Extracto
Hemos demostrado por primera vez que una sobresaliente capacidad de rosiglitazona para mediar una profunda mejora de la apoptosis inducida por lA-12 asociada con la activación de la vía mitocondrial en células de cáncer de colon humano. Este efecto se observó preferentemente en la fase G1 del ciclo celular, independiente de p53 y las proteínas PPAR, y acompañado con cambios significativos de los niveles de proteína de la familia Bcl-2 seleccionados. Una mayor estimulación de la acción citotóxica sinérgica cooperativa de rosiglitazona y LA-12 se demostró en las células deficientes en PTEN, donde vía mitocondrial de apoptosis fue más estimulado y muerte asociada a la fase G1 fue reforzada. Nuestros resultados sugieren que el tratamiento combinado con rosiglitazona y LA-12 podría ser prometedora estrategia contra el cáncer en los tumores de colon derivados independientemente de su estado de p53, y también favorable en los defectos de la función de PTEN
Visto:. Lauková J, Kozubík A, Hofmanová J, J Nekvindová, Sova P, Moyer MP, et al. (2015) La pérdida de PTEN Facilita la rosiglitazona mediada Mejora de platino (IV) Inducir-LA-12 Complejo apoptosis en células de cáncer de colon. PLoS ONE 10 (10): e0141020. doi: 10.1371 /journal.pone.0141020
Editor: Yoshiaki Tsuji, Universidad Estatal de Carolina del Norte, Estados Unidos |
Recibido: May 4, 2015; Aceptado: 2 Octubre 2015; Publicado: 22 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Lauková et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Científica Checa (15-06650S) (http://www.gacr.cz; AHV) y el Ministerio de IGA de Salud de la República Checa (NT 11201-5 /2010) (http://iga.mzcr.cz; AK). Platinum Pharmaceuticals, A. S. (Dr. Petr Sova) y la Corporación incell LLC (Dr. Mary Pat Moyer) proporcionaron apoyo en forma de material de investigación, y su función específica, se indica también dentro de la sección Contribuciones de los autores de la forma de presentación en línea.
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia. Petr Sova es un empleado de la empresa propietaria de los derechos de propiedad intelectual con respecto a LA-12 y co-autor de las patentes en el campo de la LA-12. Mary Pat Moyer es un empleado de la empresa propietaria de los derechos de propiedad intelectual con respecto a la línea celular NCM460. Estas afiliaciones comerciales no alteran la adherencia de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
peroxisomas γ del receptor activado por el proliferador (PPAR) es un miembro del receptor de la hormona nuclear superfamilia de factores de transcripción activados por ligando que están involucrados en la regulación del metabolismo de la energía, el desarrollo del cáncer y la respuesta anti-inflamatoria [1]. Aunque un papel principal de PPAR se ha demostrado en la diferenciación de adipocitos y la insulina sensibilización [2], PPAR es también bien conocido por afectar el crecimiento y ciclo celular [3, 4], la diferenciación [5] y la apoptosis [6] de diversos tipos de células de cáncer como el de colon. Del mismo modo como en los adipocitos, la expresión de PPAR también se mantiene en niveles relativamente altos en numerosas líneas celulares de cáncer de colon humano y los tumores primarios de colon [7]. Las mutaciones del gen de PPAR se han reportado como evento raro en tumores malignos humanos, incluyendo de colon [8]. Se ha sugerido que la regulación génica inducida por PPAR podría contribuir a la tumorigénesis, pero el significado de esta vía de receptor en el desarrollo de cáncer de colon y el tratamiento sigue siendo controvertido.
rosiglitazona, un ligando sintético de PPAR es un contra ampliamente utilizado -diabetic agente de la familia de medicamentos llamados tiazolidinedionas. Debido a su capacidad para inhibir la proliferación y /o inducir la muerte de células de cáncer, rosiglitazona también se ha examinado en numerosos estudios se centraron en el tratamiento del cáncer. Aunque una eficacia antitumoral insuficiente de rosiglitazona se ha demostrado en muchos casos cuando se utilizan en monoterapia, se ha informado de su potencial prometedor como un adyuvante en combinación con la radiación [9] o diversos tipos de agentes antineoplásicos. La rosiglitazona aumentó la sensibilidad de las células de cáncer de colon a los efectos citotóxicos de 5-FU [10], citoquinas TRAIL [11] o todo trans-ácido retinoico [12]. Curiosamente, efectos aditivos /synergicanticancer de rosiglitazona y usado convencionalmente fármacos a base de platino cisplatino o carboplatino se han demostrado en colon, de pulmón o de líneas celulares de cáncer de ovario
in vitro
[13, 14]. La combinación de carboplatino y rosiglitazona redujo la incidencia de la formación de pólipos en los ratones modelo de carcinogénesis de colon inducida por azoximetano [13], el tamaño del tumor en ratones desnudos con inyectada por vía subcutánea A549 de cáncer de pulmón de células derivadas de xenoinjertos [13] o inducido una regresión de K- Ras-conducida adenocarcinomas de pulmón murino [14]. El pretratamiento con rosiglitazona también sinergizada actividad contra el cáncer de cisplatino en tumores mamarios inducidos por DMBA en ratas [15]. Aunque se han sugerido algunos mecanismos moleculares detrás de estos efectos, muchos de ellos todavía se tienen que aclarar. Por otra parte, una falta completa de la información que existe respecto a los posibles efectos contra el cáncer de cooperación de la rosiglitazona con nuevos fármacos quimioterapéuticos basados en platino.
LA-12, (OC-6-43) bis (acetato) (1- adamantilamina) amminedichloroplatinum (IV), representa un (IV) que contiene un complejo voluminoso hidrófobo ligando 1-adamantilamina platino recientemente introducido, lo que permite su hidrofobicidad más alta en comparación con otros fármacos a base de platino tales como cisplatino [16]. La acción de LA-12 ha sido intensamente estudiada por nosotros y otros tanto
in vitro
y
in vivo
, y los resultados de relieve su potencial contra el cáncer favorable durante varios fármacos quimioterapéuticos basados en platino utilizados convencionalmente [17]. LA-12 ejerce un fuerte efecto citotóxico en varias líneas celulares de cáncer resistentes al cisplatino de diferente origen incluyendo de colon [18-20]. Además, LA-12 podría superar la resistencia dependiente de la confluencia de las células de cáncer de colon que se describen en el platino (II) Los compuestos de cisplatino y oxaliplatino [21]. Además, demostró que una mayor eficacia de LA-12 en células de cáncer de colon se asoció con su capacidad para superar el bloqueo en la entrada de la fase M provocada por oxaliplatino con el fin de reparar el daño celular [22]. Recientemente, se informó de una mayor capacidad /única de LA-12 en comparación con cisplatino para inducir la regulación por incremento de varias proteínas importantes implicadas en la regulación de la apoptosis tales como Noxa, Bim, c-Myc o DR5 [23, 24]. Por otra parte, la captación celular de LA-12 se ha demostrado más rápido y más eficaz en comparación con el cisplatino en el carcinoma humano de pulmón no de células [25]. propiedades contra el cáncer prometedores de LA-12 también se demostraron
in vivo
en ratones desnudos portadores de xenoinjertos de carcinoma humano de colon, de próstata y de origen ovárico, donde LA-12 fue más eficaz en la eliminación del tumor en comparación con satraplatin [26]. Sin embargo, ni los mecanismos moleculares detallados implicados en la acción citotóxica y citostática de LA-12 en células de cáncer de colon todavía no se comprende totalmente, ni son sus posibles aplicaciones en terapia combinada
En este estudio., Que fueron los primeros para demostrar la capacidad de la rosiglitazona para estimular la respuesta antiproliferativa y apoptosis provocada por lA-12 en células de adenocarcinoma de colon humano HCT116. Se investigaron los mecanismos moleculares responsables de la acción cooperativa de las drogas, con un enfoque particular en la modulación de la progresión del ciclo celular, la participación de PTEN y la activación de la vía mitocondrial de apoptosis. La respuesta citotóxica provocada por la combinación de rosiglitazona y LA-12 también se investigó en otras líneas de células de cáncer de colon y las células derivadas de epitelio de colon normal.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y tratamientos
de colon humano HCT116 líneas celulares de adenocarcinoma en peso (p53
+ /+, Bax
+/-, Chk2
+ /+, PTEN
+ /+), p53
- /-, Bax
- /-, Chk2
- /- y PTEN
- /- (obtenido del Prof. Bert Vogelstein, de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE.UU., y T. Waldman , Georgetown University School of Medicine, Washington, EE.UU., en 2007) [27] [28] se mantuvieron en medio de McCoy 5A (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, EE.UU.), complementado con penicilina (100 U /ml), estreptomicina (0,1 mg /ml) y suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria y Gibco, Invitrogen). células de adenocarcinoma de colon humano DLD-1 (ATCC, CCL-221, obtenido en 2009) y la RKO (ATCC, CRL-2577, obtenido en 2007) se mantuvieron en RPMI o DMEM (tanto Gibco, Invitrogen, Life Technologies), respectivamente, complementados con penicilina (100 U /ml), estreptomicina (0,1 mg /ml) y 10% de FBS. El ser humano adulto normal del colon línea celular derivado del epitelio NCM460 se recibió (en 2010) por un acuerdo de transferencia de material con incell Corporation (San Antonio, Texas, EE.UU.) [29], y de manera rutinaria propaga en condiciones estándar de M3: medio 10TM (incell Corporación). Las células se cultivaron en TPP (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suiza) platos de cultivo, matraces o placas en un incubador humidificado a 37 ° C en atmósfera de 5% de CO
2, se pasaron dos veces a la semana después de la exposición a EDTA /PBS y tripsina soluciones. El número de células se determinaron usando un contador de CASY Modelo TT-Cell y Analyzer (Roche Diagnostics GmbH, Alemania).
Veinticuatro horas después de la siembra, las células se trataron previamente (24 h) con 50 M de rosiglitazona (RGZ ) (5 - [[4- [2- (metil-2-piridinilamino) etoxi] fenil] metil] -2,4-tiazolidindiona, Cayman Chemical, Michigan, EE.UU.) y posteriormente tratada (48 h) con 0,75 M LA- 12 ([(OC-6-43) bis (acetato) (1-adamantilamina) aminedichloroplatinum (IV)], Platinum Pharmaceuticals, como, Brno, República Checa). MEK1 /2 inhibidor U0126 (# 9903, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.) y pan-caspasa inhibidor z-VAD-FMK (# 550377, BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.) se añadió a las células 1 hora antes del tratamiento con RGZ. Las soluciones madre se diluyeron en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich, Praga, República Checa).
La transfección celular y el ARN de interferencia
transfecciones se realizaron utilizando ARN tremeGENE-X ARNsi reactivo de transfección (Roche, Basilea, Suiza) o Lipofectamine ™ 2000 Reactivo de transfección (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las recomendaciones del fabricante. Las células se sembraron en medio de McCoy con 10% de FBS, sin antibióticos, y se incubaron durante la noche. Poco antes de la transfección medio fue cambiado por Opti-MEM® I medio de suero reducido (Gibco, Invitrogen). Las células fueron transfectadas con 100 nM dúplex de siRNA dirigidos contra PPAR (# 29455, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) o el control no objetivo siRNA (# 37007, Santa Cruz Biotechnology). Después de 4 h, el medio se cambió por medio de McCoy con 10% de SFB (PAA Laboratories GmbH y Gibco, Invitrogen) con antibióticos. Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron pretratadas (24 h) con RGZ y posteriormente tratada (48 h) con LA-12.
análisis de inmunotransferencia
Las células se lisaron en 1% SDS de tampón de lisis que contenía cóctel inhibidor de la proteasa (# P2714, Sigma-Aldrich) o inhibidor de la proteasa Cocktail Set I (# 5391313, Calbiochem, Merck Millipore, Bedford, MA, EE.UU.), para la detección fosfoproteína Navo se añadieron
4 y NaF para la solución de lisis. DC ™ ensayo de proteínas (# 500-0113, Bio-Rad Laboratories, Praga, República Checa) se utilizó para la cuantificación de proteínas. Las proteínas fueron separadas en 15% de gel de SDS-poliacrilamida, y se transfirieron a una membrana de PVDF (Merck Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5% o BSA durante 1 h a TA, se lavó con TBS (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM y 0,1% de Tween), y se incubaron durante la noche en anticuerpos primarios diluidos en 5% sin grasa de la leche a 4 ° C. La inmunodetección se realizó utilizando los siguientes anticuerpos primarios: ratón monoclonal anti-p53 (1: 000, DO-1,#126) generado contra los aminoácidos 11 a 25 de p53 de origen humano, de conejo policlonal anti-Akt (1: 500,#8312) contra los aminoácidos 345 a 480 de Akt1 de origen humano, ratón monoclonal anti-ciclina B1 (1: 1000,#245) contra una proteína recombinante correspondiente a la ciclina B1 humano, D1 monoclonal de ratón anti-ciclina (1: 1000,#20044) contra la proteína recombinante humana de longitud completa, ratón monoclonal anti-PTEN (1: 500,#7974) contra los aminoácidos 388 a 400 de PTEN de origen humano, policlonal de conejo anti-p21 (1: 000,#397) generado contra un mapeo de péptidos en el extremo C-terminal de p21 de origen humano, policlonal de conejo anti-p27 (1: 1000,#528) generado contra un mapeo de péptidos en el extremo C-terminal de p27 de origen humano (todos de Santa Cruz Biotechnology), policlonal de conejo anti-fosfo-Akt (Ser473) (1: 500,#9271) producido por inmunización de animales con un fosfopéptido sintético que corresponde a los residuos que rodean Ser473 de ratón Akt purificó por proteína a, de conejo policlonal anti-Bak (1: 1000,#3792) producido por inmunización de conejos con un péptido sintético (acoplado-KLH) correspondiente a los residuos amino-terminal de humano Bak purificado por proteína a, de conejo policlonal anti-Bax (1: 1000,#2772), producido por la inmunización animales con un péptido sintético (acoplado-KLH) que corresponden a los residuos amino-terminal de Bax humana purificados por la proteína a, de conejo policlonal anti-Bid (1: 1000,#2002) producido por inmunización de animales con un péptido sintético (KLH- purificado-Bid acoplado) correspondiente a los residuos que rodean el sitio de escisión de humano por la proteína a, de conejo monoclonal anti-Bim (1: 1000,#2933) producido por inmunización de animales con un péptido sintético correspondiente a los residuos que rodean Pro25 de Bim, anti ratón monoclonal -Chk2 (1: 000,#3440) producido por inmunización de animales con truncada recombinante GST-Chk2, policlonal de conejo anti-escinde la caspasa-3 (1: 500,#9661) producido por inmunización de animales con un péptido sintético correspondiente a los amino-terminal residuos adyacentes a (Asp175) en la caspasa-3 humana, policlonal de conejo anti-exfoliados caspasa-9 (1: 500,#9505) producido por inmunización de animales con un péptido sintético correspondiente a los residuos amino-terminal que rodean a Asp330 de la caspasa-9 humana - purificado por la proteína a, de conejo policlonal anti-ERK (1: 1000,#9102) producido por inmunización de animales con un péptido sintético (KLH acoplada) derivada de una secuencia en el C-terminal de p44 de rata MAP quinasa purificado por proteína a , policlonal de conejo anti-fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (1: 1000,#9101) producido por inmunización de animales con un fosfopéptido sintético que corresponde a los residuos que rodean Thr202 /Tyr204 de p44 humana MAP quinasa purificado por proteína a , policlonal de conejo anti-PARP escindida (Asp214) (1: 1000,#9541) producido por inmunización de animales con un péptido sintético correspondiente a carboxi-terminal residuos que rodean Asp214 en humanos PARP-purificó por la proteína a, de conejo policlonal anti-proliferador de peroxisomas γ receptor activado (PPAR) (1: 500,#2435) producidos mediante la inmunización de conejos con un péptido sintético correspondiente a los residuos que rodean Asp69 de PPAR humano, de conejo policlonal anti-Puma (1: 1000,#4976), producido por inmunización de animales con un péptido sintético correspondiente a la región carboxi-terminal de humano Puma purificó por proteína a, de conejo monoclonal anti-survivin (1: 1000,#2808) producido por inmunización de animales con un péptido sintético correspondiente a los residuos que rodean la cisteína 60 de la survivina humana ( todos de Cell Signaling Technology), monoclonal de ratón anti-Noxa (OP180; Calbiochem-MERC, Praga, República Checa) con el inmunógeno de GST-fusión con Noxa recombinante humana, de ratón anti-citocromo c (1: 500,#556433, BD Pharmingen ™, San José, EE.UU.) con péptidos sintéticos de la paloma citocromo c como inmunógeno, monoclonal de ratón anti-complejo IV subunidad II (anti-cyt oxidasa subunidad II) (# A-6404, Invitrogen ™, Life Technologies) con el complejo humano IV subunidad II como inmunógeno. A continuación, las membranas se lavaron y se incubaron con secundarios anticuerpos anti-IgG de ratón (1: 3000,#NA931) y el anticuerpo anti-IgG de conejo (1: 3000,#NA934) (ambos de Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.) para 1 h a TA. La detección de los complejos de anticuerpo se realizó con sustratos de peroxidasa de rábano picante Immobilon Western quimioluminiscente HRP Sustrato (# WBKLS0500, Merck Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Anti-β-actina de anticuerpos (1: 5000, A5441; Sigma-Aldrich), con β-actina citoplásmica ligeramente modificada del péptido N-terminal, Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile- Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys, conjugado con KLH como inmunógeno, se utilizó para un control de carga.
Preparación de fracciones de células
Las células se cosecharon por tripsinización, se centrifugaron a 200 g durante 5 min, se resuspendieron en tampón de la fracción (150 mM KCl, 1 mM de MgCl2, EGTA 0,2 mM, Tris 5 mM y 0,01% de digitonina pH 7.2 a 7.4) y se dejó en RT durante 20 minutos para lisar. Las células lisadas se centrifugaron a 13 000 rpm, los sobrenadantes se utilizaron para las fracciones citoplasmáticas y los pellets se resuspendieron en la misma cantidad de tampón fracción mixta con tampón 4x Laemmlli, se hirvieron durante 10 min y se utilizaron las muestras después de la cuantificación de proteínas en el análisis de inmunotransferencia.
Análisis del potencial de membrana mitocondrial (MMP)
La detección de MMP utilizando 0,2 M tetrametilrodamina éster etílico perclorato (TMRE; Molecular Probes®, Eugene, Oregón, EE.UU.) como se describe anteriormente [30] y analizaron mediante citometría de flujo (FACS Calibur
TM, Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). Los datos se evaluaron por el software CellQuest (Becton Dickinson) y los resultados se expresaron como el porcentaje de las células con disminución de MMP.
anexina V /yoduro de propidio apoptosis ensayo
Para externalización de la fosfatidilserina como un marcador de la apoptosis, las células se recogieron, se lavaron con PBS y se tiñeron con anexina V de anticuerpo conjugado con FITC (# ANXV-FT100, Apronex, Praga, República Checa) durante 20 min en RT con fabrica 'tampón suministrado específico. Inmediatamente antes del análisis, (,#P-4170 Sigma-Aldrich) se añadieron 5 g /ml de yoduro de propidio (PI). a continuación, la fluorescencia se midió utilizando citómetro de flujo (FACS Calibur
TM, Becton Dickinson). El uso de la célula de software Quest, los resultados se expresaron como el porcentaje de las células positivas para anexina V y negativas para el yoduro de propidio (apoptosis).
análisis del ciclo celular
Las células se procesaron tal como se describe anteriormente [22] y se analizaron por citometría de flujo (FACSVerse
TM; Becton Dickinson); mínimo de 20 000 eventos fueron recogidos por muestra. Los datos fueron analizados usando la versión 3.1 del software ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, EE.UU.). Se excluyeron las células de escombros y doblete y se tomaron sólo las células individuales para el análisis del ciclo celular. Los resultados se expresaron como el porcentaje de las células en G1, S y G2 /M fase.
activa la caspasa-3 Detección
Se recogieron las células, se lavaron en PBS, se fijaron y tiñeron utilizando FITC kit activa la caspasa-3 apoptosis (# 550480, BD Pharmingen ™) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El porcentaje de células con la caspasa-3 activa se detectó por citometría de flujo (FACS Verso
TM, Becton Dickinson) y se analizó por la versión de software BD FACSuite 1.0.5 (Becton Dickinson).
Detección simultánea de activo se recogieron las caspasa-3 y la progresión del ciclo celular
las células, se lavaron en PBS, se fijaron y tiñeron utilizando FITC kit activa la caspasa-3 apoptosis (# 550480, BD Pharmingen ™) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente, las células se lavaron y se tiñeron con yoduro de propidio para el análisis del ciclo celular como se describió anteriormente. El porcentaje de las células en G1, S y G2 /M fase con la caspasa-3 activa se detectó por citometría de flujo (FACS Verso
TM, Becton Dickinson) y se analizó por BD FACSuite versión de software 1.0.5 (Becton Dickinson).
ARN aislamiento y en tiempo real de RT-PCR
aislamiento de ARN.
Inmediatamente después de la recolección, 1x10
6 células se volvieron a suspender en 200 l de PBS, se homogeneizaron en 400 l kit de lisis /tampón de unión y se congeló a -80 ° C hasta el momento de aislamiento de ARN. aislamiento de ARN total se realizó con alta Kit Aislamiento de ARN Pure (Roche, Suiza) según las instrucciones del fabricante. cantidad y pureza del ARN se evaluaron mediante espectroscopía UV y una alícuota de ARN se transcribe inversamente en ADNc.
síntesis de ADNc.
ADNc se sintetiza a partir de 1 g de ARN total en un Transcriptor primer capítulo de cDNA síntesis kit (Roche, Suiza) según las instrucciones del fabricante, utilizando siempre cebadores oligo-dT (1 l) y cebadores hexámeros al azar (2 l) en un volumen total de 20 l.
real-Time PCR cuantitativa.
0,5 l de cada ADNc se analizó mediante PCR cuantitativa mediante la expresión TaqMan genes Master Mix y ensayos de expresión TaqMan gene (Life Technologies, EE.UU.) CCND1, ciclina D1 (Hs00765553_m1), BIRC5, survivina (Hs04194392_s1), CDKN1A, p21 (Hs00355782_m1), CDKN1B, p27 (Hs01597588_m1), CCNB1, ciclina B1 (Hs01030099_m1), HPRT1 (Hs99999909_m1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un volumen total de reacción de 10 l. Todas las reacciones de PCR se realizaron en tres repeticiones técnica en RotorGene 6000 instrumento (Corbett Life Science, Australia). PCR perfil térmico fue el siguiente: 50 ° C durante 2 min (UDG de incubación), 95 ° C durante 10 min (activación de la enzima), seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. controles NTC y RT- se incluyeron en cada ejecución. El análisis de datos se realizó mediante el método DDCT con HPRT1 utiliza como la limpieza de genes.
Datos estadísticos de análisis
Los datos se expresan como media +/- S.E.M. de tres experimentos independientes, y se analizaron estadísticamente mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba (LSD) con una significación estadística p & lt mínima diferencia significativa de Fisher; 0,05, utilizando Statistica para Windows, V 10 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, EE.UU.) .
con el fin de examinar con más detalle el interactiva (sinergismo o aditividad) efectos citotóxicos entre los fármacos, los resultados del análisis de la apoptosis (anexina V /ensayo de yoduro de propidio, citometría de flujo, porcentaje de anexina V positivas, de propidio yoduro de células HCT116 negativos) después del tratamiento con varias dosis diferentes de rosiglitazona (hasta 75 mM) y lA-12 (hasta 1,5 M) o sus combinaciones se examinaron. Construcción de curvas de regresión y el cálculo de las cantidades equieficaces de los agentes en la mezcla se hace usando el análisis isobolográfico en software GraphPad Prism 6. Las dosis de los fármacos suficientes para el efecto sinérgico se calcularon y se determinó el tipo de la respuesta.
Resultados
RGZ mejorada HCT116 de colon humano sensibilidad de las células de cáncer para inducida-LA-12 apoptosis dependiente de caspasa
el pretratamiento de la línea celular de adenocarcinoma humano HCT116 en peso con rosiglitazona estimula eficazmente la apoptosis lA-12-inducida, como se demuestra por un aumento significativo en el porcentaje de las células con específica externalización fosfatidil serina (Fig 1A; S1 Fig), y la escisión de caspasa-3 y PARP su sustrato (Fig 1B). Un análisis isobolográfico de la respuesta apoptótica de las células HCT116 a varias dosis diferentes de rosiglitazona y LA-12 se utiliza en combinación (ver Materiales y métodos) demostró claramente un efecto sinérgico significativo (datos no mostrados). El uso de un inhibidor de pan-caspasa z-VAD-FMK, se confirmó que los efectos apoptóticos de la combinación de fármacos totalmente dependía de la activación de caspasas (Figura 1A y 1B). La estimulación significativa de los efectos apoptóticos (externalización de fosfatidilserina) inducida por LA-12 y rosiglitazona combinación en comparación con los fármacos individuales se demostró también en líneas celulares DLD-1 y RKO adenocarconima colon humano (Figura 1C).
(a) Porcentaje de apoptosis (yoduro anexina V positiva /propidio negativo, citometría de flujo) de las células HCT116 en peso y (b) la escisión de la caspasa-3 y PARP (transferencia de Western) después de pretratamiento (24 h) con rosiglitazona (RGZ, 50 M) y posterior tratamiento (48 h) con lA-12 (0,75 M), en ausencia (DMSO) o presencia de z-VAD-fmk (10 M). (C) Porcentaje de apoptosis (yoduro anexina V positiva /propidio negativo, citometría de flujo) células RKO o DLD1 después del pretratamiento (24 h) con rosiglitazona (RGZ, 50 M) y el tratamiento posterior (48 h) con LA-12 (0,75 M ). Los resultados son medias + S.E.M. o representantes de tres experimentos independientes. La significación estadística: P & lt; 0,05, * frente al control, ‡ frente RGZ, frente Ο LA-12, y Δ para con /sin z-VAD-FMK.
Las mitocondrias juegan un papel indispensable en la mejora de la apoptosis de las células HCT116 después de su tratamiento combinado con rosiglitazona y lA-12
la respuesta apoptótica de las células wt HCT116 tratados con la combinación de rosiglitazona y lA-12 se asoció con la estimulación de la vía mitocondrial, como se indica por la mayor liberación de citocromo c en el citoplasma (Fig 2A), la escisión de la caspasa-9 (Fig 2B) y gota de MMP (Fig 2C). Un papel funcional de las mitocondrias se confirmó usando HCT116 Bax - células, donde los efectos apoptóticos de la combinación de fármacos se suprimieron significativamente - /. Esto se demostró por un bloqueo de la caspasa-9 y la escisión de PARP (Figura 2B), y la caída de MMP (Fig 2C) en HCT116 Bax - células tratadas por la combinación de rosiglitazona y LA-12 en comparación con sus homólogos WT - /. Tras el tratamiento con células HCT116 en peso con la combinación de fármacos, un mayor nivel de pro-apoptóticos BH3-sólo las proteínas Noxa y Bim (23 y 15 kDa, que corresponde a EL y la forma L, respectivamente) se observó, mientras que el nivel de Puma y puja permaneció en gran parte no afectada. Un ligero aumento de Bax y Bak nivel de proteínas también fue evidente en las células HCT116 WT-12 tratadas con LA (figura 2D).
(a) La liberación de citocromo c en el citoplasma (fracción citoplásmica) de las células HCT116 pretratado (24 h) con rosiglitazona (RGZ, 50 mM) y se trató posteriormente (48 h) con lA-12 (0,75 M), detectado mediante transferencia Western después del fraccionamiento celular. (B) La escisión de la caspasa-9, PARP, el nivel de proteína Bax (Western Blot), y (c) los cambios en el potencial de membrana mitocondrial (MMP, citometría de flujo) en peso HCT116 y Bax - /- células tratadas como en a). (D) El nivel de Noxa, Bim, Puma, Bid, Bax y Bak proteínas (Western Blot) en las células HCT116 tratadas en peso como en a). Los resultados son medias + S.E.M. o representantes de tres experimentos independientes. La significación estadística: P & lt; 0,05, * frente al control, ‡ frente RGZ o Ο frente a LA-12, y Δ de peso frente a Bax - /-. Células
La apoptosis rosiglitazona y LA-12 inducida se produce preferentemente en G1 fase del ciclo celular HCT116
a flujo simultáneo citometría de análisis de la apoptosis de las células (de escisión de caspasa-3) y el ciclo celular reveló que las células tratadas con la combinación de fármacos preferentemente mueren de la G1 (y a menor medida, también S ) fase (Fig 3A y 3B). En las condiciones de deficiencia de Bax, significativamente más bajo porcentaje de las células tratadas con la combinación de fármacos sufrió la apoptosis en comparación con sus homólogos que expresan Bax, y estas células apoptóticas estaban en la fase G1 del ciclo celular (Fig 3A)
.
( a) la caspasa-3 de activación (% de todas las células con la caspasa-3 activa) relacionado con la progresión del ciclo celular (citometría de flujo) en peso de HCT116 y Bax - /- células después de su tratamiento previo (24 h) con rosiglitazona (RGZ, 50 micras ), y posterior tratamiento (48 h) con lA-12 (0,75 M) (b) Porcentaje de células apoptóticas (con la caspasa-3 activa) en la fase G1 del ciclo celular, la cuantificación de datos a partir de a). Los resultados son medias + S.E.M. o representantes de tres experimentos independientes. La significación estadística: P & lt; 0,05, * frente al control, ‡ frente RGZ, frente Ο LA-12, y Δ de peso en comparación con Bax - /-. Células
Como p53 y Chk2 pueden actuar ciclo celular tan importante (incluyendo G1 o la puesta en fase M) y reguladores de la apoptosis, se investigó su posible implicación en la modulación de la mejora de la rosiglitazona mediada de sensibilidad de las células HCT116 a la apoptosis inducida-lA-12. Nuestros resultados muestran que tanto p53 y Chk2 son prescindibles para la apoptosis desencadenada por la combinación de fármacos, como se observó respuesta similar (caspasa-3, caspasa-9, la escisión de PARP) en los padres y apropiado extraer (p53 - /-, Chk2- /-) líneas de células (Fig 4)
la escisión de caspasa-9, caspasa-3, PARP y el nivel de proteínas de Chk2 y p53 en HCT116 en peso, Chk2 -. /- y p53 - /- células pretratadas (24 h) con rosiglitazona (RGZ, 50 mM), y se trató posteriormente (48 h) con lA-12 (0,75 M), detectado mediante transferencia Western. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
deficiencia de PTEN mejora relacionados con la fase G1-compatible de la apoptosis mitocondrial dependiente inducida por rosiglitazona y LA-12 en las células HCT116
tratamiento de HCT116
Combinado WT células con rosiglitazona y lA-12 inducida por una disminución en el nivel de PTEN (figura 5A), que fue acompañado por un aumento de la activación de Akt (Ser473 fosforilación en), sin cambios en el nivel total de proteína quinasa (Fig S2). Con el fin de investigar el papel funcional de PTEN, la respuesta citotóxica de la combinación de fármacos se comparó en células HCT116 que expresan o carecen de la proteína. HCT116 PTEN - /- células fueron más sensibles a los efectos apoptóticos de LA-12 solo y aún más a su combinación con rosiglitazona, como se muestra por una PARP mejorada y la caspasa-9 de escisión (Fig 5A), y un aumento de la caída de la membrana mitocondrial potencial (Fig 5B) en comparación con sus homólogos HCT116 WT. A destrucción preferencial de la fase G1 del ciclo celular inducida por la combinación de fármacos en las células WT HCT116 fue más apoyado aún más en ausencia de PTEN, donde el porcentaje de células apoptóticas (con la activación de caspasa-3) aumentó significativamente (Fig 5C). La estimulación de la apoptosis de drogas relacionadas con G1-fase combinación inducida también fue evidente en los puntos de tiempo posteriores de los tratamientos (datos no mostrados).
(a) La escisión de PARP, caspasa-9 y el nivel de PTEN (Western blotting), (b) cambios en el potencial de membrana mitocondrial (MMP, citometría de flujo), y porcentaje (c) de las células apoptóticas (con la caspasa-3 activa) en la fase G1 del ciclo celular en peso HCT116 o PTEN - células pretratadas (24 - /h) con rosiglitazona (RGZ, 50 mM), y se trató posteriormente (48 h) con lA-12 (0,75 M). (D, e) Porcentaje de peso HCT116 y PTEN - /- células en fases del ciclo celular individuales (citometría de flujo) después de los tratamientos especificados en a-c). Los resultados son medias + S.E.M. o representantes de tres experimentos independientes. La significación estadística: P & lt; 0,05, * versus control, ‡ frente RGZ, Ο frente a LA-12, y Δ de peso frente a PTEN - /-. Células
Mientras rosiglitazona solo no afectó a la distribución del ciclo celular en comparación con el control, se observó una disminución significativa en el porcentaje de células HCT116 en peso en la fase G1, y aumento simultáneo de la fase G2 /M después de su exposición a la lA-12 o su combinación con rosiglitazona (Fig 5D). de tres experimentos independientes. de tres experimentos independientes.