Extracto
Plakoglobin (PG) es una proteína que se asocia con el armadillo ambos cadherinas clásicas y desmosómicas, sino que se concentra principalmente en los desmosomas maduros en los epitelios. Aunque se han reportado niveles reducidos de PG en los tumores de próstata refractario localizadas y de la hormona, la importancia funcional de estos cambios es desconocida. Aquí mostramos que la expresión de PG se reduce en muestras de una matriz de tejido del tumor de próstata e inversamente correlacionada con el avance potencial tumor en 7 líneas celulares de CaP. ectópica expresó PG mejorada resistencia adhesiva intercelular, y atenuado la motilidad y la invasión de líneas celulares agresivos, mientras que el silenciamiento PG en las células menos tumorigénicas tenido el efecto contrario. PG también regula la adhesión célula-sustrato y la motilidad a través de la matriz extracelular (ECM) la inhibición dependiente de Src quinasa, lo que sugiere que los efectos de PG no se debieron únicamente al aumento de la adhesión intercelular. PG silenciamiento dio como resultado niveles elevados de la proteína vitronectina ECM (VN), y la exposición de las células a la actividad Src VN inducida PG-expresión. Además, el aumento de los niveles de VN y la activación de Src en correlación con la disminución de expresión de PG en los tejidos de los pacientes. Por lo tanto, PG puede inhibir Src manteniendo VN baja. Nuestros resultados sugieren que la pérdida de adhesión intercelular debido a la expresión PG reducida podría ser exacerbado por la activación de Src a través de un mecanismo de PG-dependiente. Por otra parte, PG baja regulación durante la progresión del CaP podría contribuir a la promoción VN-dependiente conocida de CaP invasión y metástasis, lo que demuestra una interacción funcional entre los desmosomas novela adhesión célula-célula y célula-sustrato ejes de señalización en cáncer de próstata adherencia.
Visto: Franzen CA, Todorović V, Desai BV, Mirzoeva S, Yang XJ, verde KJ, et al. (2012) La proteína desmosómicas Armadillo adhesión celular Plakoglobin Regula el cáncer de próstata y la motilidad a través de vitronectina dependiente de Src señalización. PLoS ONE 7 (7): e42132. doi: 10.1371 /journal.pone.0042132
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Enero, 2012; Aceptado: 3 Julio 2012; Publicado: July 30, 2012
Copyright: © Franzen y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer (NCI) CA90386 próstata SPORE subvención P50, Fundación Zell, el apoyo del Fondo Semilla Rosenberg (JCP), R01s CA122151, AR041836 y la dotación JL Mayberry (a KJG), Institutos nacionales de Salud de formación (NIH) subvenciones CA070085 T32 (a CAF y VT) y AR055444 F32 (a VT) y la Sociedad Americana del cáncer (ACS) beca postdoctoral PF-10-235-01-CSM (CAF). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la segunda causa de mortalidad por cáncer en los EE.UU. [1], debido principalmente a la forma de la enfermedad metastásica [2]. Las etapas iniciales de la metástasis de células tumorales implican la modulación de célula-célula y las propiedades adhesivas de células sustrato para facilitar el desprendimiento de células del tejido de origen y la invasión de los tejidos locales y distales [3]. La regulación por disminución de moléculas de adhesión célula-célula es una de las principales etapas en el proceso de la invasión tumoral de próstata local y distal. En particular, los cambios en la expresión y función de las cadherinas y sus proteínas asociadas han ganado atención como reguladores críticos de la progresión del tumor [4], [5]. La pérdida de la molécula de unión adherente, P-cadherina, es un evento temprano en la mayoría de los cánceres de próstata [6], [7], mientras que la expresión reducida de E-cadherina está conectado con una forma más avanzada y agresiva de la enfermedad [8]. Sin embargo, a pesar de su expresión en tejidos de próstata [9] - [11], se sabe poco sobre el papel de las cadherinas desmosómicas en la iniciación y progresión del CaP
Las alteraciones en la expresión de las proteínas cadherina-asociado en. la familia armadillo también se han relacionado con la progresión tumoral y /o supresión [12] - [14]. Una de estas proteínas es un pariente cercano de β-catenina llamado plakoglobina (PG, también conocido como γ-catenina), que puede unirse a ambos cadherinas clásicas y desmosomas, pero se encuentra principalmente en los desmosomas y es críticamente importante en la morfogénesis de la piel y el corazón [10]. PG ha sido reportado como un supresor de la tumorigénesis en el cuello del útero [15], la vejiga [16] y el cáncer de mama [17], y los datos clínicos indican que el PG es el regulado en los tumores refractarios localizadas y la mayor parte de la hormona en pacientes con cáncer de próstata [18] . Curiosamente, en algunos tumores refractarios de la hormona, una versión mutada de PG se ha observado en los núcleos que se correlaciona con el aumento de expresión Bcl2 y aumento de la supervivencia celular [18]. Si estos cambios observados en PG desempeñan un papel causal en la progresión del CaP no se ha determinado.
En trabajos anteriores, hemos demostrado que inhibe la motilidad PG queratinocitos, en parte a través de la regulación de la célula-célula y célula-componente de adherencia sustrato expresión [19], [20]. A través del análisis de muestras de tejido de pacientes con CaP y una serie de ganancias y pérdidas in vitro de estudios de la función, nuestros datos sugieren un modelo mediante el cual PG regula tanto las interacciones célula-sustrato y la adhesión célula-célula mediante la atenuación de la vitronectina (VN) dependiente de la activación de Src. Este es el primer informe que desmosómicas moléculas pueden regular las interacciones de cáncer de próstata con el microambiente extracelular. Además, nuestros datos plantean la posibilidad de que el PG baja regulación durante la progresión del CaP podría contribuir a la promoción VN-dependiente conocida de CaP invasión y metástasis al hueso [21].
Materiales y Métodos
Líneas celulares y células LNCaP Cultura y
son funcionalmente diferenciadas, las células sensibles a los andrógenos de la próstata humana adenocarcinoma derivadas de una metástasis de los ganglios linfáticos [22]. C4-2B células son un andrógeno-independiente, hueso derivado metastásico de células LNCaP [23]. células DU145 están moderadamente diferenciadas, células de adenocarcinoma de próstata humano andrógeno-inedpendent derivadas de una metástasis cerebral [24]. PC-3 células están pobremente diferenciado, las células de adenocarcinoma de próstata humano independiente de andrógenos derivados de una metástasis vertebral [25]. PC3-M es una variante muy metastásica de la línea celular PC-3 [26]. las células son células ARCAP andrógenos reprimido que expresan receptor de andrógenos funcional [27]. ARCAP
E células epiteliales son una variante de las células parentales ARCAP con baja tumorigenicidad y ARCAP
células M son una variante mesenquimales altamente metastásico de las células parentales ARCAP [28]. células PC3-M, las células LNCaP, las células PC-3 (todos los donativos del doctor Raymond C. Bergan, Northwestern University, Chicago, IL), las células DU145 (un regalo del doctor Lester F. Lau, Universidad de Illinois, Chicago, IL) y C4-2B células (un regalo del doctor RS Taichman, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI) se cultivaron en medio RPMI 1640 (Mediatech) que contiene suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS) (Invitrogen, Carlsbad , CA), 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (Mediatech). ARCAP
E y
células ARCAP M (Novicure) se cultivaron en medio MCap (Novicure) que contiene 5% de FBS, 100 unidades /ml de penicilina inactivado por calor, y 100 mg /ml de estreptomicina (Mediatech).
Reactivos y anticuerpos
pSrc (Y416) anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales (por Src Blot estudios de inmunofluorescencia y occidentales en líneas celulares) eran de Tecnologías de señalización celular (Danvers, MA). PSRC anticuerpos policlonales (para la tinción TMA), colágeno I anticuerpos policlonales eran de Abcam (Cambridge, MA). anticuerpos policlonales de pollo PG eran de Aves Labs (Eugene, OR). anticuerpo monoclonal GAPDH era de Millipore (Temecula, CA). de cabra anti-ratón de cabra y conjugado con HRP anti-conejo anticuerpos secundarios eran de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). HRP-conjugado de cabra anti-pollo anticuerpo secundario fue de Kirkegaard & amp; Perry Laboratories (Gaithersburg, MD). Vitronectina (VN) anticuerpo monoclonal, los anticuerpos policlonales de fibronectina, laminina ascitis monoclonales de fluidos, y VN partir de plasma humano fueron de Sigma. PP2 inhibidor selectivo Src era de Calbiochem (San Diego, CA). enzima dispasa II se obtuvo de Roche (Basilea, Suiza). PG siRNA piscina y el control de siRNA secuencia#2 no director se obtuvieron de Dharmacon (Lafayette, CO). caSrc adenovirus es un generoso regalo del Dr. Paul L. Stein (Northwestern University). conjunto Diff-Quik era de Dade Behring.
adenovirales Construye y Transducción
El sistema de envasado de adenovirus pAdEasy, proporcionado amablemente por el Dr. Warren G. Tourtellote (Universidad de Northwestern Feinberg School of Medicine) se utilizado para generar previamente caracterizado myc-etiquetados, de longitud completa PG humano [29] de acuerdo con los protocolos publicados [30]. las tasas de infección de la célula se controlaron usando la expresión de GFP en tándem con PG; al menos el 30% de las células re-plateado aún conservaba la expresión de GFP.
siRNA transfecciones
ARCAP
E, células LNCaP y C4-2B fueron cultivadas a 30% de confluencia, y luego fueron transfectadas con individual o un grupo de 4 interferente pequeño ON-TARGETplus de ARN (ARNsi) para PG humano o con la secuencia#2 de control no focalización (Dharmacon, Lafayette, CO) a la concentración final de 20 nM usando Dharmafect reactivo 1 transfección (Dharmacon) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. secuencias de siRNA PG utilizados fueron los siguientes: 5'-AGACAUACACCUACGACUC-3 '; 5'-UGAGUGUGGAUGACGUCAA-3 '; 5'-CCACCAACCUGCAGCGACU; 5'-UGUACUCGUCGGUGGAGAA-3 '.
arañazos Herida Ensayo
PC3-M y ARCAP
M células se sembraron en placas de 24 pocillos y se deja que se unan y propagación. Las células fueron transducidas con GFP o adenovirus que contiene PG. A las 24 horas después de la transducción, una herida cero se hizo por el rascado de la monocapa confluente con una punta de pipeta 20 l. Para los estudios de inhibición de Src, las células fueron tratadas con medio que contiene el inhibidor de Src PP2 o control de disolvente DMSO durante 24 horas antes de la herida cero está realizando. Las celdas eran imágenes inmediatamente después de la herida y 24 horas después de la herida. A las 24 horas después de la herida, las células se lisaron con tampón de muestra de urea (USB) y los lisados se utilizaron para probar para la expresión de PG. ARCAP
E y células C4-2B se sembraron en placas de 24 pocillos y se deja que se unan y propagación. Las células fueron transfectadas con el control o PG siRNA. Una herida cero se hizo 96 horas después de la transfección. Para los estudios de activación de Src,
células ARCAP E fueron transducidas con GFP-adenovirus o constitutivamente activa Src (caSrc) -adenovirus durante 24 horas antes de la herida cero están realizando. Las celdas eran imágenes inmediatamente después de la herida y 18 horas (células C4-2B) o 24 horas (ARCAP
células E) después de la herida. A las 24 horas después de la herida, las células se lisaron con USB y los lisados se analizaron mediante transferencia Western para la prueba de expresión de PG. El porcentaje de cierre de la herida se determinó utilizando el software ImageJ.
Matrigel invasión de ensayo
Se realizó el ensayo de invasión de Matrigel como se describe anteriormente [31] con las siguientes modificaciones. El pozo interior de insertos Transwell (0,8 micras; BD Biosciences) se recubrieron con 100 l de Matrigel membrana basal Matrix (BD Biosciences) y se dejó para permeabilizar a temperatura ambiente durante 1 h. Se retiró el líquido restante, y los filtros se lavaron con medio libre de suero y se dejó secar al aire. células de CaP fueron separadas de acuerdo a los protocolos de líneas celulares específicas (ARCAP
E, ARCAP
M, C4-2B, DU145 y PC-3 células fueron separadas utilizando tripsina, mientras que las células LNCaP y PC3-M fueron separadas usando el calcio secuestro) y se lavó con medio libre de suero, y 5 × 10
5 células se añadieron a la cámara de invasión interior. Las células se dejaron para invadir durante 24 h; células no invasoras se eliminaron de los pozos interiores utilizando un hisopo de algodón, y las células adherentes a la parte inferior de la membrana fueron fijadas y teñidas usando el kit de tinción Diff-Quik (Dade AG) invasores. Las células invasoras fueron enumerados por microscopio estéreo en posición vertical utilizando un objetivo de 10x (Nikon).
inmunotransferencia
ARCAP
células M, C4-2B y PC3-M se sembraron en 6- así platos y dejó que se unieran y propagación. Las células se transdujeron con adenovirus que contiene GFP-o PG-que contiene adenovirus, cosecharon 24 horas más tarde con USB y se sometieron a SDS-PAGE. Después de la transferencia a una membrana de nitrocelulosa, análisis de inmunotransferencia se realizó con anticuerpos contra PG, pSrc, Src, LN, FN, VN, y GAPDH. ARCAP
E y células C4-2B se sembraron en placas de 6 pocillos y se deja que se unan y propagación. Las células fueron transfectadas con siRNA PG o#2 secuencia de control de siRNA. Después de 96 horas, las células se lisaron con USB y se sometieron a SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, y después se sometieron a análisis de inmunoblot con anticuerpos contra PG, VN, FN, Col IV, y GAPDH. Cuantificaciones de las intensidades de banda se llevaron a cabo utilizando la herramienta Analizar los geles del software ImageJ.
Resistencia mecánica (dispasa) Ensayo
LNCaP, células C4-2B y PC3-M se sembraron en 6- así placas, y deja que se unan y propagación. Los cultivos se transdujeron con adenovirus que contiene GFP-o-PG que contiene adenovirus, y después de 24 horas se llevó a cabo el ensayo dispasa. Para los estudios de inhibición de Src, las células se trataron con medio que contiene PP2 (10 mM) o DMSO (control de disolvente) durante 24 horas antes de realizar el ensayo de dispasa como se describe [32]. Brevemente, los cultivos de células confluentes se lavaron con PBS y se incubaron con 2,4 U de dispasa /ml durante 30 min a 37 ° C. monocapas liberados fueron sometidos a una tensión mecánica suave, y luego se fijaron con formalina. Los fragmentos fueron contadas con un microscopio de disección (Leica, MZ6) como se describe [32] o fotografiada con una cámara Hamamatsu Orca digital (modelo C4742-95) y se analizaron usando el software de imágenes MetaVue (Molecular Devices). Los datos se expresan como promedio de fragmentos ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando
t
prueba de Student.
gota colgante Ensayo de agregación
El ensayo de la gota colgante se realizó como se describió anteriormente [32], con las siguientes modificaciones. Los cultivos de líneas celulares de CaP se separaron como se describe anteriormente, se centrifugaron, y se resuspendieron en el medio de cultivo apropiado. Gotas (20-l) de suspensiones de células fueron sembradas en la superficie interior de una tapa de placa de cultivo de 35 mm y se cultivaron durante 20 horas. Para limitar la evaporación, se añadieron 2 ml de PBS a la parte inferior de las placas de cultivo. Para comparar densidades similares de células suspendidas en la gota, 4 × 10
3 se examinaron las células. Para examinar la capacidad de las células para formar agregados después de 24 horas, las tapas de los recipientes de cultivo se invierten, y las gotas que cuelgan se aplanaron con un cubreobjetos de vidrio para la imagen. Para examinar la resistencia adhesiva de los agregados celulares, cultivos paralelos se trituraron 10 veces a través de una punta de pipeta 20-l (pre-aclararon con 0,1% Triton X-100 /PBS) a continuación, se enjuagó 3 veces en PBS antes de la imagen. Cinco campos aleatorios de imágenes de contraste de fase de cada gota que cuelga fueron adquiridos utilizando un microscopio invertido Zeiss Axiovert 200 con una cámara Zeiss Axiocam y el software Zeiss Axiovision. El número total de grupos de células se había contado a partir de las gotas que cuelgan por triplicado.
inmunofluorescencia
ARCAP
E, ARCAP
M, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3, y células PC3-M se hicieron crecer en cubreobjetos de vidrio, se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en metanol anhidro durante 2 min a -20 ° C. Posteriormente fueron incubadas con pollo anti-PG (1407) (1:1000) y el ratón anti-E-cadherina (HECD-1) anticuerpos (1:100) durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos primarios se visualizaron utilizando Alexa Fluor 350-, 488- y 568 de cabra conjugado con anticuerpos secundarios contra ratón, conejo e IgG de pollo (1:400), respectivamente. Los cubreobjetos se examinaron con un microscopio vertical modelo DMR Leica (Deerfield, IL), y las imágenes se capturaron con una cámara digital Hamamatsu Orca modelo C4742-95 (Bridgewater, NJ) y 7,6 Metamorph (Molecular Devices) software de imágenes.
tejido de microarrays de tinción, de imagen, e intensidad de fluorescencia Análisis
El microarray de tejido de próstata incluido en parafina (BC19021) que contiene 72 núcleos de 20 casos fue adquirido de los Estados Unidos Biomax (Rockville, MD), y se procesó para la tinción inmunohistoquímica como se describe [33]. La recuperación del antígeno se llevó a cabo por calentamiento de la lámina de vidrio a 95 ° C en tampón de citrato 0,01 M. La micromatriz se bloqueó en 2% de suero normal de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories) y 1% de BSA durante 60 min a 37 ° C, después se incubaron con anticuerpos primarios contra PG, VN y pSrc durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada. La micromatriz se incubó en anti-pollo secundaria AlexaFluor conjugado (633), ratón (488) y el conejo (568) anticuerpos durante 60 min a 37 ° C, y el cubreobjetos se montó en alcohol de polivinilo. PG, VN, y pSrc se visualizaron mediante microscopía confocal (Facilidad de imágenes de células, Northwestern University), en el plazo de 3 días de procesamiento. ajustes de adquisición idénticos se utilizan para todas las imágenes para asegurarse de que la intensidad de pixel de la imagen se pueden comparar. Las imágenes fueron tomadas a 40 aumentos, con al menos 4 imágenes por núcleo de tejido tomado. intensidades fluorescentes relativas se determinaron mediante el uso de software MetaMorph 7.6 (Molecular Devices) como se describe antes [34] con las siguientes modificaciones. Cada imagen en bruto, no saturado se establece en un rango de 16 bits (escala de 0 a 255 para baja y alta) y se thresholded inclusive. La función de la Medida de la rejilla se utilizó para seleccionar las regiones del tumor a ser analizados. Cada cuadrícula fue de 40 × 40 cuadrados (30,86 m
2 /cuadrado). La intensidad media de las zonas de umbral se calcula automáticamente por MetaMorph para cada cuadrícula. cuadrados de rejilla con una intensidad de 0 fueron excluidos del cálculo de la intensidad media para toda la red. La estadificación del tumor se ha caracterizado por EE.UU. Biomax, según la escala de TNM utilizado por UICC [35]. El tumor primario (T) se utilizó un criterio de estadificación para el cáncer de próstata como sigue: T1, Tumor clínicamente inaparente; T2, Tumor confinado a la próstata; T3, El tumor se extiende a través de la cápsula de la próstata; T4, tumor invade estructuras adyacentes distintas de las vesículas seminales. Descripción detallada de los tejidos utilizados para la micromatriz se puede encontrar en el sitio web de la empresa http://www.biomax.us/tissue-arrays/Prostate/BC19021. Además, el adenocarcinoma de próstata fue clasificado por un patólogo experto genitourinario (Ximing J. Yang) utilizando el sistema de clasificación de Gleason, que se basa únicamente en las características arquitectónicas de las células tumorales.
Métodos Estadísticos
experimentos de cultivo celular se llevaron a cabo con 3 o más repeticiones. Los valores se expresan como media con barras de error indican la SEM. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism versión 5.02 para Windows (San Diego, EE.UU.). Todas las pruebas estadísticas fueron de 2 caras. Se realizó la prueba t de Student para la comparación gráfica de barras. La regresión lineal se realizó para la línea gráficos que comparan la expresión de VN y PG y PG o pSrc, con el R cuadrado valor que representa la bondad del ajuste de la línea. p & lt; 0,1 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
PG es mislocalized y su expresión se reduce en las muestras de tejido de cáncer de próstata y líneas celulares
Varios informes en la literatura han sugerido. que la expresión de PG se reduce en muestras de CaP clínicos en comparación con tejido normal [18], [36], [37]. Sin embargo, si la modulación de la expresión de PG es responsable de cualquiera de los eventos fisiológicos y moleculares en el CP tumorigénesis aún no se ha estudiado de manera mecánica. Para abordar este problema y obtener una mejor comprensión de la relación entre la expresión de PG y la extensión de la invasión de tumores de próstata primario, un microarray de tejido CaP con 72 núcleos de 20 pacientes de cáncer de próstata se analizó para la expresión PG. Se ha observado una disminución en la expresión general de PG en todas las muestras malignas en comparación con el tejido normal, así como una desaparición de PG a partir de los bordes célula-célula donde es normalmente localizada (Fig. 1A). El análisis de la intensidad de fluorescencia reveló PG, en promedio, ~ 50% menos de PG en muestras de tumores primarios de todos los grados de Gleason y por etapas T1 a T3, en comparación con el tejido normal (Fig. 1B-C). Por otra parte, en los tumores invasivos T4 hubo una disminución adicional ~ 30% en PG (Fig. 1C). Estos resultados indican que la expresión de PG se redujo y mislocalized en el tejido de cáncer de próstata primario en comparación con el tejido prostático normal. Además, una mayor pérdida de PG en las muestras (T4) de tumores invasivos plantea la posibilidad de que PG desempeña un papel en la supresión de CaP invasión.
A-C. Un microarray de tejido de próstata se tiñó con un anticuerpo contra PG. Una imagen que muestra la expresión de inmunofluorescencia Representante PG en el tejido normal de la próstata (arriba) y el tejido T3 (parte inferior) de la próstata. Barra representa 50 micras. B. Cuantificación de la expresión PG en el tejido normal de la próstata en comparación con el tejido de los tumores de próstata con Gleason grado menor o igual a 6 (6 tumores), 7 (5), o mayor que o igual a 8 (33). expresión PG es alta en el tejido normal (negro) y se reduce en ~ 50% en el tejido tumoral de todos los grados de Gleason. La clasificación de Gleason fue realizada por el patólogo quirúrgico Ximing Yang. C. Cuantificación de la expresión PG en el tejido normal de la próstata en comparación con el tejido del tumor de próstata en estadio T. PG es altamente expresado en el tejido normal (negro) y la expresión es disminuida por ~ 40% en T1-T3 tejido tumoral de próstata en etapa y en casi un 70% en el tejido tumoral de próstata T4. La estadificación del tumor se ha caracterizado según la escala utilizada por la UICC TNM [35]. El tumor primario (T) se utilizó un criterio de estadificación para el cáncer de próstata como sigue: T1, Tumor clínicamente inaparente (3 tumores); T2, Tumor confinado dentro de la próstata (33); T3, tumor se extiende a través de la cápsula de la próstata (9); T4, tumor invade estructuras adyacentes distintas de las vesículas seminales (3). Además, hubo 8 normales muestras de tejido de próstata de la matriz. Los gráficos representan las medias +/- SEM. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,002; *** P & lt; 0,0005; **** P. & Lt; 0,0001, mediante la prueba de t pareada
A continuación, PG niveles de expresión y distribución fueron evaluados en un panel de siete líneas celulares de CaP que varían en sus propiedades oncogénicas. En general, las líneas celulares descritas en la literatura como que tiene más potencial metastásico (ARCAP
M, C4-2B, y PC3-M) exhiben varias veces la expresión de PG más baja que lo hizo líneas menos agresivos (LNCaP y ARCAP
MI). Mientras que las células DU145 moderadamente diferenciados expresan más PG que las otras líneas celulares, PG exhibió una localización citoplasmática y nuclear más difuso en lugar de concentrarse en las interfaces de célula-célula (Fig. 2A, B). Del mismo modo, las líneas agresivas ARCAP
M y C4-2B exhibieron tenue y difusa tinción para PG. Por último, la variante metastásica de la línea celular PC-3, las células PC3-M, expresó PG menos que las células PC-3 (2A Fig. B). Curiosamente, a pesar de que exhiben en general más bajos niveles de PG que las células PC3-M, las células C42B todavía muestran algunos tinción nuclear (Fig. 2B). En general, estos datos sugieren una tendencia a la disminución de la expresión de PG y una pérdida de la localización fronteriza célula-célula de PG en las líneas celulares de CaP agresivo.
A. líneas celulares de cáncer de próstata se lisaron y se sometieron a SDS-PAGE, seguido de inmunotransferencia con anticuerpos contra PG y GAPDH. los niveles de PG se determinaron mediante la normalización a los niveles de GAPDH para cada línea celular usando Image J. La inmunotransferencia muestra que la expresión de PG en líneas celulares de cáncer de próstata se correlaciona inversamente con el grado de agresividad de la línea celular. líneas celulares de cáncer de próstata B. se sembraron en cubreobjetos y se deja que se unan y propagación. La inmunofluorescencia se realizó utilizando anticuerpos contra PG para demostrar la localización de PG en ARCAP
E, ARCAP
líneas de células M, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3, y PC3-M. La inmunofluorescencia muestra la tinción más débil y una pérdida de la localización fronteriza célula-célula de PG en las líneas celulares más agresivas (ARCAP
M, C4-2B y PC3-M). Representantes de al menos tres inmunotransferencias independientes se muestran, con números que representan normalizaron los niveles de proteína GAPDH PG para la mancha se muestra. Todos los niveles de proteína PG se normalizaron a ARCAP
E niveles dentro de cada mancha. El nivel medio y la desviación estándar de los niveles de proteína de PG en el panel A es el siguiente: ARCAP
E 1.0, ARCAP
M 0,3 +/- 0,2, 1,5 +/- 0,5 LNCaP, C4-2B 0,5 +/- 0,2 , DU145 3.4 +/- 1.2, PC-3 1.0 +/- 0.4, PC3-M 0,5 +/- 0,2.
PG promueve la adhesión célula-célula de células de CaP
en vista del hecho de que un sello distintivo de cáncer invasivo es la capacidad de las células malignas para coordinar el debilitamiento de sus adherencias célula-célula con los cambios en las interacciones funcionales con el sustrato subyacente [3], el próximo investigó si la manipulación experimental de los niveles de PG (Fig. S1 y S2) afectados adhesión célula-célula en células de CaP. células PC3-M, células C4-2B, y las células LNCaP se transdujeron con adenovirus que expresa PG-y un ensayo de dispasa se realizó para medir la fuerza de adhesión intercelular (Fig. 3A). adhesión célula-célula, fue significativamente superior en todas las células transducidas con adenovirus que expresa PG-(PG OE) en comparación con las células transducidas con el control (GFP) de adenovirus (Fig. 3A-B).
A. imagen representativa de un ensayo de dispasa en células PC3-M después de la transducción con adenovirus PG OE o controlar adenovirus GFP. B. cuantificaciones de dispasa ensayos realizados por triplicado; LNCaP, C4-2B, o PC3-M células se sembraron en placas de 6 pocillos y se deja que se unan y propagación. Los cultivos se transdujeron con adenovirus que contiene GFP-(GFP) o PG-que contiene adenovirus (PG OE), y después de 24 horas se realizó el ensayo de dispasa. La sobreexpresión de PG en todas las líneas celulares 3 refuerza la adhesión célula-célula. C. Las células LNCaP se sembraron en placas de 6 pocillos y se deja que se unan y propagación. Después las células se transfectaron con ARNsi de control o la piscina PG siRNA. El ensayo se realizó dispasa 96 horas después de la transfección. Represión de PG de expresión da como resultado un debilitamiento de la adhesión célula-célula en las células LNCaP. D. Imagen Representante de un ensayo de gota colgante en las células DU145 después de la transfección con el control o la piscina PG siRNA. E-F. La cuantificación de colgar ensayos de caída realizados por triplicado; células C4-2B y PC3-M fueron transducidas con GFP o adenovirus que contienen PG-(E), ARCAP E, LNCaP, DU145 y PC3 células fueron transfectadas con ARNsi de control o la piscina PG siRNA (F). ensayos de agregación se realizaron 24 h (E), o 96 h (F) después del tratamiento. Los gráficos representan las medias +/- SEM. * P & lt; 0,06; ** P & lt; 0,005; *** P & lt;. 0,0007, mediante el test t de Student pareado
Curiosamente, la sobreexpresión de PG en las células LNCaP, que ya expresan niveles sustanciales de PG, dio lugar a un nuevo aumento de la fuerza de adhesión intercelular y célula tinción de unión células beta de e-cadherina (Fig. 3B y Fig. S3), lo que sugiere que la presencia de PG adicional puede estabilizar aún más uniones adherentes en CaP. Además, en ARCAP
células M, la sobreexpresión de PG dieron lugar a una regulación del componente de los desmosomas desmoplakina (Fig. S3), lo que indica un potencial efecto estabilizador de PG en los cruces desmosomas en el CP también. Por otro lado, derribando expresión PG en las células LNCaP conducido a un debilitamiento sustancial de las adherencias célula-célula (Fig. 3C). Por otra parte, la baja regulación de PG condujo a una disminución tanto de E-cadherina y desmosomas antidesmogleína cadherina 2 en ARCAP
células E (Fig. S3), poniendo de relieve una vez más la importancia de PG para la estabilidad de los adherentes y los cruces desmosomas en el CaP . Estos resultados apoyan la idea de que colectivamente expresión PG refuerza la adhesión célula-célula en células de CaP.
Para confirmar aún más el efecto de PG en la adhesión célula-célula CaP, se realizó (gota colgante) ensayos de agregación de células en suspensión (Fig. 3D). Este ensayo se utilizó previamente para cuantificar la fuerza de adhesión de una variedad de células epiteliales, incluyendo A431, MDCK y SCC68 [38] - [40]. Para poner a prueba la fuerza de adhesión célula-célula sometimos agregados a la fuerza de cizallamiento. El número de fragmentos producidos por cizallamiento de los agregados se redujo significativamente en las líneas celulares que sobreexpresan PG comparación con el control (Fig. 3E). Además, golpeando hacia abajo PG condujo a un aumento significativo en el número de fragmentos, lo que sugiere el debilitamiento de la resistencia a la adhesión célula-célula a la fuerza de cizallamiento (Fig. 3D, F).
PG inhibe la motilidad y la invasión in Líneas celulares de CaP
Como debilitamiento de las adherencias célula-célula ha sido reportado para aumentar la motilidad de las células [41], el próximo investigó si el estado de PG en las células correlacionados con su motilidad relativa. Con este fin, se realizó un ensayo de cero herida para comparar la motilidad del PC3-M, ARCAP células
M, ARCAP
E, y C4-2B. El ensayo reveló que
células M PC3-M y ARCAP eran muy móviles (con más de 50% de la herida cerrada en 24 h), mientras que ARCAP
células E y C4-2B eran menos móviles (alrededor de 20% cerrada en 24 h) (Fig. 4A, B). A continuación, overexpressed PG en PC3-M y ARCAP
células M, que disminuyó su motilidad por 2 veces en comparación con el control (Fig. 4A). Al mismo tiempo, desmontables de PG en ARCAP
E y las células C4-2B resultó en un aproximadamente 50% y más de aumento de 2 veces en su motilidad, respectivamente (Fig. 4B). Estos hallazgos apoyan el concepto de que colectivamente ectópica expresando PG inhibe la motilidad de las células de CaP, mientras que el silenciamiento PG aumenta su motilidad.
A. PC3-M y ARCAP
M se sembraron en placas de 24 pocillos y se deja que se unan y propagación. Después las células se transdujeron con adenovirus que contiene GFP-o PG-que contiene adenovirus, y después de 24 horas se hizo una herida cero. Las imágenes fueron tomadas a las 0 y las 24 horas y el cierre de la herida% se calculó comparando el tamaño de la herida a las 24 horas para el punto de tiempo 0 horas para cada condición. La sobreexpresión de PG suprime la motilidad en estas dos líneas celulares. B. ARCAP
E y C4-2B células se sembraron en placas de 24 pocillos y se deja que se unan y propagación. Después las células se transfectaron con ARNsi de control o la piscina PG siRNA, y 72 horas después de la transfección, se hicieron las heridas cero. Represión de PG conduce a un aumento de la motilidad en ARCAP
E y las células C4-2B. ensayo de cero herida realizó por triplicado en líneas celulares de cáncer de próstata después de la sobreexpresión o desmontables de PG. C. ARCAP
células M, C4-2B, DU145 y PC3-M se transdujeron con adenovirus que contiene GFP-o-PG que contiene adenovirus, y después de 24 horas en placas sobre membranas Transwell Matrigel recubiertos para un ensayo de invasión. La sobreexpresión de PG suprime la invasión en estas cuatro líneas celulares. D. ARCaPE, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3 y PC3-M células fueron transfectadas con ARNsi de control o la piscina PG siRNA, y 72 horas después de la transfección, se sembraron en membranas Transwell Matrigel recubiertos para un ensayo de invasión. Represión de PG conduce a un aumento en la invasión en estas seis líneas celulares. Invasión ensayos se realizaron por triplicado.