Extracto
Antecedentes
Hemos descrito previamente un modelo de ratón transgénico de la RAF oncogén impulsada para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). A continuación examinamos si la iniciación del tumor y el crecimiento requiere que el factor de células madre auto-renovación Bmi1.
Principales conclusiones
Con el fin de evaluar la función Bmi1 en CPNM dos líneas fundadoras que difieren en la incidencia y la latencia de se comparó la formación de tumores. La ablación de la expresión Bmi1 en ambas líneas tenía una dramática disminución del crecimiento tumoral. A medida que la línea con latencia más corta se correspondía con la vida útil de Bmi1 ratones knock out, estos ratones fueron elegidos para el estudio adicional. La ausencia de Bmi1 no disminuyó el número de la iniciación del tumor en estos ratones, ya que sólo el tamaño y no el número de los tumores disminuyó. La reducción del crecimiento del tumor fue resultado de un aumento de la muerte celular y la disminución de la progresión del ciclo celular que se correspondía con la regulación de la p16
INK4a y p19
ARF.
Importancia
los datos identifica Bmi1 como un factor importante para la expansión, pero no iniciación de la RAF NSCLC
Visto:. Becker M, C Korn, Sienerth AR, Voswinckel R, K Luetkenhaus, Ceteci F, et al. (2009) La proteína del grupo Polycomb Bmi1 requiere para el crecimiento de la RAF no pequeñas de pulmón de células. PLoS ONE 4 (1): E4230 joyas. doi: 10.1371 /journal.pone.0004230
Editor: Mauricio Rojas, Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Agosto, 2008; Aceptado: 5 de diciembre de 2008; Publicado: 19 Enero 2009
Derechos de Autor © 2009 Becker et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. MB y CK fueron apoyados por el SFB 17 TR de la DFG, ARS y KL fueron apoyados por la universidad graduada DFG 1141 Würzburg-Niza. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en el mundo occidental. Sobre la base de la histología dos tipos diferentes de cáncer de pulmón, se definen el cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). En general el 50% de todos los adenocarcinomas, la forma más frecuente de NSCLC, puerto mutaciones en los componentes de la cascada de señalización mitogénica es decir EGFR, K-Ras y B-RAF [1]. Las mutaciones de c-RAF también se encuentran en NSCLC, sin embargo, a una frecuencia más baja.
Varios sistemas de que el cáncer de pulmón modelo en el ratón han sido reportados. Las estrategias para establecer estos modelos han seguido básicamente dos caminos diferentes. 1) Inducción de la expresión de oncogenes y la supresión de genes supresores de tumores por medio de adenovirus de expresión dirigida de Cre-recombinasa [2] - [5]. Este enfoque imita ocurrencia de mutaciones somáticas en los tejidos adultos. 2) la expresión de oncogenes constitutiva en las células diana mediante el uso de promotores específicos de tipo celular [6], [7]. Los últimos modelos pueden ser más apropiadas para las mutaciones adquiridas gestationally. Mientras que los modelos inducidos por virus muestran un espectro célula diana un tanto indefinido el enfoque transgénico tiene el potencial de dirigir todas las células sensibles a la transformación que muestran la expresión de un promotor específico de un tipo particular de células.
Hemos descrito previamente la generación de líneas transgénicas expresar una versión oncogenically activado de la quinasa c-Raf (C-RAF BXB) bajo el control del tipo alveolar humano dos (AT2) de células específicas de la proteína surfactante C (SP-C) promotor [7]. Dos líneas fundadoras, más adelante se hace referencia como BXB11 y BXB23, espectáculo de pulmón dirigidos desarrollo de adenoma con alta penetrancia, alta incidencia y la latencia corta. Los tumores son fenotípicamente bastante estable ya que no atipia nuclear o la metástasis fue visto en un /6 antecedentes C57Bl. Un tipo de células cúbicas forma predominantemente los adenomas. No se ha observado hiperplasia epitelial bronquial continuo con tumores cúbicas como se describe para los modelos oncogénicos K-Ras [4]. La línea fundador BXB23 se ha utilizado ampliamente en los estudios genéticos para analizar la progresión del tumor factores que influyen en [7] - [12]. Aunque la expresión de los transgenes en los objetivos principales de todas las células AT2 sólo un subconjunto de ellos respondieron a la expresión de la C-RAF BXB con la formación de tumores [7]. Una explicación de este resultado es que un compartimiento progenitor pulmonar responde a mitogénica de señalización con la expansión de cascada. Alternativamente cerrar de la expresión transgénica en la mayoría de las células AT2 puede ocurrir. Estamos a favor de la primera posibilidad y suponemos que este compartimiento progenitor es Bmi1 positivo y depende de mitogénica de señalización para la auto-renovación ya que el tratamiento con un inhibidor de MEK cascada llevó a la reducción preferencial en la fracción de células tumorales positivas Bmi1 y una disminución dramática en el tumor de masa [ ,,,0],12]. De acuerdo con estos hallazgos células del endodermo primitivo que dará lugar a células progenitoras pulmonares muestran la dependencia de la señalización mitogénica de autorrenovación en vez de la diferenciación [13]. Previamente se ha demostrado que la proteína del grupo Polycomb Bmi1 es un factor crucial para la auto-renovación de células madre células madre /tumor de adultos a través de la inhibición de la INK4a /ARF locus que codifica p16
Ink4a /p19
ARF ([ ,,,0],14], revisado en [15]). Bmi1 también ha sido recientemente identificado como un marcador pronóstico de NSCLC [16], [17] y pertenece a un grupo de factores que han sido identificados como una firma de muerte de cáncer en los tumores malignos humanos [18].
en este estudio nos propusimos evaluar la función Bmi1 en la formación de adenoma inducida por la RAF. Debido a la duración de la vida restringida de Bmi1 genes ablación ratones [19] Nos aprovechamos de la incidencia más alta y más corta latencia de la línea fundadora BXB11 para examinar la dependencia del crecimiento Bmi1 adenoma en la enfermedad avanzada.
Bmi1 ablación a través cruzando el Bmi1 - /- de fondo en la línea fundadora BXB23 y BXB11 reveló que Bmi1 no es necesaria para la iniciación del tumor, pero para la expansión de las células iniciadas
Materiales y Métodos
Ética declaración
.
Todos los estudios con animales fueron aprobados por las autoridades del Estado de Baviera para la experimentación con animales.
Animales
BXB23 y los ratones fueron criados BXB11 rutinariamente en el fondo C57BL /6. Para la generación de Bmi1 - /- BXB23 y Bmi1 - /- ratones BXB11 ratones SP-C C-RAF BXB se cruzaron con Bmi1 +/- ratones que habían sido propagadas en un fondo FVB /N. Los ratones heterocigotos compuestos Bmi1 resultantes se sometieron a retrocruzamiento con FVB /N /Bmi1 +/- ratones para generar Bmi1 - /-. Ratones compuestos SP-C C-RAF BXB
Reactivos y anticuerpos
Los anticuerpos utilizados para inmunohistoquímica /inmunofluorescencia: anticuerpo SP-C de conejo policlonal Pro (Chemicon International), el anticuerpo CC10 policlonal de cabra (Santa Cruz Biotechnology), pan-citoqueratina anticuerpo policlonal de conejo (DAKO),-67 Ki anticuerpo monoclonal de ratón (Novocastra), C-RAF anticuerpo monoclonal (Santa Cruz Biotechnology), anticuerpo monoclonal de ratón Bmi1 (Upstate), p19
conejo ARF anticuerpo policlonal (Abcam), c-MYC anticuerpo policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnology), p16
anticuerpo INK4a conejo policlonal de ratón ( Santa Cruz de Biotecnología), conejo monoclonal fosfo-p44 /p42 MAPK Thr 202 /Tyr204 (fosfo-ERK) anticuerpo (Señalización celular).
microscopía
microscopía de fluorescencia se realizó utilizando un software Openlab ( Improvisación, Coventry, Reino Unido) controla DMIRBE microscopio (Leica, Wetzlar, Alemania) con un 40 × objetivo de inmersión en aceite de Leica. Todas las imágenes fueron capturadas y almacenadas como archivos Openlab LIF. Las imágenes fueron procesadas posteriormente utilizando Power Point y Adobe Illustrator.
La histopatología e inmunohistoquímica /Inmunofluorescencia tinción
Los animales fueron sacrificados y los pulmones se fijaron menos de 25 cm de presión de agua con 4% formalina tamponada PBS. La histología se realizó en muestras pulmonares, incluidas en parafina fijadas con formalina. 6 micras secciones cortadas se deparaffinized, rehidratada en alcoholes graduados y hematoxilina-eosina (H & amp; E) manchadas. Para la cuantificación de la incidencia de tumores el número de tumores dentro de al menos cinco áreas diferentes (310.390 m
2) por H & amp; E o C-Raf secciones de pulmón teñidas se contaron. Al menos cuatro ratones se analizaron para cada genotipo. El volumen del tumor se calculó a partir de H & amp; E manchada o anti-C-RAF tumores de secciones de pulmón enteros suponiendo un tumor esférica manchada. Los diámetros de los tumores se midieron mediante el uso de un microscopio Leica. Para la cuantificación de los volúmenes tumorales fueron examinados al menos cuatro animales por genotipo y edad: 321 tumores de BXB11, 266 tumores de Bmi1 - /- BXB11, 92 tumores de BXB23 y 54 tumores de Bmi1 - /- BXB23 animales a la edad de dos semanas fueron analizados. Se analizaron BXB23 animales a la edad de tres meses - 133 tumores de Bmi1 - /- BXB11, 121 tumores de BXB23 y 4 tumores de Bmi1 - /. Para la cuantificación de la proliferación Ki67 /se analizaron células positivas SP-C PRO en secciones de pulmón de ratones de genotipo indicado y la edad. Un total de al menos 1200 células positivas pro SP-C se contó a partir de cinco tumores seleccionados al azar y se analiza para Ki67 co-tinción. Para la tinción de TUNEL el callejón sin salida fluorométrico TUNEL-System (Promega) se utilizó. Se analizaron y 25 tumores seleccionados al azar de cinco ratones (BXB11) Un total de 20 tumores seleccionados al azar de cuatro ratones (BXB11 Bmi1 - /-). Se analizaron 325 (+/- 100) DAPI células positivas por tumor para TUNEL positividad. Para la cuantificación de células con tinción nuclear fosfo-ERK se analizaron un mínimo de 14 tumores de dos ratones de genotipo indicado y la edad. análisis morfológico automatizado Semi de secciones de pulmón de WT y Bmi1 - /- de los animales se llevó a cabo como se describe en [20]. Para la cuantificación de células dobles CC10 SP-C /pro positivos se analizaron cinco tumores seleccionados al azar por sección del pulmón de un total de 5 animales a las edades de 2 semanas a 3 meses. Ajustes para la captura de imágenes se eligieron que permitió la detección de células dobles positivas en los cruces bronquio-alveolar-conducto (BADJs)
tinciones de inmunofluorescencia se llevaron a cabo de acuerdo con el siguiente protocolo básico:. Las secciones en parafina embebido se deparaffinized y rehidratada . Para antígeno microondas secciones de recuperación se incubaron en tampón de citrato 10 mM durante 6-23 min. Los portaobjetos se bloquearon en tampón apropiado que contiene ya sea del 4% o suero de cabra de burro, o 1% de BSA (exclusivamente para la tinción Bmi1). La incubación con anticuerpos primarios se llevó a cabo durante la noche a 4 ° C seguido de los pasos subsiguientes como sigue: Para pro SP-C /secciones co-tinción Ki67 se incubaron con anticuerpo de burro anti-ratón biotinilado (1:200) y el anticuerpo Cy5 anti-conejo de burro (1:200) durante 90 min a temperatura ambiente (RT) las secciones se incubaron posteriormente con estreptavidina conjugada con Alexa 555 (1:200). Para Bmi1 secciones de tinción se incubaron con un anticuerpo anti ratón de cabra biotinilado en tampón de bloqueo durante 90 min a TA. Después de tres lavados con PBS, las secciones se incubaron con el reactivo ABC (kit Vectastain Elite ABX, Vector Labs) durante 30 min a TA. Posteriormente se incubaron las secciones con anticuerpo marcado Cy5 (1:100) HRP contra (horseraddish peroxidasa) en tampón de bloqueo. Para p19
secciones de tinción con IRA se incubaron con el anticuerpo anti-conejo de burro biotinilado (1:200) 90 minutos a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS secciones se incubaron con estreptavidina conjugada con Alexa 555 (1:200) en PBS, 0,2% Triton X-100, 90 min a TA. Para las secciones de SP-C /CC10 co-tinción pro se incubaron con burro anti-cabra Alexa 555 (1:200) y burro anti conejo Cy5 (1:200) anticuerpos en tampón de bloqueo durante 90 min. Todas las tinciones fueron finalmente counterstained con DAPI antes del montaje.
Para coloraciones de inmunohistoquímica se deparaffinized y rehidratada secciones. Para antígeno secciones de recuperación se incubaron en tampón de citrato 10 mM a 90 ° C durante 10 a 20 min. La actividad peroxidasa endógena se inactivó con metanol o PBS que contenía 3% de H
2O
2. Para la tinción de c-MYC, las secciones se bloquearon 60 min con PBS que contenía 0,2% de Triton X-100 y suero de cabra al 4%. Después de la incubación el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C las secciones se incubaron con anticuerpo de cabra anti conejo biotinilado anticuerpo secundario a una dilución 1:200 durante 60 min a RT. ABC reactivo se aplicó (kit Vectastain Elite ABX, Vector Labs) y se desarrolló en diaminobencidina (DAB). Las secciones se counterstained con hematoxilina y se montaron después de la deshidratación. Fosfo p44 tinción /p42 MAPK se realizó esencialmente como se ha descrito para c-MYC con los siguientes cambios: TBS, 1% de Tween 20 (TBST) fue utilizado para el lavado. Las secciones se bloquearon con TBST que contenía 0,2% de Triton X-100 y suero de cabra al 5%. de incubación de anticuerpo secundario se llevó a cabo usando el anticuerpo anti-conejo de cabra biotinilado en tampón de bloqueo durante 60 min. tinciones pan-citoqueratina se llevaron a cabo como se describe anteriormente [8].
Western blot de extractos de todo el pulmón
Para la preparación de extractos de pulmones recién preparados se transfirieron a un tubo que contenía 500 l de hielo frío tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, 0,5% desoxicolato (DOC), 1% Nonidet P40 con cóctel inhibidor de la proteasa). Los pulmones se homogeneizaron durante 5 minutos usando un homogeneizador Ultraturax en ambiente frío. Los tubos que contienen el homogeneizado de pulmón se centrifugaron en una centrífuga refrigerada a 18.000 g durante 30 min. Después de centrifugación los sobrenadantes se transfirieron a un tubo nuevo y partes alícuotas para la determinación de proteínas. Los extractos restantes se mezclaron con 2 x tampón de carga de Laemmli calentada a 95 ° C durante 5 min y, o bien se almacenaron a -20 ° C o resueltas por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Después de un período de bloqueo una hora PBS (0,05% de Tween, leche en polvo descremada 5%) manchas de transferencia se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario, se lavaron tres veces con PBS y posteriormente se incubaron con un anticuerpo secundario acoplado con peroxidasa. Después de lavar tres veces con PBS en transferencias fueron desarrolladas.
RT-PCR
El ARN se preparó a partir de pulmones enteros de dos semanas de edad ratones utilizando el kit de preparación de ARN peqGOLD Trifast (Peqlab Biotechnologie GmbH) según el fabricante instrucciones. Las muestras se sometieron a un tratamiento con ADNasa I antes de la preparación de ADNc utilizando cebadores hexámeros aleatorios proporcionados por la primera cadena de cDNA de síntesis Kit (Fermentas).
-PCR en tiempo real se realizó el seguimiento SYBR incorporación verde. Como control interno se monitorizaron los niveles de ARN del gen HPRT. el análisis de PCR en tiempo real se realizó en un Roto-Gen sistema de detección de 2000 (Corbet Research). Primer secuencias: HPRT: CACAGGACTAGAACACCT; GCTGGTGAAAAGGACCTCT; p19
ARF: GCGCTCTGGCTTTCGTGAAC; CGTGTCCAGGAAGCCTTCCC; p16
INK4a: CGTGAGGGCACTGCTGGAAG; ACCAGCGTGTCCAGGAAGCC; p15
INK4b: CCAGGAAGCCTTCCCGAGCT; GGGGGCAAGTGGAGACGGTG; Cbx7: CGGCCCATTGGTCAGGTCTG; GACCCTCGCCTTGTCATGGC.
Resultados
Desarrollo de NSCLC en BXB23 y BXB11 ratones
formación de adenoma de pulmón se comparó entre líneas fundadoras transgénicas BXB23 y BXB11 RAF. A juzgar por H & amp; E tinción no hubo diferencia en la histopatología de los tumores de ambas líneas. Sin embargo, el número de focos tumorales por área fue notablemente diferente. La cuantificación de los tumores mostró una incidencia de 4-5 veces más alta en los pulmones de BXB11 en comparación con BXB23 animales (Figura 1A). La base de esta diferencia entre las cepas puede resultar de la mayor fracción de células que muestran fosfo-ERK nuclear en BXB 11 ratones (Figura S1A y B). Con base en el número de tumores por sección se calculó la cantidad total de los tumores de pulmón por en el intervalo de 3000 en un promedio de los tumores de pulmón y BXB23 12000-15000 en un promedio BXB11 pulmón. En el fondo de aproximadamente 1-2 x 10
6 células AT2 en el pulmón de ratón [21] se concluye que en ambas líneas fundadoras sólo un número muy limitado de células AT2 servir como células iniciadoras del tumor. Este hallazgo es consistente con la iniciación del tumor en un compartimento progenitor y la resistencia de las células diferenciadas terminalmente AT2 para la transformación, aunque apagado transgén estocástico no se puede excluir. Comparación del volumen del tumor entre fundadores no reveló diferencias significativas (Figura 1B). Los tumores en BXB11 son más frecuentes y por lo tanto llenar más rápidamente del pulmón conduce a la asfixia, como es evidente a partir de las curvas de supervivencia (Figura 1C).
A) Cuantificación de la incidencia de tumores en BXB23 y BXB11 pulmones a la edad de 3 semanas (n = 5 animales, para más detalles véase materiales experimentales). B) La cuantificación del volumen del tumor entre BXB23 y BXB11. La diferencia entre los dos fundadores no fue significativa. Los datos presentados como diagramas de cajas y bigotes. Cajas delinean primer y tercer cuartil, bigotes representan mínimos y máximos, respectivamente, las medianas se indican con línea continua dentro de los cuadros, pequeños cuadrados representan valores atípicos experimentales. los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de Student, sólo p-valores que indican la significación; se muestran (p & lt 0,05). C) parcela de Kaplan-Meier para la supervivencia de los ratones BXB11 y BXB23. P-valor se calculó mediante la prueba Logrank.
Bmi1 promueve el crecimiento tumoral pero no la iniciación del tumor tanto en los ratones BXB11 y BXB23
En base a la observación de que Bmi1 se expresa en BXB11 inducida tumores y el papel anteriormente descrita de Bmi1 en el tumor de células madre auto-renovación [14], [22], [23] que decidimos estudiar más a fondo el papel de Bmi1 para el desarrollo de adenomas C-RAF BXB (Figura 2A). Hemos generado ratones que expresan el transgén compuestos SP-C C-RAF BXB en el fondo Bmi1 noquear. Como la deleción genómica de Bmi1 no tuvo efecto en el desarrollo del pulmón y de la estructura del pulmón adulto (Figura S2) cualquier alteración en el crecimiento del tumor se puede atribuir a Bmi1. El análisis de la Bmi1 - /- ratones SP-C C-RAF BXB se ve obstaculizada por la corta vida de estos ratones que se debe a la supresión de Bmi1 [24] y rara vez se les permite el seguimiento del desarrollo del tumor durante más de tres meses.
a) de parafina incrustados secciones de pulmón de BXB11 y Bmi1 - /- BXB11 pulmones se tiñeron para Bmi1 (verde) y DAPI (azul). líneas blancas salpicadas delinean los tumores. Barra de escala = 30 micras. B) H & amp; E tinción de secciones de pulmón de BXB11 y Bmi1 - /- ratones BXB11 a la edad de dos semanas y tres meses demuestra reducida burdon tumor en Bmi1 - /- BXB11 pulmones. Barra de escala = 200 micras. C y D) Análisis de la incidencia de tumores y el crecimiento dentro de los pulmones de BXB11 y Bmi1 - /- BXB11 ratones. Los datos se presentan como diagramas de caja y patillas, para ver los detalles de la presentación de datos véase figura la leyenda de la Figura 1 (animales n≥4 por genotipo y edad, para más detalles véase materiales experimentales). Tenga en cuenta que la incidencia de tumores se incrementó en un factor de dos en comparación con la Figura 1A) a causa de los antecedentes genéticos FVB /N introducido a través de acoplamiento con la Bmi1 - /- ratones. Dakota del Norte. = No determinado porque los tumores fueron confluentes. los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de Student sólo p-valores que indican significancia se muestran.
Por lo tanto, primero analiza el efecto de la ablación Bmi1 en la iniciación del tumor de pulmón en el fondo BXB11 como el tiempo de vida de estos ratones emparejados que Bmi1 de ratones knock out. En contraste con BXB23, BXB11 pulmones mostraron extremadamente grandes áreas del pulmón ocupado por tejido tumoral a los tres meses de edad. El crecimiento del tumor se redujo fuertemente dentro de los pulmones de Bmi1 - /- BXB11 ratones (Figura 2B) de dos maneras, en primer lugar se produjo un pliegue disminución de aproximadamente dos de los números de tumor entre dos semanas y tres meses de edad (Figura 2C) y segundo el volumen de Los tumores se redujeron supervivientes (Figura 2D). Se obtuvieron datos similares para Bmi1 - /- ratones BXB23 compuestos (Figura S3). Aunque es de tamaño reducido los tumores en Bmi1 - /- BXB11 pulmones mostraron características de los adenomas inducidos SP-C C-RAFBXB a juzgar por el análisis de la morfología celular y la tinción con dos marcadores tumorales (pan-citoqueratina y Pro SP-C; Figura S4) . También el cierre de la expresión transgénica como consecuencia de la ablación Bmi1 puede descartarse como una razón para el crecimiento tumoral reducido desde Bmi1 - /- BXB11 tumores teñidos positiva con un anticuerpo C-RAF (Figura S4). Consistentemente el nivel de nuclear fosfo-ERK se mantuvo en BXB11 y Bmi1 - /- BXB11 de dos semanas a tres meses de edad que demuestra que el cese del crecimiento no es causado por una reducción de la señalización a través de la cascada mitogénica (Figura S5)
en resumen, la ablación de Bmi1 en BXB11 ratones conduce a la reducción fuertemente el crecimiento del tumor. El número inicial de los tumores en BXB11 frente Bmi1 - /- BXB11 sin embargo, no muestra una reducción significativa en Bmi1 - /-. BXB11 pulmones, lo que indica que la especificación de las células iniciadoras de tumores no depende de Bmi1
Aumento la muerte celular y reduce la fracción de células en ciclo en Bmi1 - /- BXB11 animales
el crecimiento del tumor fuertemente reducida y la pérdida de los tumores con el tiempo en ambas líneas fundadoras con expresión Bmi1 abrogada es ya sea una consecuencia de un bloque en la progresión del ciclo celular o el aumento de la muerte celular o una combinación de ambos. Bmi1 previamente se ha implicado en la promoción de la supervivencia celular del tumor y la progresión del ciclo celular en un sistema modelo de cultivo de tejido [25], [26]. TUNEL tinción mostró un aumento significativo en la proporción de células apoptóticas en los adenomas de tres meses de edad Bmi1 - /- BXB11 ratones (Figura 3A y 3C). Esto indica que la apoptosis es un acontecimiento tardío en Bmi1 - /- BXB11 adenomas. A continuación se analizó la tasa de crecimiento. Se realizó Ki-67 /pro-SP-C co manchas en los pulmones preparados a partir de dos semanas y tres meses de edad Bmi1 - /- BXB11 y BXB11 animales. La fracción de células en ciclo se reduce fuertemente sobre Bmi1 ablación. Por otra parte, como es evidente desde el control BXB11 a la edad de tres meses de la tasa de crecimiento de estos tumores también ha disminuido sugiere o bien una vida útil limitada para replicativa BXB11 células transformadas AT2 o otros niveles de control de crecimiento (Figura 3B y 3D).
A) tinción de TUNEL embebidos en parafina secciones de pulmón de Bmi1 - ratones BXB11 y BXB11 - /. DNasa I trataron secciones de pulmón se utilizaron como control positivo. Secciones tratadas sin desoxinucleotidiltransferasa terminales sirvieron como control negativo. líneas blancas salpicadas delinean los tumores. Genotipos y edades, como se indica. Las flechas indican las células apoptóticas (verde). Barra de escala = 30 micras. B) Ki67 (rojo) /pro SP-C (verde) co-tinción de inmunofluorescencia de secciones de pulmón de BXB11 y Bmi1 - /- ratones BXB11. Las flechas indican las células tumorales ciclismo. "*" Indica artefacto de tinción. Barra de escala = 30 micras. C) La cuantificación de células TUNEL positivas en tumores de pulmón de dos semanas y tres meses de edad y BXB11 Bmi1 - /- BXB11 ratones (n = 4 animales por genotipo), para detalles ver materiales y métodos. Los datos se presentan como diagrama de caja y patillas para los detalles de la presentación de datos véase figura la leyenda de la Figura 1. D) La cuantificación de Ki-67 /pro SP-C células doble positivas. Se analizaron al menos cinco tumores de cinco animales diferentes. los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de Student, sólo se muestran los valores de p que indican significación.
En conclusión, tanto la supervivencia de las células tumorales y la proliferación de las células se ven afectadas en ratones con BXB11 Bmi1 eliminación y pueden dar cuenta de el crecimiento del tumor observado reducida.
expresión de p16 dependiente Bmi1
INK4a y p19
ARF
Bmi1 está implicada en la regulación CDKI. Lo más prominente p16
INK4a, p19
ARF han demostrado ser regulada negativamente por Bmi1 [27]. Por lo tanto p16 alterado
INK4a /p19
niveles de expresión de ARF podría ser responsable de la reducción del número de supervivientes y en bicicleta en las células Bmi1 - /- BXB11 tumores. Se analizaron primera expresión de los niveles de ARNm de p16
INK4a por RT-PCR semi-cuantitativa en los pulmones de dos semanas de edad y BXB11 Bmi1 - /- ratones BXB11 (Figura 4A). Los niveles de expresión de p16
INK4a se incrementaron notablemente en Bmi1 - /- BXB11 pulmones. Western blot de lisados de todo el pulmón confirmó este resultado en el nivel de proteína (Figura S6A)
.
A-D) en tiempo real el análisis semi-cuantitativo por PCR de ARN total de los pulmones enteros de dos semanas de edad ratones, como los genotipos indicado. niveles BXB11 se establecieron a uno. Los datos son representativos de dos conjuntos independientes de análisis. Los datos muestran desviaciones estándar de los valores por triplicado. los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de Student, sólo se muestran los valores de p que indican significación. A) La cuantificación de p16
INK4a niveles de expresión B) Cuantificación de p19
ARF niveles de expresión de ARN. C) La cuantificación de p15
INK4b niveles de expresión. D) La cuantificación de los niveles de expresión Cbx7.
A continuación se analizaron los niveles de expresión de ARNm de p19
ARF. Al igual que en el caso de p16
INK4a, p19
ARF y p15
INK4b niveles de expresión fueron hasta reguladas en los pulmones de Bmi1 - /- BXB11 cuando se comparan con BXB11 (Figura 4B y 4C). En contraste con p16
INK4a que no fue alterada entre el tipo salvaje y ratones BXB11, hemos encontrado niveles elevados de p19
expresión de ARN ARF también en BXB11 pulmones (datos no mostrados). Otro regulador epigenético del locus INK4a, Cbx7 no se alteró significativamente en la expresión sobre la ablación en Bmi1 BXB11 ratones (Figura 4D). La tinción de inmunofluorescencia de Bmi1 - /- BXB11 y BXB11 pulmones mostraron que p19
ARF se expresa en los tumores pulmonares de los animales de ambos genotipos. Las diferencias en la distribución de subnuclear p19
ARF son, sin embargo, evidente cuando Bmi1 - se comparan BXB11 y BXB11 tumores - /. Mientras que la ablación de Bmi1 está asociado con un patrón de tinción nuclear focal múltiples de p19
ARF en casi todas las células tumorales que se limita principalmente a un único locus dentro de los núcleos de tumores en presencia de Bmi1 (Figura S7).
en conclusión encontramos reducido la proliferación en la etapa tardía p19
ARF tumores BXB11 positivos que podrían ser interpretados como parte de un fenotipo de senescencia. Una posible explicación de este efecto leve puede ser la expresión de c-myc, que encontramos en las células tumorales (Figura BXB11 S6B) y que ha sido recientemente descrita para revertir un fenotipo sensescence en los melanomas B-RAF transformadas [28]. En ausencia de Bmi1 sin embargo, la expresión de INK4a /Arf fue más pronunciada a pesar de que la expresión de c-myc se mantuvo (Figura S6B) con el tiempo conduce a la interrupción de la proliferación. Por lo tanto, en estas condiciones un rescate c-myc podría dejar de funcionar.
No hay evidencia de células bronquio-alveolar-madre (BASCs) en tumores de pulmón independiente de Bmi1
A continuación se dirigió a la contribución de células BASC a la formación de tumores SP-C C-RAF BXB. Para este fin se realizó un pro SP-C /CC10 doble tinción y analizado BXB11 tumores para la presencia de células doble positivas. Para esta imagen Análisis de la configuración de adquisición fueron escogidos que permitió la identificación de BASCs en BADJs. Como se ilustra en la Figura 5, no hay células doble positivo puede observarse en los tumores.
embebidos en parafina secciones de pulmón de ratones BXB11 se tiñeron para pro SP-C (rojo) y para CC10 (verde) para detectar bronquio doble positivo células madre alveolares (BASCs). Una célula BASC representante que se encuentra en un bronquio alveolar unión de conducciones (BADJ) se indica por la flecha blanca. Barra de escala = 30 micras.
En resumen estos datos indican que el grupo de células tumorales independientes Bmi1 que presumiblemente representa las células iniciadoras de tumores no representa BASCs.
Discusión
en el presente estudio se emplearon dos líneas fundadoras transgénicas con cáncer de pulmón dirigido expresión de C-RAF BXB para la dependencia de la iniciación adenoma y el crecimiento en el factor de células madre auto-renovación Bmi1. Se demuestra que tiene una BXB11 cuatro veces más alta incidencia y la más corta de latencia de los adenomas que permite el examen de la enfermedad avanzada en ausencia de Bmi1. El agotamiento de Bmi1 tanto en el fondo BXB23 y BXB11 condujo a una disminución pronunciada en la tasa de crecimiento del tumor y un aumento en la muerte celular dentro de los adenomas. Por el contrario ninguna reducción significativa en los eventos iniciadoras del tumor se observó en ambas líneas fundadoras, con el argumento de Bmi1 ser un factor importante para la expansión del tumor en lugar de iniciación.
Sobre la base de la observación, que Bmi1 se expresa en la C- RAF BXB inició adenomas pulmonares y que Bmi1 es un objetivo de la RAF de señalización [19] se decidió investigar la formación de adenoma en ausencia de Bmi1. La abrogación de la expresión Bmi1 en el fondo BXB23 y BXB11 no dió una reducción significativa en los eventos de la iniciación del tumor tal como se define por el número de tumores que se formaron en las diferentes combinaciones genéticas por dos semanas de edad. Análisis de células de adenoma de pulmón en ausencia o presencia de Bmi1 no reveló diferencias en el nivel de expresión del marcador celular morfológica y al. Por lo tanto la ausencia de Bmi1 no afectó el proceso de la iniciación del tumor. Estos resultados son consistentes con un informe publicado anteriormente que muestra Bmi1 iniciación glioma independiente aunque en ausencia de INK4a [29]. La ausencia de Bmi1 no afectó a la identidad de las células tumorales resultantes con respecto a la morfología y la expresión de un conjunto limitado de marcadores. Estos resultados también indican que Bmi1 no se requiere para la especificación de un tumor de células de iniciar dentro del pulmón. los niveles de fosfo-ERK pueden compensar la pérdida Bmi1 a corto plazo, pero no a las divisiones de auto renovación a largo plazo de las células iniciadas como hemos observado un importante crecimiento del tumor en Bmi1 - /- BXB11 que muestran mayor nuclear fosfo-ERK, seguido por el cese de la división celular en los puntos finales de tiempo ( tres meses de edad), cuando el fósforo-ERK nuclear todavía estaba presente. En el curso de nuestros estudios nos Tampoco se observaron cambios en la morfología de pulmón en Bmi1 - /- ratones que indica que Bmi1 no es un factor crucial para el desarrollo pulmonar adecuada. Se encontró una fuerte sobre regulación de p19
ARF, p16
INK4a y p15
INK4b en preparaciones de ARN de pulmón enteros de Bmi1 - /- animales en comparación con sus compañeros de camada de tipo salvaje. La expresión de p19
ARF no puede exclusivamente atribuirse a las células pulmonares infiltrante del sistema hematopoyético ya que vemos p19 pronunciada
expresión ARF en AT2 células y las células que recubren los bronquios en Bmi1 - /- animales (datos no mostrados ). Obviamente, la expresión de CDKIs no perjudica la función de células de pulmón normal. Este hallazgo es de interés en relación con los efectos de diana en posibles futuras estrategias terapéuticas dirigidas a Bmi1 en el cáncer de pulmón
CDKIs codificada en el locus INK4a están implicados en la inhibición de la progresión y el control de la supervivencia celular [30] ciclo celular -. [ ,,,0],32]. En línea con esto lo hacemos ver la progresión reducida de las células tumorales en el ciclo de Bmi1 - /- BXB11 tumores y un aumento de la apoptosis en las células aunque con cierto retraso. Estos resultados están en línea con los resultados previos publicados por Liu et al [25] que muestra
in vitro
un efecto específico de Bmi1 en la supervivencia de las células tumorales.
De acuerdo con informes anteriores que muestran p19
ARF sobre regulación en respuesta a las señales oncogénicas hiperproliferativas [33] - [35], expresión de p19
ARF no se limita a la Bmi1 - /- de fondo, pero también puede observarse en menor medida en los adenomas BXB11. Hemos observado que la p19
ARF localizada sólo en un a dos focos nucleares distinto dentro BXB11 adenomas.