Extracto
Antecedentes
ligando muerte programada-1 (PD -L1) se ha identificado como un factor asociado con un mal pronóstico en una gama de tipos de cáncer, y se informó que ser inducida principalmente por la pérdida de PTEN en gliomas. Sin embargo, el efecto clínico de PD-L1 y su regulación por PTEN aún no ha sido determinada en el cáncer colorrectal (CCR). En el presente estudio, se verificó la regulación de PTEN en PD-L1 y decididos aún más el efecto de PTEN en la correlación entre PD-L1 expresión y clínicos parámetros en el CCR.
Métodos /Resultados
enfoque de interferencia de ARN se utiliza para regular a la baja la expresión de PTEN en SW480, SW620 y células HCT116. Se mostró que la proteína PD-L1, pero no ARNm, fue significativamente mayor en las células transfectadas con siRNA PTEN en comparación con el control negativo. Además, la capacidad de PTEN para regular la expresión de PD-L1 no fue obviamente afectados por IFN-γ, el inductor principal de PD-L1. microarray de tejido inmunohistoquímica se usa para detectar PD-L1 y PTEN en 404 muestras de pacientes de CRC. La sobreexpresión de PD-L1 se correlacionó significativamente con metástasis a distancia (P & lt; 0,001), el estadio TNM (P & lt; 0,01), la progresión metastásica (P & lt; 0,01) y la expresión de PTEN (P & lt; 0,001). El análisis univariante reveló que los pacientes con alta expresión de PD-L1 tenían una supervivencia global pobre (P & lt; 0,001). Sin embargo, el análisis multivariante no apoyó PD-L1 como un factor pronóstico independiente (p = 0,548). Univariado (P & lt; 0,001) y la supervivencia multivariado (P & lt; 0,001) análisis de 310 pacientes con CCR localizado reveló que el alto nivel de expresión de PD-L1 se asoció con un mayor riesgo de progresión metastásica. Además, el efecto clínico de PD-L1 en CRC no fue estadísticamente significativa en un subgrupo de 39 pacientes con ninguna expresión PTEN (distante metástasis: P = 0,102; TNM etapa: P = 0,634, la supervivencia global: P = 0,482).
Conclusiones
PD-L1 se puede utilizar para identificar a los pacientes de CRC con alto riesgo de metástasis y mal pronóstico. Esta manifestación clínica puede estar asociada con la expresión de PTEN en parte
Visto:. Canción M, D Chen, Lu B, C Wang, Zhang J, Huang L, et al. (2013) La pérdida de PTEN Aumenta PD-L1 expresión de la proteína y afecta a la correlación entre PD-L1 expresión y los parámetros clínicos en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (6): e65821. doi: 10.1371 /journal.pone.0065821
Editor: Jun Sun, Rush University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: December 20, 2012; Aceptado: 28 de abril de 2013; Publicado: 13 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Song et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por Sun Yat-sen Universidad "100 Talentos Programa"; Programa innovador equipo de investigación de Guangdong (2009010058); Ciencia y Tecnología de la Información Oficina de Guangzhou, provincia de Guangdong (2011J5200009); Guangdong Provincial del Departamento de Ciencia y Tecnología (2012B050500004); y "Proyecto 985" de la Universidad Sun Yat-sen y Guangdong traslacional Plataforma Pública Medicina (4.202.037). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los países occidentales. A nivel mundial, es el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado en los hombres y el segundo tipo de cáncer más comúnmente diagnosticado en las mujeres [1]. Lo peor es que la mortalidad de CRC continúa aumentando en muchos países con cáncer colorrectal metastásico (CCRm) siendo la primera causa de muerte en la mayoría de los pacientes. CRC pacientes en etapa temprana tuvieron una tasa de supervivencia a cinco años de hasta el 90%, pero la tasa podría caer hasta un 60% de los pacientes con afectación cantidad de ganglios linfáticos, e incluso hasta el 10% cuando se presentan con metástasis [2]. Sin embargo, es difícil detectar el cáncer colorrectal metastásico en estadio temprano sólo se basa en los síntomas, lo que conduce a la toma de decisiones de tratamiento complicado, a menudo incluyendo terapia o tratamiento de fiesta agresivos. Un biomarcador que puede identificar a los pacientes con alto riesgo de metástasis y mal pronóstico podría tener amplias aplicaciones clínicas. Los estudios que buscan este tipo de biomarcadores son abundantes. PD-L1 es uno de los temas principales de la investigación de biomarcadores.
PD-L1 (también conocido como CD274, B7-H1), uno de los ligandos para la muerte celular programada 1 (PD-1), es una inmunológico del receptor-inhibidor perteneciente a CD28 /T citotóxicos antígeno del linfocito 4 (CTLA-4) de la familia. Se puede entregar una señal inhibitoria a PD-1 /B7-1 que expresan las células T, lo que resulta en el deterioro inmunológico [3], [4]. proteína PD-L1 se expresa a menudo en las células T activadas, células B, células NK, DCS, macrófagos y células cebadas derivadas de médula ósea [5]. expresión de PD-L1 también se encuentra en una amplia gama de tumores humanos. Además, los estudios relativos expresión de PD-L1 de evolución de la enfermedad se han hecho en la mayoría de los tumores, y los resultados muestran que la expresión de PD-L1 se correlaciona fuertemente con pronóstico desfavorable en el riñón [6], ovárico [7], la vejiga [8], de mama [9], el hígado [10], gástrico [11], y cáncer de páncreas [12], pero no en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) [13]. Lo más importante, estos estudios revelan que una mayor expresión de PD-L1 puede facilitar el avance del estadio del tumor y aumentar el potencial de invasión. Sin embargo, en CRC, el efecto clínico de PD-L1 y su mecanismo de regulación todavía no se ha determinado.
PD-L1 expresión puede ser inducida por muchos mediadores y citocinas inflamatorias, de los cuales el interferón-γ (IFN γ) es el más potente. Se ha demostrado que tanto de tipo I y de tipo II IFNs regular al alza la expresión de PD-L1 en la mayoría de líneas celulares de cáncer. Pocos estudios se centran en el papel regulador de PD-L1 en los tumores. Además, estos estudios produjeron resultados divergentes. Un estudio reciente indica que la pérdida de PTEN supresor de tumor (fosfatasa y homólogo de tensina suprimido en el cromosoma diez) puede ser un mecanismo importante que aumenta la expresión de PD-L1 en líneas celulares de glioma y muestras de tumores de pacientes [14]. PTEN es un importante gen supresor de tumores que regula principalmente negativamente la señalización de la quinasa B (Akt) vía PI3K-proteína [15] de células-supervivencia, [16]. Además, los estudios mostraron que la acumulación de PTEN puede ser un gen importante que asociada con la metástasis del tumor [15], [17], [18]. Tanto en
in vitro Opiniones y en
in vivo
experimentos de CRC mostró que PTEN controla el potencial tumorigénico y metastásico. Se ha informado de que la inyección de las células deficientes en PTEN en ratones dio como resultado mucho más pulmonar y metástasis "multi-ubicación" que la inyección de células de control [19]. Además, algunos datos clínicos indica que la pérdida de detección de PTEN por inmunotinción se asoció con la enfermedad avanzada, la metástasis de hígado y pobre supervivencia de los pacientes [20] - [22]. Sin embargo, algunos estudios recientes no apoyan el papel de PTEN en la regulación de la expresión de PD-L1. Se decía que "la expresión de PD-L1 se modula a través de diferentes vías entre los diferentes tipos de células tumorales" [23].
Es bien sabido que el PD-L1 es un potente regulador negativo de la inmunidad antitumoral, pero es desconoce si este efecto inmunológico-escape es suficiente para hacer PD-L1 en un factor distinto asociado con un mal pronóstico para todos los tipos de cánceres humanos. A la inversa, PTEN se ha identificado como un factor crucial en diversos procesos centrales del desarrollo del cáncer, y como un gen importante para el diagnóstico y pronóstico del cáncer. Tras el reciente descubrimiento de que la expresión de la proteína PD-L1 correlaciona con la pérdida de PTEN [14], llegamos a la hipótesis de que la progresión del tumor y la expresión de PD-L1 están relacionados de forma independiente con la pérdida de PTEN, y que el efecto clínico de PD-L1 puede, a menos en parte, atribuirse a la correlación entre la pérdida de PTEN y la expresión de PD-L1.
en el presente estudio, se examinó por primera vez el efecto de la pérdida de PTEN en la expresión de PD-L1 en líneas celulares de CRC, y determina si el efecto observado mantuvo en presencia de IFN-γ. En segundo lugar, se evaluó la asociación de la expresión de PD-L1 con la evolución de la enfermedad y la expresión de PTEN en 404 pacientes con CCR con una mediana de seguimiento de 5 años. Por último, se determinó la importancia clínica de PD-L1 en un subgrupo de 39 pacientes con pérdida completa de PTEN para explorar si el efecto de PD-L1 en el CCR depende de la expresión de PTEN.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de la Universidad Sun Yat-sen (Guangzhou, china), y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente.
Recogida de muestras y el cultivo celular
En este estudio, 404, las muestras incluidas en parafina fijadas con formalina de CRC se obtuvieron del banco de tumores del Departamento de Anatomía Patológica del hospital Afiliado En primer lugar, la Universidad Sun Yat-Sen (Guangzhou, china ). Estos 404 pacientes que habían sido diagnosticados con CRC y fueron sometidos a resección quirúrgica inicial de CCR entre enero de 2000 y noviembre de 2006 fueron de seguimiento por teléfono o cartas de la cirugía hasta abril de 2010 para recoger información de carácter general, los informes de patología, y la información con respecto a los pacientes ' condición después de la cirugía.
Tres líneas celulares de CRC, SW480, SW620 y HCT116 fueron adquiridos de Colección de Cultivos de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china), y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina -streptomycin a 37 ° C en 5% de CO
2
ARN de interferencia (ARNi)
Para regular a la baja la expresión de PTEN, los dúplex de siRNA específicos dirigidos a PTEN humana (sentido: 5. '-GAGCGUGCAGAUAAUGACAdTdA-3'; antisentido: 3'-dAdTCUCGCACGUCUAUUACUGU-5 ') se sintetizaron y se adquirió de RiboBio Co. Ltd (Guangzhou, china), y se utilizaron dúplex de siRNA con secuencias no específicas como control negativo (NC). SiRNA transfección se llevó a cabo con lipofectamina 2000 (Invitrogen, CA, EE.UU.) con una concentración de 100 nM. La eficacia de transfección fue probado por qRT-PCR y Western blot. Estos experimentos se realizaron en presencia y ausencia de IFN-γ humano recombinante (500 UI /ml, Peprotech, NJ, EE.UU.) y repetido por triplicado.
Quantitative PCR de transcripción inversa (QRT-PCR)
Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el ARN celular total se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. ADNc se derivó de 500 ng de RNA total usando cDNA kit de transcripción inversa (Toyobo, Osaka, Japón). Posteriormente, PCR en tiempo real se realizó utilizando el kit SYBR Green PCR cuantitativa (Takara Bio, Dalian, China) el ABI 7500 RT-PCR System (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1, PTEN y PD-L1 nivel de expresión génica relativa se analizó utilizando el comparativo C
T método (también conocido como el
-ΔΔCT método 2). Los detalles de la C
T método comparativo se han descrito anteriormente [24], [25]. Brevemente, se realizaron tres réplicas de amplificaciones por PCR para cada muestra. β-actina se utilizó como control interno. El promedio de C
T se calcula tanto para los genes diana y β-actina. El? C
T se determinó como (la media de los C
valores de T por triplicado para el gen diana) menos (la media de la triplicado C
valores de T para β-actina). El ΔΔC
T representa la diferencia entre las líneas celulares emparejados, donde PTEN ΔΔC
T =? C
T de las células transfectadas con siRNA menos? C
T del control negativo y PD-L1 ΔΔC
T =? C
T de las células tratadas con IFN-γ menos? C
T de las células de control no tratadas. El nivel de expresión relativa se expresa como 2
-ΔΔCT.
Western Blot
Setenta y dos horas después de la transfección, las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS ) y se lisaron con tampón RIPA (Dingguo, Beijing, china) suplementado con inhibidores de proteasa y de fosfatasa (Merck Bioscience, Darmstadt, Alemania). Posteriormente, los niveles de proteína PTEN se determinaron utilizando dos colores fluorescentes Western Blot en el sistema de formación de imágenes de infrarrojos Odyssey (LI-COR, Nebraska, EE.UU.) como se describe anteriormente [26]. En resumen, cantidades iguales de proteína fueron separadas por 10% de sodio dodecil sulfato-electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Pall, Nueva York, EE.UU.). Las membranas se bloquearon a continuación con 5% de BSA durante 1 h y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C [anticuerpo primario: conejo anti-PTEN (diluyeron 1:10000, Epitomics, CA, EE.UU.); Conejo anti-Akt (diluido 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, EE.UU.); Conejo anti-fosfo-Akt
Ser473 (diluido 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, EE.UU.); Ratón de anticuerpos β-actina (diluido 1:10000, Proteintech, Chicago, EE.UU.)]. Al día siguiente, después de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia especies apropiadas durante 1 hora a temperatura ambiente, las membranas fueron analizados utilizando el sistema de imágenes de infrarrojos Odyssey.
Citometría de Flujo
PD-L1 expresión en la superficie celular se determinó utilizando citómetros de flujo. Se recogieron las células y se incubaron con PD-L1 antihumano PE-Cy7 (eBioscience, CA, EE.UU.) o anticuerpo de control de isotipo correspondiente (eBioscience, CA, EE.UU.) durante 30 minutos en la oscuridad sobre hielo (0,5 g anticuerpos durante 10
5 células en un volumen final de 100 l). Después las muestras se lavaron tres veces, las células teñidas se resuspendieron y se analizaron en BD FACSCanto II (BD Biosciences, CA, EE.UU.) utilizando el software FlowJo (TriStar, CA, EE.UU.). intensidades de fluorescencia normalizados se calcularon dividiendo las intensidades de fluorescencia medias de anticuerpos específicos por las intensidades de fluorescencia de la mediana de control de isotipo. Todos los datos fueron recolectados a partir de tres experimentos independientes. La significación estadística se determinó mediante muestras relacionadas
t
prueba.
Tejido de microarrays (TMA) e inmunohistoquímica (IHC)
TMA se construyeron usando instrumento automático de microarrays de tejidos (ALPHELYS, Plaisir, Francia). Después de identificar los H & amp; diapositivas E-manchado de tejido tumoral óptima, dos biopsias de núcleo cilíndrico (2 mm de diámetro) fueron perforados de cada uno, bloques de parafina de tejido fijados con formol y dispuestos en receptores bloques de TMA (2 × 3 cm) como descrito anteriormente [27], [28]. Cada bloque TMA incluye 108 núcleos de tejido de 54 pacientes. Posteriormente bloques receptores se cortaron en secciones de 5 micras y se adhirieron a las placas de vidrio silanizado para la tinción IHC.
IHC se realizó utilizando el súper HRP Elivision ™ (ratón /conejo) IHC Kit (Bio-Maixin, Fuzhou, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de deparaffinised en xileno y se rehidrataron en una serie de alcoholes graduados (100%, 95%, 75%), los portaobjetos se recuperaron antígeno en tampón de citrato de sodio (pH 6,0) en Microware. A continuación, los portaobjetos se incubaron con 3% de H
2O
2 para bloquear la peroxidasa endógena y de suero de cabra para bloquear la unión no específica. Posteriormente, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos PD-L1 (diluida 1:500, Abcam, Hong Kong, China) o anticuerpo PTEN (diluido 1:600, Abcam, Hong Kong, China) durante la noche a 4 ° C. Al día siguiente, los portaobjetos se incubaron con el agente de amplificación (reactivo A, Elivision suministro súper Kit) y la polimerasa (reactivo B, Elivision suministro súper Kit). Por último, los portaobjetos se tiñeron con DAB y de contraste con hematoxilina (40 segundos). Un control negativo usando dilución de anticuerpo como sustituto de anticuerpos primarios se realizó para cada experimento.
tinción Evaluación
Para cada punto, una imagen digital a 2592 × 1944 píxeles de resolución a 100 × magnificación fueron capturados por el microscopio Leica DMI 4000B invertido (Leica Micro-sistemas, Wetzlar, Alemania). La tinción inmunohistoquímica de la imagen se analizó mediante el uso de la imagen Pro-Plus (versión 5.0, Media Cybernetics, Silver Spring, EE.UU.) presentado por Xavier [29]. En resumen, el área del tumor fue seleccionado como el área de interés (AOI), y la suma área y la densidad óptica integrada (IOD), de la AOI fueron seleccionados como los parámetros de medición. PD-L1 y el índice de expresión de PTEN igualaron el cociente entre el IOD y el área total de AOI. Por último, se utilizó el índice de expresión medio de cada duplicado para el análisis estadístico.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa SPSS v.17.0 (SPSS Inc, Chicago, EE.UU.). software de baldosas X (versión 3.6.1, Yale University School of Medicine, New Haven, EE.UU.) se utilizó para determinar el único punto de corte óptimo para la curva de supervivencia. Todos los valores de p son dos caras y P & lt;. 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Asociaciones de PD-L1 expresión /PTEN con parámetros clínicos se evaluaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (para dos poblaciones que están relacionados) o Kruskal Wallis (más de dos poblaciones que están relacionados), ya que los datos del índice de la expresión /PTEN PD-L1 no es consistente con una distribución normal (test de Shapiro-Wilk: P & lt; 0,001). La supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de metástasis (MFS) se calcula utilizando el método de Kaplan-Meier. Ser diagnosticado como metástasis durante el seguimiento en los situada CRC (pM0) pacientes se definió como el evento terminal para el análisis de MFS. Las asociaciones de PD-L1 expresión /PTEN con enfermedad resultados se evaluaron utilizando Cox modelos de regresión de riesgos proporcionales. El único punto de corte óptimo para el PD-L1 expresión /PTEN que los pacientes separados en un grupo con PD-L1 /PTEN expresión más alta y un grupo con PD-L1 /PTEN menor expresión se construyeron mediante el software de tejas X como se describe anteriormente [23 ], [24]. asociaciones similares y análisis de supervivencia se realizaron en el subgrupo de 39 pacientes sin ningún tipo de expresión de PTEN, lo que representa el grupo en el que se controla la función de confusión de PTEN.
Resultados
No PTEN Pérdida pero IFN -γ inducida expresión de PD-L1 mRNA en CRC líneas celulares
Tanto el nivel de ARNm y el nivel de proteína de PTEN se redujo en las células transfectadas con siRNA PTEN en comparación con el control negativo. El nivel de ARNm de PTEN se redujo a alrededor de 12,4% en SW480, 14,6% en SW620, 22,6% en HCT116 a 48 h después de la transfección en células transfectadas con siRNA PTEN en comparación con el control negativo (Fig. 1. A). No hubo diferencia significativa en el nivel de mRNA PD-L1 entre las células transfectadas con siRNA PTEN y el control negativo. Por el contrario, el nivel de ARNm de PD-L1 aumentó significativamente en las células que fueron expuestas a IFN-γ en comparación con las células de control emparejado sin exposición a IFN-γ (alrededor de 8 pliegues) (Fig. 1. B).
(a) el nivel relativo de expresión de PTEN ARNm (detectado por QRT-PCR, calculado por 2
-ΔΔCT método) en cuatro grupos: las células transfectadas con siRNA PTEN o secuencias no específicas en presencia o ausencia de IFN -γ. (B) El nivel relativo de expresión de PD-L1 mRNA en cuatro grupos de células. Los datos fueron recolectados a partir de tres experimentos independientes. Las barras de error representan SD.
Tanto el IFN-γ y PTEN pérdida inducida por la expresión de la proteína PD-L1 en el CCR
Se evaluaron las consecuencias de PTEN desmontables sobre la activación de Akt en la presencia /ausencia de IFN-γ. Fosfo-Akt
Ser473 aumentaron en células transfectadas con siRNA PTEN en comparación con el control negativo, independientemente de la presencia de IFN-γ (Fig. 2). expresión de la proteína PD-L1 fue significativamente mayor en las células transfectadas con siRNA PTEN en comparación con el control negativo (P & lt; 0,05). Además, la presencia de IFN-γ no cambió esta situación de partida (Fig. 3).
El nivel de expresión de la proteína de PTEN, Akt y fosfo-Akt
Ser473 se determinó por transferencia Western. β-actina se utilizó para verificar la igualdad de carga. Imágenes representativas se seleccionan a partir de experimentos realizados por triplicado repetidas
PD-L1 nivel de expresión de proteínas en la superficie de SW480, SW620 y HCT116 se determinó mediante citómetro de flujo:. las células transfectadas con siRNA PTEN (líneas rojas) y las células transfectadas con las secuencias no específicas (líneas azules) en ausencia de IFN-γ; células transfectadas con siRNA PTEN (líneas negras) y las células transfectadas con las secuencias no específicas (líneas de color naranja) en presencia de IFN-γ; células teñidas con anticuerpo de control de isotipo correspondiente (área sombreada). la intensidad de fluorescencia estándar de proteínas PD-L1 fue descrito por el histograma en el panel de la derecha: las células tratadas (columna blanca) o sin tratar (columna gris) con IFN-γ. Los datos fueron recolectados a partir de tres experimentos independientes. Las barras de error representan SD. . (* P & lt; 0,05 para muestras relacionadas por
t
prueba)
IFN-γ inducida por proteína PD-L1 con dos diferentes estructuras en la línea celular SW480
La citometría de flujo histogramas mostró dos picos en las células SW480 tratadas con IFN-γ (500 UI, 72 horas), mientras que sólo había un solo pico distinto en el grupo no tratado. Además, sólo se observó un pico distinto solo en las células SW620 y células HCT116 tanto en la presencia y ausencia de IFN-γ (Fig. 3). Para determinar si estos dos picos eran dependiente del tiempo o dependiente de la dosis, se trataron células SW480 con diferentes dosis de IFN-γ durante 48 horas. proteína PD-L1 se aumentó máximo a 500 UI /ml de IFN-γ. efecto curso de tiempo de IFN-γ en la proteína PD-L1 se determinó a partir de entonces. SW480 se trató con 500 UI /ml de IFN-γ de 0, 24, 48 y 72 horas. Los resultados mostraron que en presencia de IFN-γ, independientemente de la dosis de IFN-γ y el momento del tratamiento, la proteína PD-L1 con dos estructuras diferentes se reconoció en la superficie de células SW480 (Fig. 4).
(a) SW480 tratadas con IFN-γ a la concentración indicada (0 UI /ml, 50 UI /ml, 100 IU /ml, 500 UI /ml, 1.000 UI /ml). (B) SW480 tratado con 500 UI /IFN-γ ml para tiempos acusadas (0 h, 24 h, 48 h, y 72 h). El área sombreada representa SW480 sin tratamiento de IFN-γ, y los números al lado de los picos representan la intensidad de fluorescencia estándar de PD-L1. Imágenes representativas son seleccionados a partir de experimentos realizados por triplicado repetidas
Seguimiento de los pacientes
Entre los 404 pacientes, 5 pacientes (& lt; 3%). se habían perdido al final de seguimiento, 110 pacientes (27,2%) habían muerto en un tiempo medio de seguimiento de 2,7 años (rango: 0.1-9.1 años), y de los 288 pacientes restantes tuvieron un tiempo medio de seguimiento de 5,8 años (rango: 0.1 -10.2 años). Cuando se realizó IHC, el tejido de 57 pacientes se lavó el portaobjetos de vidrio y los 347 pacientes restantes tuvieron datos inmunohistoquímicos. No hubo diferencias en la supervivencia global entre los pacientes con y sin datos de inmunohistoquímica (P = 0,716, prueba de log-rank). Tampoco hubo diferencia significativa en la progresión metastásica (diagnosticado como metástasis después de la cirugía) las tasas entre los pacientes con y sin datos de inmunohistoquímica (12,4% y 14,0%, P = 0,682).
La correlación de PD-L1 /PTEN Expresión y los parámetros clínicos
La tinción inmunohistoquímica de PD-L1 se encuentra en el sistema de membrana celular y endomembrane tenía un índice de expresión varió de 0 a 15.9 (mediana: 2,33) (Fig 5. a
1-D
1, A
2-D
2). PTEN se encuentra en el citoplasma con una expresión índice varió de 0 a el 54,7 (mediana: 5,57) (Fig. 5. E
1-G
1, E
2-G
2) .Hay fue de 39 pacientes que no tenían la expresión de PTEN (Fig. 5. H
1, H
2).
(A
1, A
2, E
1 , E
2) Control negativo; (B
1, B
2, F
1, F
2) Las muestras del mismo paciente con la progresión metastásica; (C
1, C
2, G
1, G
2) Los especímenes de otro paciente sin progresión metastásica; (D
1, D
2) Un representante típico que mostró que la expresión de PD-L1 es elevado en el área del tumor (T) en comparación con las de la mucosa normal adyacente (N); (H
1, H
2) Las muestras de paciente sin ningún tipo de expresión de PTEN; (J, K) El análisis estadístico demostró que la expresión de PD-L1 está aumentada en los pacientes con progresión metastásica en comparación con aquellos sin progresión metastásica, mientras que tal análisis estadístico de PTEN no fue significativa. (Dos de paneles, teñidas con anticuerpos PD-L1, dos paneles de abajo, teñidas con anticuerpos PTEN), (A
1-H
1, × 100; A
2-H
2, × 400) guía empresas
Como se muestra en la Tabla 2, los pacientes con mayor expresión de PD-L1 eran más propensos a presentar metástasis a distancia (pM) (P & lt;. 0,01), características patológicas adversas (2007 clasificación TNM) (P & lt; 0,01), y la progresión metastásica (P & lt; 0,001) la expresión (Fig. 5. J), y PD-L1 se correlacionó con la expresión de PTEN en cierta medida (P & lt; 0,001). No hubo diferencias estadísticamente significativas entre sexo, la edad, la localización del tumor, la clasificación del tumor primario (PT), compromiso de los ganglios linfáticos regionales (PN), o la recurrencia después de la cirugía. Por el contrario, la expresión de PTEN no tenía ninguna asociación significativa con las variables primarias (PT: P = 0,221; PN: P = 0,131; PM: P = 0,525; el estadio TNM: P = 0,337; recurrencia: P = 0,397; progresión metastásica: P = 0.710 ). La supervivencia y la supervivencia libre de metástasis en general tampoco se asoció con la expresión de PTEN (P = 0,366, p = 0,141, respectivamente) (Fig. 6. C, D).
(A, B) del sistema operativo y MFS fueron significativamente inferiores en los pacientes PD-L1-alto-expresión en comparación con los pacientes PD-L1-inferior-expresión (ambos p & lt; 0,001). (C, D) El sistema operativo y MFS no fueron significativamente diferentes entre los pacientes de mayor PTEN-expresión y los pacientes PTEN-inferior-expresión (OS, P = 0,366; MFS, P = 0,141). (E) En el subgrupo de 39 pacientes con la pérdida de PTEN completa, expresión de PD-L1 ya no se asocia con el sistema operativo (P = 0,482).
Análisis de supervivencia
Análisis del software de tejas X 1.49 revela que fue el punto de corte óptimo que separaba a los pacientes en un grupo con PD-L1 expresión más alta y un grupo con PD-L1 menor expresión. La curva de Kaplan-Meier y log-rank test mostraron que la tasa de supervivencia global de los pacientes con menor expresión de PD-L1 fue significativamente mayor que los pacientes con mayor expresión de PD-L1 (figura 6A, χ2 = 13,964, p. & Lt; 0,001). La tasa de SG a 5 años fue del 62,9% para los pacientes con mayor expresión de PD-L1 y 81,1% para los pacientes con baja expresión de PD-L1. En el análisis multivariado por Cox de riesgos proporcionales, PD-L1 no fue un factor pronóstico independiente de CRC después de ajustar por las variables que cumplen supuesto de PH (edad, localización del tumor, grado de diferenciación, pT, pN, PM, la progresión metastásica) (P = 0,548). Sin embargo, si las variables que significativamente asociados con la expresión de PD-L1 (PM, la progresión metastásica) no fueron ajustados en el análisis multivariante, la expresión de PD-L1 se convirtió en un factor pronóstico significativo de CRC (P & lt; 0,01). (Tabla 3)
Como se muestra en nuestros resultados, PD-L1 inclinados a asociarse con las variables de metástasis. Así que para determinar con mayor precisión la asociación de PD-L1 con la progresión del cáncer metastásico, se estudió el subgrupo de 310 pacientes con CCR localizado (pM0), de los cuales 28 (9,03%) progresaron a metástasis a distancia en una mediana de seguimiento de 5,14 años ( gama, 0.06-10.14 años). En este subgrupo, expresión de PD-L1 se asoció significativamente con la supervivencia libre de metástasis (MFS) (Figura 6B, χ2 = 21,444, p. & Lt; 0,001). La tasa de MFS 5 años fue del 99,5% para el PD-L1-inferior-expresión de los pacientes y el 72,1% para los pacientes PD-L1-alto-expresión. Además, el análisis de Cox reveló que la expresión de PD-L1 fue un predictor significativo de la progresión metastásica. (RR: 1,165; IC del 95%: 1,072-1,268; p & lt; 0,001)
Es interesante que en el subconjunto de 39 PTEN pacientes -no-expresión, en el que se controla el efecto de confusión de PTEN en PD-L1, expresión de PD-L1 ya no se asocian con metástasis a distancia (p = 0,102), el estadio TNM (p = 0,634), y el análisis de supervivencia mostraron que no hubo diferencia significativa en la supervivencia global entre el grupo de PD-L1-superior-expresión y el grupo PD-L1-inferior-expresión (Fig. 6E, χ2 = 0,494, P = 0,482).
Discusión
PD-L1 ha sido uno de los principales temas de investigación de biomarcadores tumorales en la última década. Un gran número de estudios han demostrado una correlación entre la agresividad del tumor y la expresión de la proteína PD-L1. En el presente estudio, que también proporcionó una fuerte evidencia de que un mayor nivel de expresión de PD-L1 en el CCR facilita el avance del estadio tumoral y la progresión metastásica. La tasa de supervivencia global de los pacientes con menor expresión de PD-L1 fue significativamente mayor que la de los pacientes con mayor expresión de PD-L1. Además, la expresión de PD-L1 también se asoció significativamente con la supervivencia libre de metástasis en los 310 pacientes con CCR localizado. Sin embargo, la expresión de PD-L1 no se asoció significativamente con pronóstico desfavorable después de ajustar por la metástasis y la progresión metastásica mediante análisis multivariado de la supervivencia. Esto es incompatible con la observación anterior de que la expresión de PD-L1 permanece asociado con un pronóstico desfavorable en el análisis multivariante en pacientes con carcinoma de células renales [6]. Una explicación para esta discrepancia puede ser las diferentes variables que se ajustan en el modelo multivariado. En el estudio anterior, la variable de progresión metastásica (diagnosticado como metástasis después de la cirugía) no se ajustó en el análisis de supervivencia multivariante. Es bien sabido que la metástasis es la causa principal de muerte en los pacientes de CRC; así que una vez ajustado por esta variable relacionados con la muerte, PD-L1 ya no era un factor pronóstico independiente de CRC.
Evidencias de las literaturas y nuestra investigación mostró que la sobreexpresión PD-L1 está estrechamente asociada con la progresión del cáncer ( especialmente con la progresión de la metástasis), haciendo PD-L1 un biomarcador prometedor y dianas terapéuticas para tumores. Sin embargo, el mecanismo por el que PD-L1 mejora la progresión del cáncer es poco conocido. Como se describe en la literatura, estas asociaciones pueden ser atribuidas a la bien reconocida "escudo molecular" proporcionado por PD-L1. Se informó de que PD-L1 proporciona un efecto de "blindaje" para proteger las células tumorales de la lisis por las células T citotóxicas. Además, PD-L1 se encontró que tienen un efecto anti-apoptótico sobre las células tumorales [3], [30]. Sin embargo, una en
estudio in vivo
mostró que la expresión transgénica de PD-L1 en un ratón naive PD-L1-deficiente no cambió su tumorigenicidad [31]. En el ensayo multicéntrico fase I, Brahmer et al declararon que el bloqueo mediado por anticuerpos de PD-L1 induce la regresión del tumor durable y prolonga la estabilización de la enfermedad en pacientes con cánceres avanzados seleccione. Desafortunadamente, el cáncer colorrectal no es uno de estos tipos de cáncer seleccione [32]. Nos preguntamos si la capacidad de destruir el "escudo molecular" puede proporcionar una base adecuada para esta asociación clínica en el CCR. Andrew T Parsa también sugirió que el grado de expresión de la proteína PD-L1 afecta directamente a la progresión del cáncer que queda por determinar [14].
En este estudio, para identificar los efectos indirectos adicionales de expresión de PD-L1 en la progresión del cáncer , se estudiaron las vías de señalización implicadas en la regulación de la expresión de PD-L1 en el CCR.