Extracto
proteína plasmática A asociada al embarazo (PAPPA) ha sido reportado para regular la actividad de vía de la insulina-como factor de crecimiento (IGF) señal a través de la degradación proteolítica de proteínas de unión IGF (IGFBPs) aumentando de este modo la concentración local de IGFs libres disponibles a los receptores. En este estudio se encontró que PAPPA se secreta de dos de las líneas celulares de cáncer de pulmón de siete examinados. Ninguna de las células epiteliales bronquiales normales inmortalizadas (HBE) probó secretos PAPPA. No existe una correlación entre el nivel de expresión y secreción de PAPPA en estas células. Una línea de células que sobreexpresan PAPPA acompañada de secreción no muestra cambios notables en la proliferación celular bajo condiciones de cultivo
in vitro
, pero muestra de manera significativa el aumento del crecimiento del tumor
in vivo
en un modelo de xenoinjerto. En contraste, una línea de células que sobreexpresan PAPPA sin reducción de la secreción de exposiciones del crecimiento del tumor tanto
in vitro
y
in vivo
. Baja regulación de la expresión y secreción PAPPA por RNAi desmontables disminuye el crecimiento del tumor después de implantado
in vivo
. La actividad promotora de tumores de PAPPA parece estar mediada principalmente a través del aumento de la vía de señalización de IGF, como se indica por notables aumentos en la fosforilación de la quinasa Akt aguas abajo en las muestras tumorales. Nuestros resultados indican que la secreción PAPPA puede desempeñar un papel importante en el crecimiento del cáncer de pulmón y la progresión
Visto:. Pan H, S Hanada, Zhao J, L Mao, Ma MZ-Q (2012) la secreción de proteínas es requerido para embarazo-proteína plasmática a asociada de a a promover el crecimiento del cáncer de pulmón
En Vivo
. PLoS ONE 7 (11): e48799. doi: 10.1371 /journal.pone.0048799
Editor: Giuseppe Viglietto, Universidad Magna Grecia, Italia |
Recibido: 11 Junio, 2012; Aceptado: 1 de octubre de 2012; Publicado: 9 de noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Pan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Salud subvenciones R01 CA126818 y R01 CA136635. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
factores de crecimiento semejantes a la insulina (IGF) juegan. papeles importantes en muchos procesos biológicos tales como el crecimiento celular, la transformación, la diferenciación, la supervivencia y la migración [1], [2]. Además de sus papeles críticos en la biología del desarrollo, como es evidente en las mutaciones nulas genéticos [3], [4], [5], los IGF están claramente implicados en la regulación de la formación y progresión del tumor [6], [7]. Es bien conocido que los niveles séricos de IGF-1 se correlaciona con la incidencia de cáncer en los seres humanos [8], [9]. fibroblastos de embriones de ratón con una mutación nula de
Ifgf1r ¿Cuáles son resistentes a la inducción de la transformación celular [10]. A nivel molecular, los IGF se unen a los receptores tirosina quinasas (IGF1R, IR-A) para activar múltiples vías de señalización intracelulares, incluyendo phosphatidylinositide-3'-quinasa (PI3K) /Akt y de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) cascadas de señalización [ ,,,0],11], [12]. Sin embargo, el acceso de los IGFs a sus receptores está estrechamente controlada por proteínas de unión de IGF-(IGFBP) que se unen a IGFs con una mayor afinidad que IGF1R [13]. La degradación de los IGFBPs aumenta IGFs activos libres disponibles a los receptores en el microambiente extracelular y por lo tanto aumenta la actividad de IGFs [14]. Un grupo diverso de proteasas incluyendo la plasmina, metaloproteasas de matriz (MMP-1, -2 y -3), catepsina D y antígeno prostático específico (PSA) se han notificado a participar en la proteolisis de IGFBP con diferente potencia y especificidad [15].
a asociada al embarazo proteína plasmática (PAPPA) es otra proteasa que se ha informado para escindir IGFBP4 [16]. PAPPA se encontró inicialmente en la placenta y los tejidos reproductivos, y se ha sugerido como un biomarcador para el embarazo con anomalía genética [17]. Recientemente, la actividad proteolítica de PAPPA se ha identificado en fibroblastos humanos normales, osteoblastos cultivados [18], [19], las células de músculo liso vascular [20] y células de la granulosa de ovario [21]. De acuerdo con estos resultados, el aumento de expresión de PAPPA ha encontrado
in vivo
en las placas ateroscleróticas activas en arterias coronarias humanas [22] y la cicatrización de heridas de la piel humana [23]. Por lo tanto, PAPPA participa en la regulación de los IGF mediadas por procesos fisiopatológicos de estas enfermedades. PAPPA también se encuentra para escindir e inactivar IGFBP2, IGFBP3 y IGFBP5 [24].
Varias líneas de evidencias indican que PAPPA está implicada en la formación de tumores. gen PAPPA se localiza en una región cromosómica asociada con la alta frecuencia de pérdida de heterocigosidad en tumores de ovario. La mayoría de las líneas celulares de cáncer de ovario y tumores primarios muestran pérdida parcial o completa de la expresión de PAPPA [25]. expresión PAPPA ha demostrado ser consistentemente alta en muestras de ovario normal y fue suprimida por SV40 gran antígeno T [25], [26]. Por el contrario, ratones portadores de una mutación nula del gen PAPPA viven más tiempo y muestran una menor incidencia de la formación de tumores durante su vida [27]. Además, se ha informado nivel PAPPA suero que aumentarse en pacientes con cáncer de pulmón en comparación con sujetos sanos [28]. En opinión de los polémicos papeles de PAPPA informó en el desarrollo del cáncer, decidimos sobre-expresa PAPPA en líneas celulares de cáncer de pulmón para evaluar su papel en el crecimiento y progresión tumoral. Aquí mostramos que ectópico sobreexpresión de PAPPA en células de cáncer de pulmón H1299 promueve el crecimiento del tumor
in vivo
en un modelo de xenoinjerto mientras regulación a la baja de PAPPA endógena en células de cáncer de pulmón A549 disminuye el crecimiento del tumor. tasa de crecimiento del tumor está asociado con la secreción de PAPPA. Los tumores de PAPPA sobre-expresión de las células H1299 exhibidos aumento del número de células mitóticas y una reducción en la apoptosis. Análisis de la vía de señalización Akt mostró elevada. Nuestros resultados sugieren que PAPPA secretada en las células cancerosas podría promover el desarrollo de tumores a través de la potenciación de la IGF vía de señalización
Materiales y Métodos
Los reactivos se obtuvieron de los siguientes proveedores:. Las líneas celulares H1299, A549, H460 , H596, H1792, H1944 y H522 se adquirieron originalmente de la ATCC. HBE1, HBE2 y HBE4 se obtuvieron de John Minna (Universidad de Texas Southwestern Medical Center, Dallas), cada uno representando HBEC1, HBEC2 y HBEC4 inmortalizados con Cdk4 y hTERT, respectivamente [29]. Origen de los reactivos utilizados en los experimentos se muestra como sigue: PAPPA Humano clon de ADNc de longitud completa (ATCC, No. del artículo: 10625309); El anticuerpo monoclonal anti-ratón PAPPA (Novus, Littleton CO); proteína IGF2, proteína IGFBP4 y anticuerpo policlonal de conejo anti-IGFBP4 (Abcam, Cambridge, MA); Fosfo-p44 /42 MAPK conejo mAb, anticuerpo monoclonal de conejo p44 /42 MAPK, conejo fosfo-Akt mAb, Akt (pan) de conejo mAb, anticuerpo β-tubulina (Señalización Celular, Danvers, MA); Anti-IgG de ratón, IgG anti-conejo (Thermo Scientific, Rockford, IL); Biotinilado de IgG anti-conejo, biotinilado anti-IgG de ratón, (Vector Lab, Burlingame, CA); Recombinante factor humano de crecimiento epidérmico (EGF), Recombinant factor de crecimiento transformante-β1 humano (TGF-β1) (Invitrogen, Camarillo, CA); Recombinante factor humano de crecimiento similar a la insulina I (IGF-1) (I + amp; D System, Minneapolis, MN); CellTiter-Blue (Promega, Madison, WI); Anti-fosfo histona H3 (Millipore, Temecula, CA); Tampón RIPA (Sigma, Saint Louis, MI); PAPPA kit ELISA (Diagnostic Systems Lab, Webster, TX); comprimidos de cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) |
Cultivo de células
H1299, líneas celulares H460, H596, H1792, H1944 y H522 se mantuvieron en cultivos de células A549 RPMI1640 y se mantuvieron en DMEM. Tanto PRMI1640 y DMEM se complementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Atlanta, Lawrenceville, GA), L-glutamina (4 mM), penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml), todos de Invitrogen. HBE1, HBE2 y HBE4 se mantuvieron en medio completo libre de suero de queratinocitos (SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se cultivaron en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 C, 5% de CO
2. medios condicionados de células sin suero (CM) a partir de cultivos en monocapa en 80 a 100% de confluencia. medios que contienen suero se aspiró y las monocapas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato. Se añadió completa de queratinocitos-SFM y se incubó durante 24 horas. En la cosecha, CM se transfirió a un tubo de centrífuga y se centrifugó a 2500 rpm durante 10 min a 4 ° C antes de la congelación en pequeñas alícuotas a -20 ° C hasta su utilización en ensayos. Por extracto de células enteras (CE), el medio se retiró y se lavó tres veces en PBS y se lisaron en tampón RIPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) que contiene la proteasa y el inhibidor de fosfatasa comprimidos de cóctel (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) y se centrifugó a 12.500 rpm durante 5 min. Este sobrenadante se utilizó para los ensayos.
Análisis de la expresión de las líneas celulares de cáncer de PCR en tiempo real
Se utilizó el kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) para preparar el ARN total de cultivo de células . El ARN total se trató con ADNasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). La síntesis de ADNc se creó usando reactivos TaqMan RT-PCR de Applied Biosystems (Life Technologies, Grand Island, NY). la expresión de genes PAPPA se determinó mediante el ensayo de la expresión génica TaqMan con un detector de sistema de PCR en tiempo real 7900HT (Applied Biosystems). Los cebadores específicos para la amplificación de los genes diana y la sonda específica para detectar la amplificación fueron diseñados por Applied Biosystems (Cat #: Hs00361692_m1). PPIA Humano (ciclofilina A) se utilizó como un control interno para la normalización de la expresión génica (Cat #: 4333763F, Applied Biosystems).
Generación de líneas celulares de cáncer de pulmón de forma estable sobre-expresión de PAPPA o regulación a la baja de endógeno PAPPA
expresión de ADNc de longitud completa
PAPPA humano (adquirido de ATCC, No. del artículo: 10625309) fue liberado de vector pBluescript por SfiI (lleno) la digestión -XbaI y se subclonó en los sitios EcoRV y XbaI del vector de expresión pCR3.1 (Invitrogen ) para construir el vector de expresión PAPPA. El vector de expresión se verificó por secuenciación. Se seleccionaron las células H1299 transfectadas con o bien vector de expresión PAPPA o vector vacío debajo de un medio de selección contener 0,5 mg /ml de G418 (Sigma). Los clones resistentes a G418 se probaron para la expresión de PAPPA y luego se expandieron para generar H1299 PAPPA sobreexpresión de línea (H1299 /PAPPAov) y la línea celular de control de vector vacío (H1299 /pCR3.1). Para los experimentos de Pappa desmontables, partículas lentiviral Nº 81 (Cat #: VGH5523-101126912, Clone ID: V3LHS_355181),#82 (Cat #: VGH5523-101130068, Clone ID: V3LHS_355182),#83 (Cat #: VGH5523-101132535, Clon ID: V3LHS_355183) que contienen shRNAmir a PAPPA y no silenciar shRNAmir (Cat #: RHS4348) fueron adquiridos de Thermo Scientific (Lafayette, CO) y se utiliza para infectar las células cancerosas A549. Las secuencias maduro sentido de estos clones son las siguientes: V3LHS_355181: CGACAAGAAGTCTCCTTCA; V3LHS_355182: AGAGCCTACTTGGATGTTA; V3LHS_355183: GGGCAGTTCATGAAGCTCT; No silenciamiento: TCTCGCTTGGGCGAGAGTA. Cuarenta y ocho horas después de la infección, se seleccionaron las células en medio de selección que contiene 2 mg /ml de puromicina (Invitrogen). Los clones fueron examinados por PCR en tiempo real para la potencia de PAPPA mRNA desmontables y se expandieron para generar la línea celular PAPPA desmontables (A549 /PAPPAkd) y no silenciar control de línea celular (A549 /sc).
PAPPA ELISA
El medio acondicionado (CM) y extracto de células enteras (CE) se prepararon como se ha descrito anteriormente. niveles PAPPA se midieron usando un kit de ELISA ultrasensible PAPPA obtenido de Diagnostic Systems Laboratories de acuerdo con las instrucciones del fabricante. sensibilidad mínima es de 0,24 mUI /L, con coeficientes intra e inter-ensayo de variación del 4,7 y 4,2%, respectivamente.
Medición de la actividad proteolítica de IGFBP
Se analizó la actividad proteolítica de PAPPA mediante la incubación de suero libre de medio condicionado (CM) con la proteína sustrato IGFBP4. Brevemente, replicar reacciones se establecieron mezclando CM 25 l con sustrato IGFBP4 40 ng en presencia o ausencia de IGF2 (75 nM concentración final), seguido de incubación a 37 ° C durante 4 horas. proteína intacta y se escindió de IGFBP4 en mezclas de reacción se separa a continuación por no reductor 10% SDS-PAGE y se visualizaron mediante análisis de Western Blot usando anticuerpo policlonal anti-IGFBP4 (Abcam).
experimentos de xenoinjerto tumoral
la deficiencia severa hembra de cuatro semanas de edad combinada inmunitario (SCID /NOD) o ratones nu /nu atímicos (Charles River) se utilizaron para este estudio, y todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. 5 × 10
6 de H1299 /PAPPAov, H1792 /PAPPAov o sus células de control de vector vacío (H1299 /H1792 o pCR3.1 /pCR3.1) se suspendieron en 0,1 ml de 1 × PBS que contenía 50% de matrigel y se inyecta subcutáneamente en cinco ratones por grupo usando agujas de calibre 26 y se dejó propagar para formar tumores palpables. Los tumores fueron monitoreados y después se midió dos veces a la semana en tres dimensiones usando un calibrador. Del mismo modo, las células A549 caída Pappa línea A549 /PAPPAkd y silenciando no A549sc de control se expandieron en cultivo. Se inyectaron 1 x 10
6 células suspendidas en 0,1 ml de 1 x PBS por vía subcutánea en cuatro semanas de edad nu /nu ratones atímicos. Los tumores de crecimiento fueron controlados y medidos dos veces a la semana como se describe anteriormente. Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la fórmula (π /6) x longitud (
L
) x anchura (
W
) x altura (H) de los tumores donde
L Opiniones y
W
representan las dimensiones mayor y menor del tumor, respectivamente. Los ratones fueron sacrificados de la misma manera cuando el tumor más grande alcanza el punto final del estudio definido por una carga tumoral del 10% del peso corporal del ratón.
Declaración de Ética
Todos los ratones fueron manejados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo los procedimientos siguientes aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Maryland Escuela de Odontología. La junta de revisión institucional o comité de ética nombrado específicamente aprobado este estudio.
Análisis de Western Blot
La proteína de extracciones de células enteras se cuantificó usando el ensayo BCA (Pierce). Un total de 25 g de proteína se fraccionó por NuPAGE 10% de gel de Bis-Tris (Invitrogen) y se transfirieron a un difluoruro de polivinilideno (PVD) de la membrana por el sistema de transferencia de gel iBlot (Invitrogen). La membrana se bloqueó en TBST (10 mMTris-HCl, pH 7,4, NaCl 100 mM, 0,1% (v /v) de Tween-20) que contiene 5% (w /v) de leche no grasa en polvo durante una hora y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios (1:1000), ya sea en TBST /1% (w /v) de leche en polvo sin grasa o en TBST /1% (w /v) BSA (albúmina de suero bovino). Las membranas se lavaron seis veces con TBST, se incubaron con peroxidasa de rábano picante 1:5000 conjugado anti-ratón o anticuerpo IgG anti-conejo en TBST /1% (w /v) de leche en polvo no grasa durante una hora a temperatura ambiente. Después de otros seis lavados en TBST, se detectaron los complejos de anticuerpos usando quimioluminiscencia potenciada (Amersham Biosciences). Los pesos moleculares se estimaron usando un prestained-rabia completo del arco iris marcadores de peso molecular (GE Healthcare).
tinción inmunohistoquímica
incluido en parafina, 5 micras de espesor secciones de tejido de los tejidos tumorales fueron utilizados para la tinción inmunohistoquímica . Brevemente, las secciones se desparafinaron en una serie de baños de xileno y luego rehidratados usando una serie graduada de alcohol. Las secciones fueron incubadas en tampón de citrato (pH 9) durante 15 min bajo radiación de microondas a fin de que la recuperación de antígeno. Después de bloquear con tampón de bloqueo normal (Vectastain kit) durante 30 min, las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios (fosfo-histona H3 mAb: 1:000; fosfo Akt-MAB: 1:100; fosfo-p44 /42 MAPK mAb: 1:100). Las secciones se procesaron a continuación utilizando técnicas estándar de avidina-biotina (ABC inmunoquímicos) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Vector Laboratories). Diamnobenzidine se utilizó como cromógeno y hematoxilina se utilizó para la tinción de contraste.
Resultados
La secreción de PAPPA funcional activo a partir de células de cáncer de pulmón
primero a prueba la hipótesis de si el aumento de plasma concentración de PAPPA observó en pacientes con cáncer de pulmón [28] se debe a la secreción de PAPPA directamente de las células de cáncer de pulmón. Se examinó el contenido de proteínas y secreción de PAPPA en varias líneas de células no pequeñas de cáncer de pulmón de células comúnmente utilizado (CPNM) en comparación con líneas celulares inmortalizadas humanas normales del epitelio bronquial (HBE). contenido PAPPA en líneas celulares de cáncer es comparable (en los casos de A549 y Calu-1) o menos (en caso de H460, H596, H1299, H1792 y H19444) de líneas de células HBE en general. Sin embargo, la secreción de PAPPA de A549 y H460 es significativamente más que las células HBE como se evidencia por los altos niveles significativos de PAPPA en medio condicionado de estas dos líneas celulares. Los resultados sugieren PAPPA secreción de proteínas puede ser diferente entre las células HBE y A549, aunque los niveles de proteína total de PAPPA son similares (Fig. 1A). Así, la forma secretada de PAPPA de las células cancerosas puede contribuir al crecimiento y la progresión de algunos tipos de cáncer de pulmón.
(A) la concentración de proteína PAPPA en diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón (CE) y medio acondicionado (CM) . Los datos mostrados son el promedio de dos ensayos independientes por duplicado. actividad (B) IGF dependiente de la proteasa en medio condicionado de células de cáncer de pulmón A549. Medición de la actividad proteolítica IGFBP se lleva a cabo como se describe en Materiales y Métodos. Las flechas indican IGFBP4 intacto y 18 kD y 14 kD fragmentos proteolíticos.
Para controlar mejor si secretada PAPPA es funcionalmente activo, la actividad de la proteasa de PAPPA se examinó utilizando como sustrato IGFBP4 en medio condicionado de HBE1 y A549 . Como se muestra en la Figura 1B, medio condicionado de A549 podría degradar eficazmente IGFBP4 en presencia de IGF2, lo que indica que PAPPA secreta a partir de A549 es funcionalmente activo. PAPPA en HBE1 es ni secreta ni funcional porque hay degradación IGFBP4 se observó en el medio condicionado de HBE1 (Fig. 1B). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la capacidad de las células cancerosas a PAPPA secreto en lugar de contenido PAPPA celular se asocia con el crecimiento del tumor y la progresión. ensayo funcional de la actividad proteolítica PAPPA en IGF2 degradación IGFBP4 dependiente es específica, sensible y fiable. Se utilizó este ensayo a partir de entonces como medios para detectar la presencia de medio libre de suero PAPPA según lo informado por otros [26], [27], [30].
reducción de la secreción PAPPA disminuye el crecimiento del tumor in vivo en un xenoinjerto modelo, pero no in vitro en cultivo celular
para evaluar que la forma secretada es importante para PAPPA para promover el crecimiento celular se generó la línea celular estable de A549 transducidas con partículas de lentivirus que contenían shRNAmir en Pappa (A549 /PAPPAkd) en objetivo para derribar la expresión y secreción de PAPPA. Más del 50% por la regulación de PAPPA ARNm se ha logrado en el clon#82 shRNAmir en Pappa según lo confirmado por la cuantificación en tiempo real PCR (Fig. 2A). Es importante destacar que, casi todos secreción de PAPPA de A549 células /PAPPAkd fue abolida como es evidente por la falta de actividad de la proteasa en medio condicionado (Fig. 2B). PAPPA es conocido para degradar IGFBPs y aumentar la biodisponibilidad de IGF
in vivo
. Es de gran interés saber si la reducción de la secreción de PAPPA afectaría el crecimiento celular
in vitro Hoteles en cultivo celular. Se evaluó el efecto de PAPPA caída en el crecimiento de células A549 primera
in vitro
en comparación con las células de control no shRNAmir silenciamiento. No se observó ningún cambio notable en la proliferación celular y el crecimiento de A549 /PAPPAkd
in vitro
en condiciones de cultivo de células (Fig. 2C). El fracaso para detectar el efecto de PAPPA caída en el crecimiento de células sugiere que el cultivo de células
in vitro
podría no ser el modelo de sistema correcta, ya que no tiene un entorno adecuado para PAPPA para actuar como proteasa para aumentar la biodisponibilidad de IGF y las células están constantemente expuestos a muchos factores de crecimiento libres incluyendo IGFs en medio de cultivo. Decidimos examinar el papel de PAPPA en el crecimiento tumoral
in vivo en modelos de xenoinjertos
. Como era de esperar, los tumores generados a partir de la línea celular A549 con PAPPA desmontables (A549 /PAPPAkd) mostró una reducción significativa en el crecimiento tumoral en comparación con la línea celular de control de A549 (Fig. 3A y B). El peso húmedo medio del tumor de A549 /PAPPAkd al final del experimento fue de 214 mg, que es significativamente inferior a 360 mg para el grupo de control (Fig. 4C). Tomados en conjunto, estos resultados indican PAPPA secretada por las células tumorales juega un papel esencial en la promoción de la proliferación celular y la progresión del cáncer de pulmón
in vivo
.
células A549 fueron transducidas con partículas de lentivirus que contenían shRNAmir (# 81#82 y#83) en Pappa y no silenciar shRNAmir (SC) y se seleccionan con puromicina. niveles (A) PAPPA de mRNA de estas líneas celulares determine en tiempo real PCR cuantificación, e indican que el nivel en relación con el control no silenciar. actividad (B) IGF dependiente de la proteasa en el medio condicionado de Pappa desmontables A549 líneas de células. (C) Curva de crecimiento de las células A549 Pappa desmontables línea#82 y no silenciar la línea de control.
(A) La imagen del tamaño del tumor en el momento de la disección. (B) Curva de crecimiento de tumor de xenoinjerto. Las células A549 caída Pappa línea A549 /PAPPAkd y silenciando no A549sc de control se inyectaron por vía subcutánea en 4 semanas de edad
nu /nu
ratones atímicos como se describe en los Materiales y Métodos. Los resultados se expresaron como el volumen medio del tumor (mm
3) ± SD (n = 5). (C) el peso del tumor Wet en el momento de la disección. *:
p Hotel & lt; 0,05 (estudiante
t
prueba)
(A) Los niveles de proteína de Pappa H1299 células que sobre-expresan PAPPA.. niveles PAPPA en extractos de proteínas de las líneas celulares H1299 transfectadas de forma estable con el vector de expresión PAPPA (H1299 /PAPPAov) y vector de control vacío (H1299 /pCR3.1) se determinaron por ELISA kit como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados mostrados son media ± SE de las determinaciones por triplicado. actividad (B) IGF dependiente de la proteasa en medio condicionado de H1299 /pCR3.1 y H1299 /PAPPAov. (C) Curva de crecimiento de H1299 /pCR3.1 y líneas celulares H1299 /PAPPAov. Las células viables en diferentes puntos temporales se midieron por CellTiter-Blue como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados se expresaron como media ± SE de las determinaciones por triplicado de la Unidad de fluorescencia relativa (RFU) de tres experimentos independientes. (D) Los niveles de proteína de Pappa H1792 células que sobre-expresan PAPPA. niveles PAPPA en extractos de proteínas de las líneas celulares H1792 transfectadas de forma estable con el vector de expresión PAPPA (H1792 /PAPPAov) y vector de control vacío (H1792 /pCR3.1) se determinaron por ELISA kit como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados mostrados son media ± SE de las determinaciones por triplicado. actividad (E) IGF dependiente de la proteasa en medio condicionado de H1792 /pCR3.1 y H1792 /PAPPAov. (F) Curva de crecimiento de H1792 /pCR3.1 y H1792 /PAPPAov líneas celulares.
secreción de PAPPA sobre-expresado en células de cáncer promueve el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto, pero no in vitro de la proliferación celular
para evaluar más a fondo el papel de la expresión PAPPA en el desarrollo del cáncer de pulmón, las líneas celulares de cáncer de pulmón H1299 y H1792 que mostraron un bajo nivel de expresión endógena PAPPA, se seleccionaron para la expresión excesiva de PAPPA. Tanto las células H1299 y H1792 con vector de expresión PAPPA transfectadas de forma estable (H1299 /H1792 PAPPAov y /PAPPAov) alcanzan aproximadamente dos veces mayor en el nivel de proteína PAPPA en comparación con sus células de control de vectores parentales (H1299 /H1792 y pCR3.1 /pCR3.1) (Fig. 4A y D). Es importante destacar que, el medio acondicionado a partir de células H1299 /PAPPAov era capaz de escindir el sustrato IGFBP4 en una forma dependiente de IGF2 mientras que no se detectó actividad de la proteasa en las células de control del vector de los padres, lo que sugiere que PAPPA fue capaz de ser secretada a partir de células H1299 /PAPPAov y era funcionalmente activa ( la Fig. 4B). Bajo las mismas condiciones de ensayo, medio condicionado de células H1792 /PAPPAov causó poca degradación del sustrato IGFBP4, lo que sugiere falta de secreción PAPPA a partir de células H1792 /PAPPAov (Fig. 4E).
El efecto de PAPPA sobre-expresión de después se evaluó el crecimiento celular tanto en H1299 /PAPPAov y las células H1792 /PAPPAov. No se observó ningún cambio notable del crecimiento celular en las células H1299 /PAPPAov cuando se compara con su célula de control de vector parental, de nuevo probablemente debido a la falta de microambiente adecuado en condiciones de cultivo de células como se describió anteriormente (Fig. 4C). Curiosamente, las células H1792 /PAPPAov mostraron una reducción significativa del crecimiento de células en comparación con sus células de control de vector (Fig. 4 F), lo que sugiere que el aumento de la no reservado, PAPPA intracelular pueden ejercer funciones distintas en el crecimiento celular del cáncer.
similar a PAPPA caída en las células A549, el efecto de PAPPA se evaluó la sobre-expresión en un modelo de xenoinjerto. células H1299 /PAPPAov que las células sobre-expresa y secreta Pappa, y H1792 /PAPPAov que PAPPA más de expresar sin la secreción PAPPA se inyectaron por vía subcutánea en ratones NOD inmunodeficientes /SCID o
nu /nu atímicos
ratones hembras, respectivamente . Como se muestra en la Figura 5, los tumores generados a partir de PAPPA línea celular de expresión H1299 /PAPPAov crecieron mucho más rápido que su línea de control de vector (Fig. 5A y B). Veintisiete días después de la inoculación, el peso húmedo promedio de los tumores H1299 /PAPPAov fue 630 mg, mientras que la del control H1299 fue 84 mg (Fig. 5C). El nivel en suero de ratones portadores de PAPPA al final del experimento tumor se midió tanto en el grupo H1299 /PAPPAov y el grupo de control respectivo. PAPPA nivel sérico fue significativamente elevado en H1299 /grupo PAPPAov (Fig. 5D). En contraste con las células H1299 /PAPPAov, tumores de xenoinjertos de células H1792 /PAPPAov crecieron mucho más lento que la línea de control del vector (Fig. 5E y F). Sesenta días después de la inoculación, el peso húmedo promedio de tumor H1792 /PAPPAov fue 112 mg, significativamente menos que los 644 mg de peso del tumor derivadas de células de control H1792 /pCR3.1 (Fig. 5G). Los resultados de PAPPA sobre-expresión y regulación en las líneas celulares de cáncer de pulmón abajo se resumen en la Tabla 1. En conjunto, estos resultados sugieren que la forma secretada de PAPPA es crítico para su actividad de promoción de tumores
in vivo
.
(A) imagen de tamaño del tumor de células H1299 en el momento de la disección. (B) Curva de crecimiento de tumor de xenoinjerto. Se inyectaron células H1299 /H1299 y pCR3.1 /PAPPAov por vía subcutánea en 4 semanas de edad NOD /SCID hembras. (C) el peso del tumor Wet en el momento de la disección. (D) PAPPA nivel en suero de ratones portadores de tumores determinados por ELISA al final de los experimentos. (E) La imagen de tamaño del tumor de células H1792 en el momento de la disección. (F) Curva de crecimiento de tumor de xenoinjerto. Se inyectaron células H1792 /H1792 y pCR3.1 /PAPPAov por vía subcutánea en 4 semanas de edad
nu /nu
ratones atímicos. el peso del tumor (G) Wet en el momento de la disección. tamaños de los tumores se midieron y se calcularon como se describe en los Materiales y Métodos. Los resultados se expresaron como el volumen medio del tumor (mm
3) ± SD (n = 5). *:
p Hotel & lt; 0,05; **:.
p Hotel & lt; 0,01 (estudiante
t
prueba)
Mejora de la transducción de señales Akt en el aumento del crecimiento tumoral por PAPPA
el aumento del crecimiento tumoral en PAPPA secretoras de líneas de células podría resultar de la señalización de IGF mejorada causada por la degradación de IGFBP4 y aumenta así en la biodisponibilidad de los IGFs. Para probar esta hipótesis, la proliferación tumoral y la apoptosis se examinaron utilizando la histona H3 como marcador mitótico y ensayo de TUNEL para apoptosis. Significativamente se observaron más células mitóticas en tejidos tumorales de células H1299 /PAPPAov que los de los controles /pCR3.1 H1299. En cuanto a apoptosis, se observaron menos células positivas TUNEL en los tumores de células H1299 /PAPPAov que los de los controles H1299 /pCR3.1 (Fig. 6). Para determinar las posibles vías de transducción de señales predominantemente responsables de la promoción del crecimiento del tumor, el estado de fósforo-Akt y fósforo-P43 /44 MAPK quinasa fueron examinados. Como se muestra en la Figura 7, se observó significativa mayor cantidad de células positivas de fosfo-Akt en las secciones tumorales de células H1299 /PAPPAov que los tumores de las células H1299 /de control pCR3.1. Este resultado se confirmó adicionalmente mediante análisis de transferencia de Western usando proteína extraída directamente de los tejidos tumorales de estos dos grupos. La cantidad de fósforo-Akt fue significativamente mayor en los extractos de proteínas a partir de muestras de tumor H1299 /PAPPAov que los de las células H1299 /de control pCR3.1. No se observó ninguna diferencia notable de fosfo-p42 /44 MAPK estado entre H1299 /PAPPA y sus homólogos
A, C y E:. xenoinjertos de tumores de células H1299 /pCR3.1; B, D y F:. Xenoinjertos de tumores de H1299 /PAPPAov
Panel izquierdo: La inmunotinción para fósforo-Akt (A y B) y de fósforo-p42 /44 MAPK (C y D) en el tejido tumoral de H1299 células /pCR3.1 (A y C) y de H1299 /PAPPAov células (B y D). Panel derecho: la cuantificación de western blot de las proteínas relacionadas con la señal de transducción de IGF vía: P-Akt y P-p42 /44 MAPK en extractos de proteínas de los tejidos tumorales. P:.-Fósforo proteína
Discusión
Nuestros resultados indican que la expresión de PAPPA en líneas celulares de cáncer de pulmón es muy variable. El nivel intracelular de la proteína PAPPA aparece más alto en inmortalizada epitelial humana normal bronquial en general que la mayoría de las células de cáncer de pulmón examinados, lo que parece consistente con el informe de que el locus cromosómico PAPPA se asocia con una alta frecuencia de pérdida de heterozigosidad en tumores de ovario [25 ]. La sobreexpresión de la PAPPA en dos células de cáncer de pulmón diferentes, H1299 y H1792 a nivel de proteína similar, sin embargo, dio lugar a diferentes resultados. La sobreexpresión de la Pappa H1299 no tiene ningún efecto notable sobre el crecimiento celular
in vitro
pero aumenta significativamente en el crecimiento del tumor
in vivo
como un modelo de xenoinjerto. Por el contrario, la sobreexpresión de Pappa H1792 causado notable reducción del crecimiento celular tanto
in vitro
y
in vivo
como un modelo de xenoinjerto. Al marcar dos líneas celulares de sobreexpresión, se encontró que PAPPA H1299 secretos funcional en medio condicionado, mientras H1792 no lo hizo. A pesar de que H1299 y H1792 pueden tener diferente composición genética que pueden hacerlas dependientes de diferentes vías de transducción de la señalización de crecimiento, parece que la actividad de PAPPA en la promoción del crecimiento del tumor está ligada a la capacidad de las células a PAPPA funcional secreto. En concordancia con el papel de la secreción de PAPPA en el crecimiento tumoral, PAPPA caída en A549 resultó en una reducción significativa en el crecimiento del tumor cuando las células se implantaron en ratones inmunodeficientes. El mecanismo (s) molecular subyacente el efecto inhibidor de PAPPA intracelular en el crecimiento de las células H1792 está aún por definir.
Pappa funciones como una proteasa IGFBP para controlar la concentración local de IGF activos libres a disposición de sus receptores por IGFBP degradación y para aumentar indirectamente la ruta de señalización de IGF. Nuestro
in vitro
y
in vivo
resultados aparecen en consonancia con este modelo.