4 llevó a un cableado de vías de señalización celular. Esto dio lugar a una derivación de las proteínas de señalización corriente abajo inmediatos, p38 MAPK y JNK. Se identificó un único mecanismo de compensación mediante el cual MAP2K4 llevó a una regulación en la expresión de la proteína total HSP27. Esto a su vez dio lugar a niveles absolutos más altos de HSP27 fosforilada, y el aumento de aguas abajo de MMP-2. El fenotipo metastásico MAP2K4 impulsado ha demostrado ser dependiente de HSP27 y su efector aguas abajo, MMP-2. Estos hallazgos demuestran que MAP2K4 es un importante motor de la metástasis PCa humana, y por lo tanto validarlo como una diana terapéutica para inhibir la metástasis del CP. También proporcionan una explicación mecanicista de los estudios clínicos que vinculan los aumentos en MAP2K4, HSP27 y MMP-2 expresión para el futuro desarrollo de metástasis.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
todos los estudios con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Northwestern (PHS Aseguramiento#A3283-01). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con isoflurano y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Cultivo de células y transfección
células PC3-M y LNCaP se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con 2 mM de L -glutamine, tampón HEPES 10 mM, 50units /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina y 10% de suero bovino fetal (Life Technologies) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de dióxido de carbono 5%. 1542CPTX células se mantuvieron en medios de queratinocitos SFM suplementado con 2 mM L-glutamina, tampón HEPES 10 mM, 50units /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina, 10% de suero bovino fetal, 5 ng /ml de EGF humano recombinante, 50 mg /ml Extracto de pituitaria bovina (Life Technologies) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de dióxido de carbono al 5%.
MAP2K4 células transfectadas estables fueron creados mediante la transfección de PC3-M, LNCaP, o 1542CPTX células, cuyo origen se ha descrito anteriormente [22], con el tránsito LT1 reactivo de transfección (Mirus Bio LLC), y el plásmido de ADN según las instrucciones del fabricante. Las células fueron cultivadas bajo condiciones de selección con G418, las colonias individuales recogidas y ampliadas, como se describe anteriormente por nosotros [23]. En los experimentos indicados, las líneas celulares clonales individuales resultantes se transfectaron adicionalmente, como anteriormente, con plásmido de expresión de GFP, seleccionado en condiciones de crecimiento blasticidina, y después purificados utilizando células estéril de clasificación basado en el estado de GFP. Las líneas celulares se autentican según los métodos descritos en la American Type Culture Collection (ATCC) Boletín Técnico N ° 8, teléfonos Recomendaciones prueba de verificación de la línea [24]. En concreto, las células de paso bajo (es decir, & lt; 15 pasajes) fueron utilizados congelado las existencias y se repone después de 20 pasajes, las células se sometieron a un examen microscópico de rutina para confirmar uniforme y arquitectura celular estándar y no hay infección microbiana, y se ensayaron las células y resultaron negativos para el infección por micoplasma.
Para desmontables experimentos, Dharmacon EN-Targetplus SmartPool siRNA dirigidos MAP2K4 (L-003574-00-0005), HSP27 (L-005269-00-0005), MMP-2 (L-005959- 00 a 0005), o no director siRNA (D-001810-10-05) se transfectó en las células usando Dharmafect Duo (T-2010, todos de Thermo Scientific), junto con pCMV-β-galactosidasa (Agilent Technologies), y utilizado después de 48 horas, como se ha descrito por nosotros [11]
Los reactivos y plásmidos
Estuvieron comprado: anticuerpos., SEK1 /MKK4 (# 9152), fosfo-p38 MAPK (T180 /Y182) (# 4631), p38 MAPK (# 9212), fosfo-SAPK /JNK (T183 /Y185) (# 4668), SAPK /JNK (# 9258), fosfo-HSP27 (# 2401), HSP27 (# 2402) y GAPDH (# 2118), todos de Cell Signaling Technology, y peroxidasa de rábano conjugada anti-ratón y anti-conejo, de GE Healthcare Biosciences; plásmidos, de tipo salvaje y MAP2K4 activa constitutiva (# 14615 y#14813; Addgene) y GFP (colores vivos pcDNA 6.2 /N-EmGFP-GW /TOPO, Invitrogen); inhibidores químicos, inhibidor de p38 MAPK, SB203580 (Sigma-Aldrich) y control negativo asociado, SB202474, y JNK Inhibitor II (SP600125), y control negativo JNK Inhibitor II (N
1-metil-1,9-pyrazoloanthrone), todo lo de Merck Millipore.
Modelo murino de próstata humano metástasis del cáncer
Las células se implantan y metástasis a distancia cuantificaron como se ha descrito previamente por nosotros, con modificaciones [13], [25]. En pocas palabras, 2,5 × 10
5 células fueron implantadas en la próstata ventral de edad de sexo masculino ratones Balb 6-8 semanas /c atímicos, perro chino alimentado Harlan Teklad 2016S y agua
ad libitum
, y alojado en una barrera facilidad con ciclos de 12 horas de luz /oscuridad. Después de 6 semanas, el tejido tumoral se congeló rápidamente, los pulmones se fijaron con formalina /embebidos en parafina, y la sangre y la médula ósea se cultivaron en medio RPMI 1640 completo con G418 durante 10 días, y la presencia de CTC grabado.
Con 45 micrones paso-secciones, las secciones de tejido de pulmón 4 micras adyacentes se inmunotiñeron para GFP y con hematoxilina y eosina (H & amp; e). Las metástasis se calificaron, de una manera ciega, como grupos de células positivas GFP ≥5.
Cell Invasion Ensayos
invasión celular se midió como se describe por nosotros, con modificaciones [26]. Después de la adición de 1 x 10
5 células, en RPMI 1640 con 0,1% de BSA, a BD BioCoat Factor de Crecimiento Reducido cámaras de Matrigel con 8 micras membranas, células invadidas por 24 horas hacia la cámara inferior, que contiene suero libre de NIH 3T3 medios acondicionados . Los ensayos se llevaron a cabo al menos 3 veces por separado, cada uno en réplicas de N = 3. En algunos experimentos, las células fueron tratadas con 10 mM del inhibidor de 48 horas antes de, y durante la invasión.
células invasoras, es decir, en el membrana inferior, se fijaron metanol, violeta cristal manchada, y la imagen y contó con microscopía de luz. En los pozos paralelos, las células de la membrana superior no se quitaron, lo que permite la confirmación de igual número de células totales cargados. Para los experimentos de siRNA, las células se tiñeron utilizando el
In Situ
Staining Kit β-galactosidasa (Agilent Technologies), seguido de formación de imágenes y contando invadido y no invadida β-gal células positivas por pocillo
Ensayos de migración celular
migración celular se midió como se describe por nosotros, con modificaciones [26]. Cada BD Falcon así, con 8 micras membranas, se cargó con 2,5 × 10
4 células, y se deja migrar durante 8 horas hacia el medio acondicionado en la cámara inferior. Las células se tiñeron con violeta de cristal, como arriba. Los ensayos se llevaron a cabo 3 veces separados, cada uno en réplicas de N = 3.
cuantitativa de la transcriptasa inversa Polymerase Chain Reaction
reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (QRT /PCR) se realizó como se describe por nosotros [27]. Brevemente, el ARN se aisló con RNeasy Mini Kit (Qiagen) para las células y con Trizol (Invitrogen), seguido de RNeasy Mini Kit de purificación para el tejido de tumor, el ADNc sintetizado utilizando TaqMan transcripción reversa Reactivos y qPCR realizó usando TaqMan PCR Universal Master Mix y cebador pares de sondas en un sistema de PCR en tiempo real ABI 7500 (todos de Life Technologies). sondas de cebadores fueron: GAPDH (Hs99999905_m1), MMP-2 (HS00234422_m1), MMP-9 (Hs00234579_m1), MMP-10 (Hs00233987_m1), MMP-13 (Hs00233992_m1). se realizaron al menos dos ensayos separados, cada uno en repeticiones de N = 2, los ciclos de umbral medias resultantes se normalizaron a GAPDH, y la expresión génica relativa calculada por la 2
-ΔΔCt método [28].
Cell ensayo de crecimiento
se realizaron cinco ensayos de crecimiento celular días como se ha descrito por nosotros [23]. En pocas palabras, después de cinco días de crecimiento exponencial no confluente en placas de 96 pocillos, dimethylthiazoldiphenytetrazolium (MTT) se añadió, y la DO
540 determina. Los ensayos se repitieron tres veces, cada una de las repeticiones de N = 3.
Crecimiento en agar blando Ensayo
En un formato de placa de 6 así, 1 × 10
4 células /0,5 ml 0,3% ADN agar base de grado (Sigma Aldrich) se estratificó sobre 1 ml de 0,5% de agar, elaborados con y finalmente cubierto con 0,5 ml de RPMI 1640 medio de cultivo celular. Después de 14 días, las colonias se tiñeron cristal violeta y contados bajo el microscopio óptico. Los ensayos se llevaron a cabo tres veces, cada una de las repeticiones de N = 2.
transferencias de Western
Las transferencias Western se realizaron como se ha descrito previamente por nosotros [15]. Las concentraciones de anticuerpos fueron las instrucciones del fabricante.
El análisis estadístico
Los grupos se consideraron estadísticamente significativas si la prueba t p-valor del Student bilateral fue ≤0.05.
Resultados
Aumenta Map2k4 humano cáncer de próstata Metástasis
Hemos diseñado la expresión estable de tipo salvaje MAP2K4 (WT-MAP2K4), MAP2K4 constitutiva activa (CA-MAP2K4), o el vector vacío, para los controles (VC), en células PC3-M. El constructo de CA-MAP2K4 tiene mutaciones puntuales Ser220Glu y Thr224Glu en su motivo de activación [29]. Según se determinó mediante Western blot, la figura 1A, CA-MAP2K4 y MAP2K4 WT-líneas de células expresan MAP2K4 2,9 y 4,3 veces más altos en promedio, respectivamente, en comparación con la media de las líneas de células VC. Cada CA-individuo o línea celular WT-MAP2K4 expresa niveles ≥2.6 veces mayores. Estos resultados demuestran que es posible diseñar líneas celulares que sobreexpresan MAP2K4.
A) la expresión de proteínas MAP2K4 en líneas celulares variante MAP2K4. La expresión de la proteína se midió en MAP2K4 tipo salvaje, WT1, WT2, y constitutivo activo, CA1, CA2, CA3, MAP2K4 a través de líneas celulares que expresan, y el control de vectores, VC1, VC2, líneas celulares por transferencia Western. Una transferencia de Western representativa se representa, con la cuantificación de los niveles de MAP2K4 /GAPDH, normalizados a las células VC1, que se muestran por encima de cada carril. B) La invasión de líneas celulares variante MAP2K4. Se realizaron Boyden cámara de Matrigel ensayos de invasión de células, como se describe en Métodos. Los datos son de 5 experimentos independientes, cada uno en réplicas de N = 3. Los datos del tipo salvaje respectivo, las líneas celulares activas y de control de vectores constitutivos se combinaron para dar un promedio de lectura a las células WT-MAP2K4, MAP2K4 y CA-VC, respectivamente . Los datos se expresan como la media ± SEM porcentaje de células VC. C-E) El efecto de la expresión MAP2K4 sobre el crecimiento y propagación del tumor metastásico. Un número igual de ratones fueron implantados con células de forma ortotópica o VC1 VC2 (que forman la cohorte VC), o células WT1 ET2 (WT cohortes), o con CA1, CA2 y CA3 (CA células de cohortes). En (C) el número resultante de metástasis a distancia se expresa como la media ± SEM porcentaje de ratones VC, de (E) se representa el número de ratones en vías de desarrollo las células tumorales circulantes, y, en (F) el volumen del tumor se representa gráficamente como la media ± SEM porcentaje de ratones VC. Una imagen representativa de una metástasis distinta se muestra en (D). * Indica p = 0.05 entre VC y un grupo experimental.
Para evaluar la relevancia funcional de MAP2K4 sobreexpresión, se evaluó la capacidad de las líneas de células para invadir en un ensayo de cámara de Boyden matrigel, la figura 1B. La sobreexpresión de MAP2K4 aumentó significativamente la invasión a una media de 328% para líneas de células WT-MAP2K4 y a 490% para las líneas celulares de CA-MAP2K4, en comparación con líneas de células VC. Para las líneas de células individuales, es decir, dos de dos WT-MAP2K4 y tres de tres CA-MAP2K4, los niveles de invasión fueron estadísticamente significativos, en comparación con células de control (datos no mostrados). En paralelo con la ingeniería que sobreexpresa MAP2K4 líneas celulares, también diseñado una serie de líneas celulares estables Map2k4 desmontables utilizando dos corta horquilla shRNA vectores que expresan diferentes, y se confirmó la precipitación era específico para MAP2K4 (datos no mostrados). Sin embargo, al probar la función de estas líneas celulares en ensayos de invasión, no se observó un fenotipo consistente. En concreto, la mitad de las líneas celulares clonales mostraron una disminución de la invasión, mientras que la mitad no mostró ningún cambio. Este hallazgo es congruente con un nivel de umbral de expresión necesarios para los efectos de MAP2K4 sobre la regulación de la invasión. Debido a la falta de fenotipo compatible con desmontables de MAP2K4, hemos optado por no continuar esta labor. Por el contrario, con la sobreexpresión MAP2K4 nuestros resultados demuestran claramente un fenotipo consistente de aumento de la invasión y son coherentes con las observaciones en seres humanos, en los que el aumento de expresión MAP2K4 se produce en las lesiones invasivas en la próstata.
Para determinar si el aumento de expresión MAP2K4 aumenta metastásico potencial, se analizó el efecto de MAP2K4 sobre el crecimiento del tumor y la formación de metástasis
in vivo
utilizando un modelo murino ortotópico de metástasis PCa humana desarrollada específicamente por nosotros para cuantificar estos parámetros [13], [25]. Este modelo es sensible a agentes terapéuticos anti-motilidad así como a alteraciones en la expresión de genes que regulan la progresión metastásica. En este modelo, las células de CaP humanos se implantan directamente en la próstata, lo que permite la medición del tamaño del tumor primario, células de CaP que entran en el torrente sanguíneo como en tránsito células tumorales (CTC), células de CaP que circula en la médula ósea, y de pulmón distante metástasis. La metástasis a los pulmones es una característica variable principal de este modelo, lo que permite la cuantificación exacta de los depósitos metastásicos individuales, y por lo tanto una medida exacta de la capacidad de las células primarias de metástasis fuera de su órgano de origen, emulando la situación en los seres humanos.
tres cohortes de los ratones fueron implantados con células VC (donde los números iguales de ratones fueron implantados con células ya sea VC1 o VC2), las células WT-MAP2K4 (igual número implantados con células WT1 o ET2), o con células CA-MAP2K4 (igual número implantados con cualquiera de CA1, CA2 o células CA3), produciendo ratones viable 21, 26 y 28 los ratones después de la cirugía en VC, WT-MAP2K4 y CA-MAP2K4 cohortes, respectivamente. Se midieron seis semanas después de la cirugía, tamaño del tumor primario, metástasis, y las CTC en cada ratón. El aumento de expresión de cualquiera de WT-MAP2K4 o CA-MAP2K4 aumentó significativamente la metástasis a distancia en un 16,2 y 17,4 veces, respectivamente, en comparación con los ratones de capital riesgo, sin diferencias significativas entre los ratones CA-MAP2K4 WT-MAP2K4 y, la figura 1C. Una imagen representativa de una metástasis distinta se muestra en la figura 1D. Estos resultados demuestran un aumento aumentos Map2k4 metástasis PCa humana. Curiosamente, las CTC se observaron solamente en ratones CA-MAP2K4, fueron detectados en la sangre del 11% (3/28) y la médula ósea del 7% (2/28), la figura 1E, y demuestran que las CTC son relativamente poco comunes en MAP2K4- metástasis impulsado
.
a pesar de los ratones WT-MAP2K4 expositoras aumentado significativamente la metástasis en comparación con VC, el tamaño del tumor primario en ratones WT-MAP2K4 era un promedio de 24% más pequeño, aunque no estadísticamente significativa, la figura 1F. Como el aumento de tamaño del tumor en-y-de-sí puede afectar a la diseminación metastásica, esto demuestra MAP2K4 tiene un efecto primario sobre la regulación del comportamiento metastásico. Curiosamente, los tumores de los ratones CA-MAP2K4 aumentaron significativamente por 2,04 y 2,67 veces, en comparación con los ratones WT y VC-MAP2K4, respectivamente. Por lo tanto, MAP2K4 tipo salvaje no aumenta el crecimiento del tumor, sino constitutivo MAP2K4 activo hace.
MAP2K4 altera la producción de proteasa, pero no el crecimiento celular de la migración celular o
in vitro
Tener muestra que MAP2K4 aumenta la metástasis, hemos tratado de profundizar en la comprensión de los mecanismos subyacentes. expresión MAP2K4 crónica aumento de la invasión de células (Figura 1B), y la invasión celular es un importante determinante del comportamiento metastásico. Seguidamente, evaluó si el aumento de la invasión celular en las células que sobreexpresan Map2k4 dependía de MAP2K4 derribando MAP2K4 con siRNA. En la figura 2A, para cada una de las líneas de células, se logró desmontables de 21 a 55%. A continuación demostramos que MAP2K4 caída invierte significativamente el aumento de la invasión fenotipo observado tanto en las células CA-MAP2K4, la figura 2B WT-MAP2K4 y. Por lo tanto, la invasión de células sigue siendo dependiente de la expresión continuada MAP2K4.
Los estudios se llevaron a cabo en líneas celulares variante MAP2K4. A) Derribo de proteínas MAP2K4 de siRNA. Después de la transfección de las células con siRNA dirigidos MAP2K4 (siMAP2K4) o control no focalización (SiCon), MAP2K4 expresión se midió por transferencia de Western. Porcentaje de caída se denota por encima de la mancha. B) Efecto de MAP2K4 caída tras la invasión de células. líneas de células variantes MAP2K4 fueron tratados con siRNA, como se indica, y la invasión de células miden y se representan como en la figura 1. Los datos proceden de cuatro experimentos, cada uno en réplicas de N = 2, y se expresan como el porcentaje de células invasoras. C) Los efectos sobre la migración celular. La migración celular se midió como se describe en Métodos. Los datos de los tipos individuales de clones se combinaron, son de tres experimentos independientes, cada uno en réplicas de N = 3, y se expresan como el porcentaje de células que migran, normalizado a VC. D) la transcripción de expresión de MMP. Los niveles de MMP-2, MMP-9, MMP-10 y MMP-13 los niveles de transcripción se midieron por QRT /PCR, normalizado a GAPDH, y se expresaron como el porcentaje de VC. Los datos proceden de cuatro experimentos independientes, cada uno en réplicas de N = 2. E) El crecimiento celular. Las células se colocaron en placas a las concentraciones indicadas, se dejaron crecer durante 5 días, MTT añadió, y la densidad óptica determinados. Los datos son de tres experimentos independientes, cada uno de N = 3. Formación de F) Colonia. La formación de colonias después de 14 días se determinó en tres experimentos independientes, cada uno de N = 2, y se expresó como el porcentaje de VC. Los valores en todos los gráficos son la media ± SEM. * Indica p = 0.05 entre los grupos indicados.
Dado el papel reconocido de la invasión de células en la progresión metastásica, se examinaron además las bases mecanicistas del efecto de MAP2K4 de la invasión celular. la invasión de células es impulsado principalmente por la migración celular acoplado a la digestión por proteasas. Ni WT-MAP2K4 ni CA-MAP2K4 sobreexpresión aumentó la migración de células en un ensayo sin revestir cámara de Boyden, la figura 2C. Además, se observó ningún efecto consistente sobre la migración celular medido por el ensayo de motilidad de una sola célula (datos no mostrados). A continuación examinó el efecto de MAP2K4 en la expresión de la proteasa. Debido a que existe una amplia gama de proteasas conocidas, primero se llevó a cabo una pantalla de proteasas relevantes. Hemos establecido previamente genisteína se une e inhibe la quinasa MAP2K4, lo cual inhibe la invasión de células de CaP humana [11]. Por lo tanto, se examinaron los efectos del tratamiento con genisteína en células PC3-M nativos usando la matriz extracelular y las moléculas de adhesión RT
2 Sistema de matriz de perfiles de PCR, que los perfiles de 84 genes humanos que regulan la célula-célula y las interacciones célula-matriz (Figura S1). Las siguientes proteasas fueron significativamente las reguladas por al menos 2 veces por genisteína: MMP-2, MMP-10 y MMP-13, y se confirmaron por-gen específico QRT /PCR (Figura S1). Sobre la base de estos resultados, se examinó la expresión de estos tres proteasas en el contexto de MAP2K4 sobreexpresión. gelatinasas Además, como la MMP-2 y MMP-9 están estrechamente relacionados, con frecuencia co-regulados, y como la genisteína afecta a la MMP-9 es algunas líneas celulares, aunque episódicamente y, en menor grado, que, además, mide la MMP-9 [30]. Medición de los niveles de transcripción de QRT /PCR reveló que MMP-2 se incrementó significativamente por una media de & gt; 15 veces en comparación con VC, tanto en las células WT-MAP2K4 y CA-MAP2K4. MMP-9 aumentó significativamente 2 veces, pero sólo en las células WT-MAP2K4. MMP-10 y MMP-13 no se vieron afectados. aumentos Por lo tanto, mediadas por MAP2K4 en invasión no se deben a cambios en la migración celular, pero están asociados con cambios en la expresión de la proteasa, MMP-2 en particular. Esto es clínicamente relevante como MMP-2 puede degradar el colágeno IV, un componente principal del tejido de la próstata, y se ha asociado con un mal pronóstico, incluyendo el desarrollo de metástasis (revisado en [31]).
próximo investigó el tamaño del tumor aumento observado en ratones CA-MAP2K4, Fig 1E, para determinar si el crecimiento se altera
in vitro
, Fig 2E-F. En un período de cinco día
in vitro
ensayo MTT en, no se observaron diferencias en el crecimiento celular entre los grupos, la figura 2E. En un ensayo de formación de colonias en agar blando de 14 días, las células CA-MAP2K4 crecieron ligeramente más lento que las células VC y WT-MAP2K4, pero este cambio no fue significativa, la figura 2F. Estos hallazgos demuestran que bajo
in vitro | condiciones actuales de crecimiento, ni WT-MAP2K4 ni CA-MAP2K4 afectan el crecimiento celular.
sobreexpresión MAP2K4 altera específicamente la fosforilación de HSP27 y la expresión de proteínas totales
los resultados anteriores demuestran que MAP2K4 aumenta relativamente específicamente MMP-2. modificación transitoria de MAP2K4 regula MMP-2 y células invasión por la fosforilación y la activación de p38 MAPK [12]. Además de MAPK p38, MAP2K4 puede también ya sea activar JNK, o ambas proteínas, que dependen del modelo de sistema [32]. JNK se asocia comúnmente con los cambios en la proliferación y la apoptosis en respuesta al estrés en PCa humana [33] - [35], pero también con los cambios en la migración celular y la invasión [36], [37]. Por lo tanto, la hipótesis de que la expresión MAP2K4 crónica aumentaría la activación de p38 MAPK y /o JNK. Pusimos a prueba esta teoría mediante el examen de MAPK fosfato p38, -JNK1 y -JNK2 niveles por Western blot en MAP2K4 más de líneas celulares que expresan, usando anticuerpos específicos fosfoproteína. Sin embargo, nuestros hallazgos no apoyan nuestra hipótesis de que la sobreexpresión de MAP2K4 no aumentó los niveles de proteína, ya sea fosfolípidos o total de cualquiera de MAPK p38 o JNK, Figura S2.
Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que en condiciones de MAP2K4 sostenida la sobreexpresión, como ocurre en el escenario clínico, las vías de compensación pueden ser pasando por alto objetivos inmediatamente aguas abajo de MAP2K4, dejando de ese modo en un estado inactivado. HSP27, una corriente abajo de p38 MAPK, aumenta tanto la MMP-2 y la expresión de la invasión de células en PCa humana, en condiciones de transfección transitoria [12], [15]. tanto, nuestro estudio el estado de HSP27, la figura 3A-B. Los niveles globales de ambos HSP27 fosfo- y total, en comparación con GAPDH, se incrementaron. Fosfo y HSP27 total aumentó 3.4 (significativamente) y 2.7 (sólo una tendencia; 2 caras valor de p = 0,065), respectivamente, para las células WT-MAP2K4, y ambos significativamente en un 3,1 y 3,0 veces para las células CA-MAP2K4 . El aumento de la relación HSP27 fosfo-HSP27 /total fue pequeña y significativa sólo para las células WT-MAP2K4. Estos hallazgos demuestran MAP2K4 conduce a mayores niveles de proteínas totales y fosfo-HSP27. No hubo diferencias en la expresión génica entre HSP27 MAP2K4 sobreexpresan y células VC, Fig 3C, lo que indica que las diferencias en la expresión de proteínas se derivaron de las alteraciones en la traducción y /o la degradación de proteínas. Tomados en conjunto, estos resultados determinan que la sobreexpresión MAP2K4 crónica conduce a una mayor expresión de la proteína HSP27, mientras que se evita la activación de MAPK p38 y JNK.
La expresión de las formas totales y fosforiladas de las proteínas HSP27 se evaluaron mediante inmunotransferencia de tipo Western en el líneas celulares indicadas, AB. Los datos de tres manchas separadas se representan gráficamente INB, como media ± SEM. C), los niveles de transcripción de HSP27 se midieron por QRT /PCR, normalizado a GAPDH, y se expresó como la media ± SEM porcentaje de VC.