Extracto
Antecedentes
TPR es una proteína grande espiral de la bobina situada en la canasta nuclear del complejo del poro nuclear, para lo cual se propusieron muchas funciones diferentes de la levadura a humanos.
Metodología /Principales conclusiones
Aquí nos muestran que el agotamiento de la RPT de interferencia por ARN desencadena la detención G0-G1 y en última instancia induce un fenotipo senescente-como dependiente de la presencia de p53. También se encontró que el agotamiento de TPR perjudica la NES [secuencia de exportación nuclear] dependientes de la exportación nuclear de las proteínas y causa parcial co-agotamiento de Nup153. Se incrementan los impactos de agotamiento de TPR sobre el nivel y la función de la SENP2 SUMO-proteasa que afecta a la regulación Sumoylation en el poro nuclear y Sumoylation global en la célula.
Conclusiones
Nuestros datos, por primera vez proporcionan evidencia de que un componente de poro nuclear desempeña un papel en el control de la senescencia celular. Nuestros resultados también apuntan a nuevos papeles para TPR en la regulación de SUMO-1 conjugación en el poro nuclear y confirman la implicación directa TPR en la exportación nuclear de NES-proteínas
Visto:.-David Watine B (2011) silenciando la proteína nuclear de poro TPR provoca un fenotipo similar a senescente en células de cáncer. PLoS ONE 6 (7): e22423. doi: 10.1371 /journal.pone.0022423
Editor: Michael Polymenis, Texas A & amp; M University, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 1, 2011; Aceptado: 22 Junio 2011; Publicado: July 19, 2011
Derechos de Autor © 2011 Brigitte David-Watine. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Pasteur. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. El autor ha declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
complejos de poro nuclear (CPN) median todo el transporte bidireccional selectiva entre el núcleo y el citoplasma. La evidencia también está emergiendo apuntando a las funciones adicionales para CPN, sus proteínas constituyentes (nucleoporinas) y proteínas de transporte asociados, algunos de los cuales son independientes de transporte clásica [1], [2]. Por consiguiente, puede razonablemente la hipótesis de que son puntos de contacto clave en condiciones de células patológicas en las que el crecimiento celular anormal es una característica central.
La proteína Tpr (para la región de promotor translocado) y sus homólogos son un componente conservado en el lado nuclear de NPC . En los mamíferos Tpr es una proteína estructural 267-kDa con un dominio largo N-terminal que se asocia en un dímero para formar un paralelo, dos de cadena-espiral de la bobina. El dominio C-terminal es muy ácido y se prevé que sea estructurado [3]. En células de mamíferos Tpr se limita a las fibrillas nucleoplasmic de la APN y se ha sugerido que actúa como el principal elemento arquitectónico de la cesta nuclear [4], [5]. Mamíferos TPR está atado a la APN a través de interacciones con Nup153 [5], [6], [7], [8]. Muchas funciones han sido atribuidas a Tpr y sus homólogos en diferentes especies, además de un papel en la arquitectura de la APN. Estos incluyen el control de la exportación de ARNm [9], [10], la exportación de proteínas nucleares [4], [11], la organización de la cromatina telomérica en silencio y control de la longitud del telómero [12], [13], [14]. Además, Drosophila y TPR humana han demostrado estar involucrados en el control de eje de control [15], [16], [17] y TPR humana en el control de Erk2 translocación núcleo-citoplasma [18].
TPR homólogos en la levadura, Mlp1p-Mlp2p, están implicados en la unión de SUMO-proteasa Ulp1p con NPC [19], [20]. Esta interacción funcional parece ser conservadas en Arabidopsis thaliana entre ESD4 y NUA, que son homólogos de Ulp1p y Tpr, respectivamente [21]. Sumoylation corresponde a la conjugación posterior a la traducción de SUMO (pequeña proteína modificador relacionados con ubiquitina) para un residuo de lisina específico en una proteína diana. Sumoylation está mediada por una reacción enzimática que implica sucesivamente en cascada una enzima o E1 SUMO-activación y una única enzima E2 conjugación de SUMO-, Ubc9. SUMO modificación es reversible ya que las proteasas SUMO-específica pueden desconjugar la fracción SUMO de las proteínas modificadas que sugieren que sumoylation proteína está regulada de forma dinámica en las células [22], [23]. Entre los SUMO-proteasas relacionadas con Ulp1p que se han caracterizado en los mamíferos, SENP1 y SENP2 muestran la mayor similitud con la levadura Ulp1 y también están asociados con la envoltura nuclear. Ulp1p y SENP2 comparten la propiedad de ser dirigido a la APN por sus no catalíticos N-terminal de dominios [24]. Sin embargo, en los vertebrados, el N-terminal de dominio NPC-focalización en SENP2 interactúa con el dominio C-terminal en Nup153, pero no con Tpr [25], [26].
senescencia celular se describió primero como " senescencia replicativa "debido al limitado tiempo de vida de los fibroblastos diploides humanos in vitro [27]. Los estudios en células de cáncer han demostrado que, a pesar del hecho de que son capaces de dividirse indefinidamente, un estado que se asemeja estrechamente la senescencia replicativa puede ser inducida de forma aguda por diversos estímulos tales como agentes quimioterapéuticos y radiación. por lo tanto, lo que representa otro programa de célula, además de apoptosis, que puede limitar la proliferación celular [28], [29]. Las células senescentes se caracterizan por el tamaño de celda ampliada, aplanada morfología, la incapacidad para sintetizar ADN, y la expresión de asociada a la senescencia (SA) -β-galactosidasa, el biomarcador de la senescencia [30].
Presentamos aquí que TPR es crítica para la proliferación celular y que Tpr agotamiento conduce a un fenotipo de senescencia-como que es dependiente de p53. Además, los impactos TPR regulación a la baja en la exportación nuclear de las proteínas con una secuencia de exportación nuclear CRM1 dependientes (NES). Los niveles de Nup153 y función SENP2 en el poro nuclear también se ven afectados. Como consecuencia se observaron unos cambios sustanciales en las características del SUMO-1 conjugación en la APN y dentro de la célula.
Resultados
TPR caída induce la detención G0-G1 y un fenotipo senescente en células HeLa
TPR recientemente se ha descrito que tener varias funciones diferentes, pero su papel en el ciclo celular, el destino y la proliferación celular Nunca se ha evaluado completamente. por lo tanto se investigó el efecto de agotamiento Tpr en el ciclo celular usando siRNAs dirigidos Tpr en células HeLa. Se encontró que el nivel de proteína Tpr se redujo específicamente después de 48 horas de tratamiento con cualquiera de los dos siRNAs sintéticos utilizados, como se muestra por análisis de transferencia de Western de extractos celulares totales de células HeLa tratadas (Fig. 1A y S1A).
Las células HeLa sembradas en placas de 24 pocillos a 5 10
-4 células por pocillo se trataron con TPR o siRNAs simuladas. 1A. 48 horas después del tratamiento siRNA como se indica en la parte superior de la figura, un extracto de células se prepararon y analizaron mediante transferencia de Western usando Mab anti-Tpr 203-37; tubulina se utilizó como control de carga. 1B. imagen brillante de campo (panel derecho) y la imagen confocal (panel izquierdo) de las células HeLa marcadas con un anticuerpo monoclonal anti-TPR después de 2 días de la transfección con TPR o simulacro de siRNA. Barra de escala: 5 micras. 1C. Curva de crecimiento de las células HeLa transfectadas con TPR, simulacros de siRNA o no transfectadas: control (Ctrl). 1D. FACS perfiles representativos de siRNA modelo de tratamiento (panel izquierdo), las células tratadas TPR siRNAs (centro) y las células no transfectadas o control (derecha). células fijados con etanol se incubaron con PI y se analizaron por FACS para la ploidía. El número de células se representa en el eje y contenido de ADN vertical en el eje horizontal. fases G0-G1 y G2-M se representan como picos primero y segundo a partir de el eje vertical, respectivamente. El dominio de rayas intermedio corresponde a la fase S. 1E. La inducción de la senescencia: las células se colocaron en placas a baja densidad y se trata con TPR o siRNAs simuladas. Después de 6 días, las células se fijaron y se tiñeron para la actividad de SA-β-gal a pH 6,0. Barra de escala: 20 micras. 1F. La cuantificación de células positivas SA-β-gal en los cultivos agotados de Tpr y se tiñeron para la actividad de SA-β-gal a pH 6,0. 1G-1H. U2OS células fueron transfectadas con siRNAs TPR o simuladas. 1G: Después de 6 días se fijaron las células y se tiñeron para la incorporación de BrdU y la actividad SA-β-gal a pH 6,0. Barra de escala: 15 micras. 1H: Después de 6 días, las células se marcaron con anticuerpos anti-anti-MacroH2A HP1γ y y DAPI. Barra de escala: 5 micras. 1I: las células A375 fueron transfectadas con siRNAs TPR o simuladas. Después de 6 días las células se fijaron y se tiñeron para la actividad de SA-β-gal a pH 6,0. Barra de escala: 15 micras
A continuación, se determinó la ubicación en células HeLa mediante microscopía confocal (figura 1B.).. secciones ópticas a través del centro del núcleo mostraron el patrón característico de punctuate nucleoporins en el NE. La exposición a los siRNAs dirigidos contra Tpr reduce drásticamente el patrón Tpr punctuate en el NE (Fig. 1B). Desde TPR fue eficiente el regulado en estas condiciones, hemos sido capaces de analizar su papel en el crecimiento celular y la viabilidad. Se encontró que el tratamiento con una alteración de la proliferación celular Tpr siRNAs en comparación con células tratadas con siRNA falsos (Fig. 1C). Para investigar si esto fue debido a la proliferación de células detenido o muerte celular, las células se trataron con Anexina-V y yoduro de propidio para etiquetar los núcleos de las células muertas y las células se analizaron por fluorescencia de células activadas (FACS). No se observó diferencia bruto entre las células tratadas con ARNsi Tpr y los controles, lo que indica que el defecto de crecimiento no era debido a la apoptosis (datos no presentados).
Para caracterizar adicionalmente el efecto de Tpr caída en la proliferación celular, analizamos la distribución del ciclo celular de las células y los controles tratados con siRNA Tpr midiendo su contenido de ADN por FACS. Hemos observado que simulacro de transfección siRNA no afectó el ciclo celular de las células HeLa en comparación con las células no tratadas. Por el contrario, el ciclo celular fue detenido en la fase G0-G1 en las células desmontables TPR como se muestra en la Fig. 1D. Aproximadamente el 46% del control transfectadas y las células no transfectadas (2 días después de la transfección) estaban en la fase G0-G1 del ciclo celular, mientras que 69% de las células Tpr desmontables estaban en G0-G1. Al mismo tiempo, aproximadamente el 37-38% de las células de control progresó a la fase S en comparación con sólo 16% de las células Tpr desmontables (Fig. 1D). La misma proporción de las células se observaron en la fase G2-M en todas las tres condiciones. Se obtuvieron resultados similares con las dos secuencias Tpr siRNA (Fig. S1B).
A continuación, realizó un ensayo de formación de colonias como una medición independiente del defecto proliferación desencadenada por agotamiento Tpr. Una disminución sustancial (36%) en el número de colonias era evidente cuando las células fueron transfectadas con siRNAs Tpr comparación con las células falsamente transfectadas (Fig. S1c). Estos resultados sugieren que la transfección de células HeLa con TPR siRNAs redujo de manera drástica la proliferación de células tumorales.
Un examen más cuidadoso de las células tratadas con siRNA TPR demostró que una fracción de ellas tenía un fenotipo más bien "graves" en el que tenían la aparición de la senescencia con un citoplasma groseramente expandida. Esto nos llevó a cabo más investigaciones se centraron en esta respuesta en particular. En los ensayos de RNAi transitoria, el curso temporal de agotamiento efectivo de la proteína diana es no más de cuatro días, mientras que desmontables células TPR fueron detenidos en G0-G1. Mientras tanto las células no transfectadas continúan dividiéndose rápidamente y superar a las células que no se dividen. Por lo tanto, hemos establecido las condiciones bajo las cuales se sembraron las células a baja densidad (5,10
4 a 10
5 por pocillo en una placa de 6 pocillos-) para minimizar el efecto del crecimiento excesivo de células no transfectadas.
los experimentos en estas condiciones mostraron que una gran fracción de la población comenzó a cambiar la morfología de 3-4 días después de la transfección: se ampliaron las células y aplanado (Fig 1E.). Una prueba importante para la senescencia es la actividad SA-β-galactosidasa medida a pH ácido [30] y 6 días después de la transfección, la mayoría de las células alargadas y aplanadas eran β-gal positiva y de color azul (aproximadamente 40%) en los pocillos desmontables TPR , mientras que las células azules como senescentes eran raros (alrededor de 10%) en el tratado de forma simulada de células (Fig. 1F).
Tpr siRNA desmontables senescencia inducida también en otras dos líneas de células tumorales, U2OS, una célula de osteosarcoma humano línea, y las células de melanoma humano A375 (Fig. 1G-1I). tinción BrdU mostró que las células positivas SA-β-galactosidasa fueron negativas BrdU (Fig. 1G). Además, las células y los controles U2OS tratadas con siRNAs Tpr se marcaron con anticuerpos específicos para la variante de la histona macro-H2A y HP1γ, dos marcadores de constitutiva heterocromatina de la SAHF (senescencia asociado focos heterocromatina) que se identificó por primera vez en los fibroblastos humanos senescentes [31] , [32]. Muchos macro-H2A y HP1γ focos positivos y colocalizing se observaron en U2OS células senescentes núcleos, mientras que estaban ausentes en los núcleos de control. DAPI puntos más brillantes que indican heterocromatina colocalized con macro-H2A y etiquetado HP1γ se pueden ver en la Fig. 1H.
Tpr agotamiento induce la acumulación nuclear de p53
A medida que la vía de p53 con frecuencia está involucrado en el bloqueo de desarrollo del tumor mediante la activación de la senescencia celular o apoptosis en respuesta al estrés que es importante para evaluar el estado de p53 de células cuando Tpr se agota.
primero utiliza la inmunocitoquímica para analizar la distribución de p53 y, al mismo tiempo estudió el efecto de agotamiento Nup153 ya que esto se ha demostrado que deslocalizar Tpr del poro nuclear hacia el interior nuclear. Como se muestra en la Fig. 2A, la señal de p53 apareció etiquetado punctuate tan intensa en los núcleos de las células y Tpr- Nup153- agotados. No se observó señal en las células control. En comparación, mientras que el agotamiento de Nup133, un nucleoporin andamio que juega un papel importante en la estructura de poro nuclear y la función, no induce ninguna acumulación nuclear de p53 [33], tal acumulación se observó en células U2OS-agotado Tpr (datos no mostrados) . Estos resultados muestran que el agotamiento Tpr o mislocalization conducir a la acumulación nuclear de p53.
2A. Análisis de la distribución de p53 en células HeLa por inmunofluorescencia. Panel superior: células HeLa fueron transfectadas con TPR, Nup153 y siRNAs simulacros, como se indica a la izquierda; Panel inferior: células HeLa fueron transfectadas con siRNAs Nup133 y simulacros. Las células fueron fijadas en el día 2 después -transfection y se marcaron con un anticuerpo anti-TPR (paneles de la parte superior izquierda) o anti-Nup133 (panel inferior izquierdo) y un anti-p53 (arriba a la derecha y paneles inferiores). 2B. de células Hela células enteras de proteínas lisados se separaron mediante SDS-PAGE y a inmunotransferencia con anticuerpos específicos para Tpr, p53, p21, p16 y tubulina como se indica en la figura. 2C. Los lisados de proteínas de células enteras de células U2OS tratadas con Tpr, TPR + p53 o siRNAs de control (Mock) se separaron mediante SDS-PAGE y a inmunotransferencia con anticuerpos específicos para Tpr, p53, p21 y tubulina como se indica en la figura. 2D. Co-agotamiento de p53 y Tpr invierte la inducción de senescencia. Las células fueron transfectadas con mock, TPR, p53 o p53 y Tpr en combinaciones como se indica. La concentración de siRNA final fue 100 nm en cada caso y la indemnización se hizo con siRNAs simuladas. Las células se marcaron para SA-β-galactosidasa a los 6 días después de la transfección y el resultado se da como el porcentaje de células positivas SA-β-galactosidasa en cada uno de los tres experimentos independientes.
La ciclina inhibidor de la quinasa dependiente de ciclinas (CDK) p21 es elevada en muchas condiciones estresantes y está regulado transcripcionalmente por p53. Por ello, investigó las consecuencias del agotamiento de TPR en los niveles de p53 y p21. Los niveles de p53 y p21 eran hasta reguladas en las células Hela-agotado TPR (Fig. 2B) y células U2OS (Fig. 2C). Además, cuando se evalúan en los extractos de células, donde se agotaron tanto Tpr y p53, la acumulación de p21 se ve que es menor que con Tpr siRNAs solo (Fig. 2C). Esta observación indica que parte de la acumulación de p21 observado es debido a la activación de p53. Los niveles de p16 inhibidores de CDK
INKA (Fig. 2B) y cyclinD1 también se incrementaron en las células HeLa-agotado TPR (datos no mostrados).
Por último, con el fin de demostrar formalmente el papel desempeñado por p53 en la mediación de la inducción de la senescencia en células agotadas TPR, que co-agotado tanto el TPR y el p53. El derribo tanto Tpr y p53 como resultado una reversión sustancial del fenotipo de senescencia tal como se evaluó por el porcentaje de células SA-β-galactosidasa-positivas (Fig. 2D).
Tpr agotamiento interfiere con la exportación nuclear NES dependiente
se ha sugerido que los bajos niveles de estado estacionario de p53 en las células normales, es decir, en ausencia de estrés celular, el resultado de la exportación continua Crm1 dependiente nuclear [34] y la degradación citosólica posterior de p53. Además, se ha descubierto recientemente TPR para interactuar con Crm1 en un complejo trimérico de exportación [11]. Por tanto, podemos plantear la hipótesis de que la TPR conduce a la acumulación nuclear de p53 y la estabilización mediante el bloqueo de la exportación nuclear.
Para probar esta hipótesis se utilizó por primera vez el constructo pSTAT1-NES-GFP, que codifica los residuos 367-427 de STAT1 humana que confiere actividad NES [35], para evitar actos normativos adicionales que interfieren con la inhibición de la exportación nuclear CRM1 dependientes. Esta construcción fue co-transfectadas con TPR, Crm1 y el control de siRNAs para sondear NES dependientes de la exportación. Como se muestra en la Fig. 3A, la distribución de la señal de GFP en células vivas 48 horas después de la transfección demostró que Crm1- y TPR-agotamiento llevaron a la retención nuclear sustancial de la NES-GFP construir mientras que GFP se mantuvo principalmente citosólico en las células tratadas de forma simulada. Después las células se permeabilizaron y se marcaron con anticuerpos CRM1 y TPR para comprobar la eficiencia de agotamiento (Fig. 3B).
3A-3B. Distribución de GFP en células co-transfectadas con el control de siRNAs (simulacros) STAT1-NES-GFP y TPR, o Crm1. 3A: distribución de GFP se analizó en células vivas. Los núcleos se etiqueta con Hoechst 33342. barra de escala: 10 micras. 3B: células fueron entonces permeabilizaron y se marcaron con anticuerpos específicos para Tpr y Crm1 y DAPI para el ADN. Panel superior: el agotamiento y el control TPR; Panel inferior: el agotamiento y el control Crm1. Barra de escala: 10 micras. 3C-3D: TPR agotamiento retrasa exportación nuclear de NFkB. células HeLa fueron transfectadas con siRNAs Tpr o simulacros de 2 días antes de la inducción NFkB. Transfectadas y las células de control se incubaron con TNF 100 UI /ml durante 40 min. entonces TNF se eliminó a partir del medio y las células se mantiene fijo o para otro 1h30 en medio fresco antes de la fijación. 3C: La cuantificación de la señal de NFkB: Todas las imágenes se adquirieron con la misma ampliación y la exposición y la señal de NFkB se cuantificó utilizando la misma área de superficie en los núcleos y citoplasma de las células en las distintas condiciones experimentales utilizando OpenLab3.1.2. La señal citosólica se representó frente a la señal nuclear y la desviación estándar se calculó utilizando Microsoft Excel. Las barras de error representan la desviación estándar. Tenga en cuenta que la citosólica a la proporción de señal nuclear es muy similar en las células de control antes del tratamiento TNF y 1h30 después de la eliminación de TNF. Esto era como se esperaba y se debe a NFkB completamente de volver al citoplasma en este momento. 1h30 después de la eliminación del TNF citosólica de relación señal nuclear era aproximadamente un 25% menor en las células agotadas TPR que en las células control. 3D: Inmunofluorescencia etiquetado de NFkB y TPR 1h30 después de la eliminación de TNF en las células agotadas TPR y control. Las células fijadas se marcaron con un anticuerpo de conejo anti-NFkB y anti TPR-MAB 203-37.
Una NES CRM1 dependientes funcional también se requiere para la exportación nuclear mediada por IkappaBepsilon que controla el núcleo-citoplasma distribución y después de la inducción aclaramiento nuclear de las proteínas NFkB /Rel [36]. Para evaluar mejor el efecto del agotamiento del TPR en la exportación de NES-nucleares de una proteína endógena, las células HeLa se transfectaron primero con TPR o siRNAs simulacros de dos días antes de la inducción por el TNF NFkB. Como se muestra en la Fig. 3C-3D, TPR agotamiento retrasa el aclaramiento de NFkB del núcleo en comparación con las células tratadas simuladas. Vale la pena señalar que la acumulación de NFkB en el núcleo después del tratamiento con TNF no fue diferente en las células tratadas maqueta y TPR-siRNAs (Fig. 3C).
A continuación, tratamos de determinar si TPR agotamiento afecta a los niveles y distribución de CRM1 , o viceversa. Para ello tenemos células HeLa transfectadas con siRNAs dirigidos contra TPR y, Crm1, o células HeLa transfectadas de manera simulada, y 48 horas más tarde se trataron las células con anticuerpos Tpr- y CRM1 específicos. El análisis de inmunofluorescencia para la expresión Crm1 en control y células knock-down CRM1 mostró un aumento en el nucleoplasma y envoltura nuclear de las células transfectadas con siRNA Crm1 reducida. También TPR expresión se redujo sustancialmente en las células tratadas con siRNAs TPR. Por el contrario, no apareció la expresión Crm1 a ser afectados por el agotamiento de TPR y TPR no se vio afectada en Crm1 células knock-down (Fig. S2A-B).
TPR impactos de agotamiento en la expresión y distribución de Nup153 y SENP2 en la cesta nuclear
Para evaluar mejor el papel de la RPT en la organización del poro nuclear y la función, hemos examinado más detenidamente la relación entre el TPR y el Nup153 mediante la medición de sus niveles en extractos totales de células transfectadas con siRNAs TPR o Nup153 . Como se muestra por análisis de transferencia de Western de extractos de células totales (Fig. 4A), el tratamiento de células con Nup153 siRNAs condujo a la desaparición casi completa de Nup153 y una marcada disminución en Tpr. Esta disminución en los niveles de TPR era consistente con estudios anteriores que muestran que Tpr se mislocalized al interior nuclear en las células Nup153 desmontables [8]. Del mismo modo, el tratamiento con Tpr siRNAs condujo a una marcada disminución en Tpr y una señal de Nup153 muy reducida (Fig. 4A). A continuación confirmó esta observación por análisis de inmunofluorescencia en células HeLa tratadas con Tpr siRNAs y etiquetados con anticuerpos dirigidos contra diferentes componentes de la envoltura nuclear. El marcaje con un anticuerpo anti-emerina y el anticuerpo que reconoce todas las mAb414 nucleoporinas FG-repeat-que contienen incluyendo Nup153 no se modificó groseramente (Fig. 4B-4C). Por el contrario, hemos encontrado que el etiquetado con un anticuerpo anti-Nup153 específica se redujo (Fig. 4B-4C). Llegamos a la conclusión de estas observaciones que TPR agotamiento afecta específicamente a nivel de proteína Nup153 en el NE.
4A. Las células HeLa fueron transfectadas con fingida, TPR o Nup153 siRNAs tal como se indica en la parte superior. Lisados de células enteras fueron analizados 2 días después de la transfección por inmunotransferencia utilizando anticuerpos dirigidos contra Tpr, la repetición anti-FG nucleoporin mAb414 para etiquetar Nup153 y NUP62 y anti-tubulina como control de carga. 4B-4C. Nup153 expresión se redujo específicamente en las células agotadas TPR. células HeLa se trataron con TPR2 o siRNAs simuladas durante 2 días. 4C. Las células se fijaron y se marcaron con un anticuerpo anti-Tpr y anti-emerin, anti-mAb414 o anticuerpos anti-Nup153. Barra de escala: 15 micras. 4D. Detalles de etiquetado mAb414 y Nup153. Barra de escala: 5 micras. 4D. Análisis de la expresión SENP2 en extractos nucleares de 293 células tratadas con Tpr, SENP2 y siRNAs simuladas por análisis de transferencia Western. TRFII se utiliza como control de carga.
Teniendo en cuenta que el agotamiento de TPR altera la distribución Nup153 en el poro nuclear y que Nup153 ata SENP2 a la APN, la hipótesis de que TPR puede tener un impacto en los niveles de proteína SENP2 y función. Para probar esta hipótesis, se evaluó el efecto del agotamiento del TPR en SENP2. En primer lugar, dado que ningún anticuerpo está disponible para observar SENP2 endógeno en células fijadas, se analizaron los niveles de SENP2 en extractos nucleares de células agotadas en TPR, Nup153 o SENP2 y en las células agotadas simuladas. agotamiento Tpr en HeLa y células 293 fue acompañada por una reducción en SENP2 a niveles muy similares a los observados en los extractos de SENP2-agotado. Luego de comparar los diferentes niveles de proteína, que supervisó Nup133 y TRF2 como control de carga para los extractos nucleares (Fig. 4D y s3a). El agotamiento de Nup153 indujo de manera similar una reducción en SENP2 (datos no mostrados).
TPR agotamiento afecta Sumoylation
El hallazgo de que el agotamiento de TPR afecta SENP2 nos impulsó a abordar la cuestión de si el agotamiento de TPR podría interferir con la Sumoylation de otras proteínas. Con el fin de investigar los cambios en el Sumoylation general de proteínas, las células HeLa se trataron con Tpr, SENP2 y siRNAs de control y de extractos nucleares y citoplásmicos fueron analizados y comparados por transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-SUMO-1. Blots de extractos nucleares mostraron que la represión SENP2 provocó una acumulación de SUMO-1 de alto peso molecular como se esperaba para una disminución de la actividad SUMO-proteasa. Sin dicha acumulación se observó en las células transfectadas de manera simulada. Por el contrario, las células agotadas TPR mostraron menor Sumoylation en general que los siRNA en comparación células transfectadas (Fig. 5A). Se obtuvieron resultados similares en U2OS y las células 293 (Fig. S3B y datos no presentados). En consecuencia, se vio libre de SUMO-1 que se acumulan en las células agotadas TPR (Fig. S3C).
5A-5B. El análisis del nivel general de Sumoylation en las células transfectadas con TPR, Nup153, SENP2 y siRNAs simuladas. 5A. Los extractos nucleares de células tratadas siRNAs se prepararon y analizaron mediante transferencia de Western usando los anticuerpos como se describe a la izquierda de la figura. RPB1 se utilizó como control de carga. 5B. Análisis de RanGAP1 Sumoylation. extractos citoplasmáticos de Tpr, Nup153, SENP2 y las células tratadas con siRNAs simulacros se prepararon y analizaron mediante transferencia western utilizando un anticuerpo anti-RanGAP1 reconociendo tanto sumoylated y formas no sumoylated de RanGAP1 y con tubulina como control de carga. 5C: SUMO-1 siRNA tratamiento anula TPR senescencia agotamiento inducido en las células HeLa. células HeLa fueron transfectadas con Tpr, SUMO-1, TPR y SUMO-1 y siRNAs simuladas. Después de 6 días, las células se fijaron y se tiñeron para la actividad de SA-β-gal a pH 6,0. Se presenta una imagen representativa de cada condición. Barra de escala:. 15 micras
RanGAP1 (Ran-GTPasa activación de la enzima 1) es una proteína abundante sumoylated y la mayoría de los anticuerpos anti-RanGAP1 detectar la forma modificada-SUMO-1 y el RanGAP1 libre de SUMO, la migración de alrededor de 80 kDa y 70 kDa, respectivamente. por tanto, hemos examinado el efecto del agotamiento del TPR en la distribución y el nivel de expresión y de Sumoylation RanGAP1. La fracción de RanGAP1 libre de SUMO detectado por este anticuerpo se incrementó en extractos citosólicos de Tpr- y SENP2-siRNAs tratados en comparación con tratados de forma simulada células HeLa (Fig. 5B) y en U2OS extractos de células enteras (Fig. S3 B). En la fracción de extracto nuclear, solamente SUMO-1-RanGAP1 se detectó y se encontró que ser aumentado en Tpr- y células tratadas SENP2-siRNAs en comparación con las células tratadas burlarse cuando se detecta con anticuerpos anti-anti-RanGAP1 SUMO-1 y, con el aumento siendo más pronunciada en las células tratadas con Tpr que en las células SENP2 tratados (Fig. 5A).
Hasta ahora, el papel de Sumoylation proteína en la inducción de la senescencia sólo se ha estudiado en fibroblastos normales. Hemos comprobado que el agotamiento de SENP2 podría inducir la senescencia en células U2OS en nuestro entorno experimental (Fig. S3D). Para evaluar mejor la contribución de la modificación vía SUMO-1 al fenotipo de senescencia inducida por el TPR en las células cancerosas, se realizó de forma paralela caída de ARNi de la RPT, SUMO-1 y combinaron de SUMO-1 y TPR. Después de 6 días, se fijaron las células y se analizaron para la tinción SA-β-galactosidasa. El número total de células era dramáticamente diferente entre la sola condición Tpr y las otras dos condiciones. Cuarenta o 50 campos fueron contados para cada condición: el número de campos que contienen células de color azul y el porcentaje de espacio ocupado por células azules agrandados fueron evaluados (Tabla 1). De hecho, para-1 SUMO agotadas las células, la mayoría de los campos se llenaron con células en sentido densidad de saturación que la proliferación celular no se detuvo. Se observaron muy pocas células azules: 3 (en un campo) a aproximadamente 20 células azules o así podrían enumerarse en sólo 7 campos, y negativas las restantes. Al final, los resultados eran tan diferentes que no fue posible incluirlos en la Tabla 1. Como cuestión de hecho, había menos células positivas SA-β-galactosidasa en las células agotadas SUMO-1 que en el control simulado. Los resultados descritos en la Tabla 1 muestran que la población en su conjunto se vio afectada por el agotamiento de TPR mientras que las células con un fenotipo senescente-como se mucho más dispersos en el TPR más SUMO-1 condición. Además, con pocas excepciones, la mayoría de las células azules no mostraron un fenotipo senescente completa, ya que no se aplanan y la tinción SA-β-galactosidasa fue débil (Fig. 5C).
Discusión
Hemos demostrado en este estudio que agotan TPR es suficiente para inducir un fenotipo senescente-como en líneas celulares tumorales. El fenotipo de senescencia puede ser explicado por la acumulación de varias proteínas de crecimiento supresores actúan sobre la transducción de señales mitogénica y la regulación del ciclo celular. Dos rutas de señalización principales, p16INK4a-pRb y p14ARF-p53, son responsables de la ejecución de la detención de proliferación que caracteriza a la senescencia [37], [38]. La vía de Rb-p16 es defectuoso en ambas líneas celulares HeLa y U2OS pero p53 en células U2OS y HeLa y p16 en las células HeLa se incrementan después de Tpr caída. P53 acumula en el núcleo y también lo hace p21 /CIP1, un efector aguas abajo que está implicado en varias formas de control de G1 punto de control. Además, parte de la p21 /Cip1protein regulación depende de la presencia de p53
En las células normales, p53 es un objetivo de la vía ubiquitina-proteasoma:. Los bajos niveles de p53 resultado de la continua Mdm2- mediada por la exportación nuclear de p53 para la degradación citosólica. En las células HeLa, la exportación nuclear es también necesario para la degradación de p53 mediada por el virus del papiloma humano (HPV) 18 E6 proteína [39]. Mostramos aquí que el agotamiento de TPR lleva a la retención nuclear de un reportero GFP que alberga la secuencia NES de STAT1 y retrasa el aclaramiento nuclear después de la inducción de NFKB después de la eliminación de TNF en células HeLa [36], dos acontecimientos que dependen del factor de exportación Crm1. Tpr se ha descubierto recientemente para interactuar con Crm1 en presencia de un péptido o un péptido NES NES más RanGTP como en una exportación trimeric complejo [11]. Aunque los detalles moleculares de esta interacción no se han caracterizado, además, la ausencia de la RPT es que pueda perjudicar la función de Crm1 en las exportaciones nucleares. Se encontró que el TPR knock-down débilmente afecta a los niveles de CRM1 en experimentos de Western blot, pero, obviamente, no impacto en los niveles CRM1 como se mide utilizando anticuerpos específicos de células fijadas. Sin embargo, ha sido previamente informado de que incluso una ligera regulación a la baja de Crm1 resulta en defectos mencionados en la exportación nuclear [40]. inhibición Crm1 también redujo la proliferación celular e indujo alteraciones celulares profundas y apoptosis (datos no mostrados), como se informó anteriormente [41]. por tanto, estamos a favor de la hipótesis de que la principal consecuencia del agotamiento de TPR es la acumulación nuclear y la activación de p53 por la inhibición de la exportación nuclear.
En apoyo de esto, leptomycin B (LMB), un inhibidor de Crm1, ha sido demostrado reducir la capacidad de E6 para degradar p53 en células de carcinoma cervical [39], [42] y la causa: (i) la retención de STAT1-NES construir en el núcleo [34], [35], (ii) acumulación nuclear y la activación de