Extracto
Objetivos
El desarrollo del cáncer y la progresión no sólo se asocian con la proliferación de células tumorales, pero también depende de la interacción entre las células tumorales y el microentorno del estroma. Una nueva comprensión de la función del microambiente del tumor sugiere que la pérdida de estroma caveolina-1 (Cav-1) como un regulador clave puede convertirse en un objetivo de la terapia potencial. Este estudio pretende dilucidar si estromal Cav-1 de expresión en el cáncer de páncreas puede ser un fuerte biomarcador pronóstico.
Métodos
Se estudiaron muestras de tejido de 45 pacientes con cáncer de páncreas. Parénquima y estroma se separaron y se purificaron utilizando láser captura microdissection. Estromal Cav-1 de expresión se midió desde el cáncer de páncreas, paraneoplásico, y el tejido normal mediante inmunohistoquímica. Se analizó la correlación de estroma Cav-1 de expresión con las características clínico-patológicas e indicadores de pronóstico, tales como marcador tumoral gen HER-2 /neu.
Resultados
Las muestras de seis pacientes (13,3%) mostró altos niveles de estroma Cav-1 tinción, los de ocho pacientes (17,8%) mostraron un nivel intermedio bajo de tinción, mientras que los de 31 pacientes (68,9%) mostraron una ausencia de tinción. Cav-1 expresión en fibroblastos asociados con el cáncer fue menor que en paracancer asociada y en fibroblastos normales. Estromal Cav-1 pérdida se asocia con el estadio TNM (
P = 0,018
), metástasis de ganglios linfáticos (
P = 0,014
), metástasis a distancia (
P = 0,027
) y la amplificación de HER-2 /neu (
P
= 0,007). Las relaciones de la edad, sexo, grado histológico, y el tamaño del tumor con estroma Cav-1 expresión no fueron significativas (
P
& gt; 0,05). Se encontró una correlación negativa entre las células tumorales y estroma de Cav-1 de expresión de circulación (
P Hotel & lt; 0,05).
Conclusión
La pérdida de estroma Cav-1 en páncreas cáncer era un indicador pronóstico independiente, lo que sugiere que estromal Cav-1 puede ser una diana terapéutica eficaz para los pacientes con cáncer de páncreas
Visto:. Shan T, H Lu, Ji H, Li Y, Guo J, Chen X, et al. (2014) La pérdida de estroma caveolina-1 de expresión: A Novel tumor microambiente de biomarcadores que puedan predecir pobres resultados clínicos para el cáncer pancreático. PLoS ONE 9 (6): e97239. doi: 10.1371 /journal.pone.0097239
Editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Francia |
Recibido: 25 Octubre, 2013; Aceptado: April 16, 2014; Publicado: 20 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Shan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por el Gran Científica de Shaanxi (2012SXKG-21). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas tiene una tasa de supervivencia de menos del 25% a los cinco años después de la duodenopancreatectomía parcial y es uno de los tumores malignos humanos más agresivos y difíciles [1]. Estudios recientes han demostrado que el microambiente tienen una función en la progresión de tumores epiteliales malignos, pone de relieve la importancia de la comprensión de las células estromales en la prevención de la agresión de células cancerosas y las estrategias de tratamiento contra el cáncer [2]. Para entender completamente el mecanismo de accionamiento recurrencia del tumor, metástasis, y el resultado clínico en pacientes con cáncer, el papel de la microambiente tumoral debe ser examinado. En particular, los fibroblastos, asociados con el cáncer (CAF) se ha encontrado que cumplir una función fundamental a través de interacciones paracrinas con células cancerosas epiteliales adyacentes [3], [4].
caveolinas (Cav) comprenden una familia de proteínas de andamiaje que las invaginaciones de membrana plasmática capa 50 nm a 100 nm [5]. La familia Cav se compone de tres isoformas: Cav-1, CAV-2, y CAV-3. El gen de Cav-1 se encuentra en el cromosoma 7 (7q31.1 locus) e incluye tres exones (30, 165, y 342 pb) y dos intrones (1,5 y 32 kb). Cav-1 es un componente estructural de caveolae implicado en diversas funciones celulares, como el transporte vesicular, la homeostasis del colesterol, y la transducción de señales [6]. A pesar de un creciente cuerpo de evidencia sobre Cav-1 implicación en la tumorigénesis, si Cav-1 actúa como un supresor de tumores o como un oncogén sigue sin estar clara. Estos resultados contradictorios son probablemente derivan del estudio de los tumores epiteliales malignos [7], [8], [9]. Un nuevo paradigma de "el modelo de tumor de estroma autofagia del metabolismo del cáncer" fue introducido recientemente para facilitar la comprensión de la función de microambientes tumorales [10], [11]. En este modelo, la pérdida de estroma Cav-1 como un regulador clave es un objetivo potencial de la terapia, lo que sugiere la importancia pronóstica de estroma Cav-1 [12]. La pérdida de estroma Cav-1 es el único predictor independiente de recurrencia del cáncer de mama temprano y la progresión [7]. Ayala et al. informaron que la pérdida de estroma Cav-1 contribuyó al comportamiento metastásico de células de cáncer de próstata a través de un mecanismo que implica la regulación al alza de TGF-β1 y SNCG través de la activación de Akt [13]. Zhao et al. informó que Cav-1 nivel de expresión en los CAF predijo los resultados del cáncer gástrico [14]. Karen et al. afirmó que la pérdida de estroma Cav-1 de expresión en metástasis de melanoma maligno predijo pobre supervivencia [15]. Sin embargo, estroma Cav-1 expresión en el cáncer de páncreas, así como su importancia clínica, no está claro. Para dilucidar la función del estroma Cav-1 en el cáncer de páncreas, se investigó el estroma Cav-1 expresión en muestras de cáncer de páncreas, junto con la correlación de estroma Cav-1 de expresión con marcador tumoral HER-2 /neu y un número de tumor circulantes células (CTC).
Materiales y Métodos
Las muestras de pacientes
entre enero de 2007 diciembre de 2012, los tejidos de cáncer de páncreas (incluyendo muestras de tejido tumoral de tamaño adecuado y muestras de tejidos obtenidos a partir de áreas dentro de 2,0 cm del tumor) se obtuvieron de 45 pacientes sometidos a duodenopancreatectomía parcial (Whipple) para el cáncer de páncreas en el Departamento de Cirugía Hepatobiliar y páncreas, Primera y Segunda hospitales afiliados de la Universidad Jiaotong de Xi'an. Una parte de cada muestra se congeló y se preparó para la microdisección de captura por láser (LCM); otras porciones de muestras se fijaron con formalina al 10% para estudios histológicos. Diez muestras que contienen tejidos pancreáticos normales de los pacientes que recibieron la pancreatectomía parcial para tumores benignos se utilizaron como controles normales. De los 45 pacientes estudiados, 24 eran hombres y 21 eran mujeres. La mediana de edad en el momento de la cirugía fue de 64,5 años (rango de 44 a 82 años años). Todos los 45 pacientes tenían adenocarcinoma ductal pancreático. El estadio del tumor y clasificación histopatológica se registraron de acuerdo con la clasificación de la Unión Internacional Contra el Cáncer. Tres pacientes tenían tumores en estadio I, 11 en estadio II, 27 en estadio III, y 4 pacientes tenían tumores en etapa IV. grados histológicos tumorales fueron los siguientes: 7 pacientes tenían grado I, 20 con grado II, y 18 tenían tumores de grado III. Todos los pacientes participaron en el procedimiento de seguimiento. El tiempo medio de seguimiento fue de 22 meses (rango de 4 meses a 52 meses). Estas muestras fueron obtenidas de donantes o los familiares que firmaron un consentimiento informado por escrito. Los estudios fueron aprobados por el Comité de Ética de la Junta y de Revisión Institucional de la Universidad Jiaotong de Xi'an, China.
La inmunohistoquímica
proteína de Cav-1 se detectó mediante inmunohistoquímica utilizando el método de estreptavidina-peroxidasa estandarizado. Las secciones de tejido (4 M) se incubaron durante la noche con una concentración de anticuerpo primario estándar. Los portaobjetos se incubaron durante 30 min con anticuerpo de cabra biotinilado anti-IgG de conejo, seguido de incubación con estreptavidina conjugada con peroxidasa durante 20 min a temperatura ambiente. El color se desarrolló utilizando una solución de 0,02% de 3, 3'-diaminobencidina en tampón 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) durante 5 min a 7 min. Por último, las secciones se counterstained con hematoxilina, se enjuagan con agua, se deshidrató, borran, y la cubierta se deslizó. En los controles negativos para la inmunotinción, el anticuerpo primario fue sustituido con IgG de cabra no inmune o suero de conejo. Se determinó el número de células teñidas por 1000 bajo un microscopio (Olympus Optical Co, Ltd, Tokio, Japón) en tres campos visuales, con un aumento de 400 ×. Cuando el número total de células observadas bajo el microscopio era de menos de 1.000, se contaron todas las células. La tinción se anotó semicuantitativamente como negativo (0; sin manchas), débil (1, ya sea tinción débil o fuerte tinción en menos de 30% de las células del estroma difusa), o fuerte (2; define como una fuerte tinción de 30% o más de la células estromales). Los anticuerpos contra CAV-1, vimentina, y β-actina fueron adquiridos de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU. o Santa Cruz, California, EE.UU.).
LCM
Las secciones congeladas (5 m de espesor ) de cáncer de páncreas, paraneoplásico, y el tejido normal se microdissected usando un sistema PixCell II LCM (Arcturus Ingeniería, Mountain View, California, EE.UU.). El sistema de captura de láser estaba equipado con el software de archivo de imágenes PixCell II. Los ajustes del láser fueron las siguientes: diámetro de punto de 15 micras, la duración de pulso de 50 ms, y el poder establecer a 50 mW. El tejido se microdissected a 10 secciones de cada muestra con un "tope" separado se utiliza para capturar el material de cada sección. Típicamente, se utilizaron 2500 a 3000 pulsos de láser para cada tapón. Después de microdisección, la película de plástico que contiene las células microdissected fue retirado del resto de la tapa, y se colocaron todas las películas que contienen material de una sola muestra en un tubo de microcentrífuga y se congeló en nitrógeno líquido o se almacenaron a -80 ° C para la extracción de mRNA . Las secciones congeladas se cortaron en un criostato. Las secciones se descongelan y se montaron en portaobjetos de vidrio no recubiertos. Las secciones congeladas se fijaron en etanol al 70% durante 30 s y se tiñeron con H & amp; E, seguido por tres etapas de deshidratación de 5 s cada uno en 70%, 95%, y 99,5% de etanol, y la final 5 min deshidratación en xileno. Dos factores importantes para garantizar la microdisección y el control del sesgo de selección a través de LCM satisfactoria son: (1) la necesidad de un patólogo entrenado para discriminar poblaciones específicas de células enfermas, tales como CAF, visualmente; y (2) la ausencia de hoja de la cubierta en el análisis de sección de tejido microdisecado. La ausencia de una hoja de cubierta y de la coincidencia de índice entre los medios de montaje y el tejido hacer que la sección de tejido seco para tener una calidad refráctiles que oscurece detalle celular con grandes aumentos. Para mejorar la visualización, se añade una gota de xileno al tejido para proporcionar humectación y para facilitar la adaptación de índice de refracción.
RT-PCR y PCR en tiempo real
El ARN total fue extraído a partir de páncreas tumoral, paraneoplásico, y muestras de tejidos normales usando reactivo Trizol (Gibco BRL, Life Technology, Grand Island, Nueva York, EE.UU.).
Primera línea de cDNA fue sintetizado a partir de 2 g de ARN total usando el kit de RevertAid ( Fermentas MBI, Waltham, Massachusetts, EE.UU.). Los conjuntos de cebadores de PCR se diseñaron como sigue: 1) para Cav-1 (140 pb), transmita CTGGGCTGTTCTCGCTTCG-3 'e inverso 5'-CTCTCCTCTTCCTTCTCTTCTTCC-3'; y 2) para la β-actina (179 pb), hacia adelante 5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 'y 5'-revertir AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'. Las condiciones de PCR incluyeron un primer paso de desnaturalización durante 5 min a 94 ° C seguido de 22 ciclos de amplificación: 30 segundos a 94 ° C, 30 seg a 55 ° C y 30 segundos a 72 ° C. Después del último ciclo, una extensión final se realizó a 72 ° C durante 10 min. El gen de mantenimiento, β-actina se utilizó como control interno.
PCR en tiempo real cuantitativa se realizó con Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen, EE.UU.) usando el Rotor-Gene RG-3000 (Corbett Research, Doncaster Victoria, Australia). Para cada uno de amplificación, se determinó la cantidad de Cav-1 y β-actina a partir de una curva estándar generada mediante dilución en serie. Antes de la amplificación, las muestras se incubaron a 95 ° C durante 10 min, y cada ciclo de amplificación consistieron en desnaturalización durante 45 seg a 95 ° C, recocido de 30 segundos a 57 ° C, y la extensión durante 30 segundos a 73 ° C. La cantidad de genes diana en las muestras de cDNA se calculó basándose en el ciclo umbral (Ct). Las señales de PCR se cuantificaron por análisis densitométrico utilizando un software Cantidad análisis.
Aislamiento y cultivo de fibroblastos humanos primarios
CAF y fibroblastos normales (NFS) se aislaron de cáncer de páncreas y parcial no canceroso especímenes pancreatectomía, respectivamente. Los especímenes fueron recogidos y trasladados al laboratorio. Después de varios lavados con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), 1 cm
2 secciones de tejidos se colocaron en los pocillos de los frascos de cultivo. Una vez que el tejido apareció para adjuntar a los matraces (5 h a 6 h), se añadió medio de Eagle modificado de Dulbecco que contenía suero bovino fetal al 10%. Las muestras fueron inspeccionados diariamente para la aparición de fibroblastos, y el medio se cambió después de 24 h y cada tres días, a partir de entonces. Las muestras de tejido fueron retirados de los cultivos una vez los fibroblastos alcanzaron 70% de confluencia (aproximadamente dos semanas), y fibroblastos se transfirieron a los grandes vasos de cultivo de tejidos. Todos los fibroblastos utilizados para este estudio eran de pasajes de 3 a 5. Los fibroblastos fueron verificados por tinción inmunohistoquímica positiva vimentina.
ensayo de inmunofluorescencia
p>
Hibridación Fluorescente In Situ
gen HER-2 /neu se amplificó con doble color (fluorescencia en hibridación in situ) FISH utilizando un Passvision HER-2 kit de sondas de ADN (Vysis Inc. Downers Grove, Illinois, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Entonces, 4 micras, espesor secciones de tejidos se cocieron durante la noche a 56 ° C y se sometieron a desparafinación, digestión con enzimas, y la fijación. Los portaobjetos se desnaturalizaron en formamida al 70% /dos veces citrato salino estándar a 72 ° C durante 5 min. Después de lavado con tampón, se añadió 10 l de una mezcla de dos sondas marcadas directamente (HER-2 /neu de la sonda específica de secuencia) a las secciones de tejido, y la hibridación se realizó a 37 ° C durante 14 h a 18 h. Los portaobjetos se lavaron en un lavado post-hibridación a 72 ° C, contrastados con 4, 6-diamino -2-fenilindol (DAPI), montados, y se almacenan en la oscuridad antes de la enumeración de señales. HER-2 sonda naranja /neu-espectro contiene una secuencia de ADN específica de la HER-2 /neu locus del gen y se hibridaron a la región 17q11.2-q12 de los cromosomas humanos. Cromosoma sonda de enumeración 17 (CEP17) /espectro sonda verde que contiene DNA satélite alfa que se hibrida con el locus D17Z1 (región del centrómero del cromosoma 17) se utilizó como control. Se observaron las diapositivas bajo el microscopio de fluorescencia equipado con una cámara digital (DP50; Olympus, Tokio, Japón). Para cada muestra, la amplificación del gen fue anotado cuando un mínimo de 20 núcleos de las células del cáncer registró una ratio de HER-2 /CEP17 ≥2 o cuando se observó un racimo de HER-2 de la señal.
El muestreo de sangre y el enriquecimiento de CTC
los formularios de consentimiento fueron aprobados por el Comité de Ética del Comité de sujetos Humanos de la Universidad Jiaotong de Xi'an, china y firmados por todos los pacientes del estudio. En primer lugar, se recogieron muestras de 7,5 ml de sangre periférica en tubos Vacutainer BD (Becton, Dickinson and Company, Franklin, Nueva Jersey, EE.UU.) y se lavaron con PBS. Para evitar la contaminación de las células epiteliales durante la punción venosa, se recogieron todas las muestras después de desechar los primeros 2 ml de sangre. glóbulos rojos (GR) se mezclaron con 45 ml de tampón de lisis (NH 155 mM
4Cl, mM de KHCO 10
3, EDTA 0,1 mM), seguido por la rotación de 8 min y centrifugación (600 g durante 5 min ) para eliminar los glóbulos rojos. El sedimento celular resultante se resuspendió en PBS y posteriormente se incubaron con 0,5 mL de marcador de superficie CD45 antileukocyte perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos monoclonales para 30 min, seguido de separación de perlas magnéticas usando un soporte magnético (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.). Los sobrenadantes se transfirieron a un nuevo tubo, y posteriormente se centrifugaron a 800 g durante 3 min. Los sedimentos celulares fueron vistos en portaobjetos de vidrio, seguido de (inmunofluorescencia hibridación in situ) tinción imFISH.
imFISH tinción (CEP8-CD45-DAPI)
enriquecimiento negativo de las células tumorales se llevó a cabo mediante el uso de inmunomagnética perlas, seguido de la identificación con el análisis de la citología. FISH se realizó utilizando sondas de ADN centrómero del cromosoma 8 (amarillo) (Vysis Inc. Downers Grove, Illinois, EE.UU.), y la inmunofluorescencia ensayo se lleva a cabo utilizando anti-CD45 (rojo) (Santa Cruz, California, EE.UU.). Los portaobjetos se lavaron tres veces con solución salina tris-tamponada (Tris 10 mM, KCl 2,8 mM, NaCl 137 mM, pH 7,4) (TBS) que contenía 0,2% de BSA durante 3 min y, posteriormente, se aclaró con TBS una vez. Las células se montaron con medio de montaje que contiene el tinte DAPI nuclear. Una revisión ciega de las imágenes fluorescentes por tres técnicos confirmó la identidad de los CTC a partir de imágenes fluorescentes de tres colores que fueron magnificados 400 veces. Los criterios de evaluación para la identificación de CTC a partir de imágenes fluorescentes incluyen tanto CEP8≥3 y CD45 (-) Pauta de tinción DAPI que recubre el núcleo de la
Análisis estadístico y los resultados del paciente
Los datos fueron analizados mediante el uso. la prueba de chi-cuadrado (χ2) o de dos caras prueba exacta de Fisher, según corresponda. coeficiente de correlación de Pearson se utilizó para medir la fuerza de la asociación entre HER-2 /neu niveles de expresión de Cav-1, la enumeración de los CTC, y. La tasa de supervivencia se calculó utilizando el método de Kaplan-Meier, y las diferencias fueron examinados por la prueba de log-rank. Los factores que se consideren significativos fueron seleccionados para una gradual modelo de riesgo proporcional de Cox multivariado de determinar sus valores pronósticos.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 13.0 (SPSS, Chicago, Illinois, EE.UU.).
Resultados
La expresión del estroma Cav-1 en el cáncer pancreático
Cav-1 se expresa tanto en la membrana y en el citoplasma de las células [16]. Para examinar el estado de la expresión del estroma Cav-1 en el cáncer de páncreas, se utilizó la inmunohistoquímica para evaluar el cáncer de páncreas, paraneoplásico, y las secciones de tejido normal. Nuestros resultados muestran imágenes representativas de CAV-1 secciones de tejido de anticuerpos de colores (Fig. 1), que pone de relieve las diferencias observadas en Cav-1 inmunotinción en el compartimiento del estroma fibroblástico. Curiosamente, Cav-1 de expresión era fuerte y limita principalmente al estroma en los tejidos normales y paraneoplásicos pero sólo de vez en cuando se detectó en el estroma tumoral. En 45 muestras de cáncer, 6 (13,3%) pacientes mostraron altos niveles de estroma Cav-1 tinción, mientras que 8 (17,8%) mostraron un nivel intermedio bajo de tinción, y 31 (68,9%) mostraron una ausencia de estroma Cav-1 tinción .
las secciones en parafina se immunostained como se describe en la sección de métodos. (N) El tejido normal fuertemente positiva para Cav-1 de expresión; (P) Paracancer tisular moderada de Cav-1 de expresión; (C) El tejido tumoral con la negativa de Cav-1 de expresión (× 400).
Analizar la PCR en muestras capturadas con láser
La pérdida de estroma Cav-1 es un factor pronóstico independiente de principios recurrencia del cáncer de mama y la progresión [17]. Nuestros datos también inmunohistoquímica mostró menor estromal Cav-1 de expresión en el cáncer de páncreas. Para verificar los datos de inmunohistoquímica aún más, nos separamos y el estroma purificada mediante LCM. Las células del estroma de las muestras de páncreas se microdissected con éxito del tumor, paraneoplásico, y las secciones normales. La técnica LCM causó ninguna alteración visible en la morfología de los especímenes disecados (Fig. 2A). Se analizaron secuencialmente la expresión de mRNA de Cav-1 en muestras de estroma láser capturado por RT-PCR y PCR en tiempo real (qPCR). El nivel de ARNm de Cav-1 fue significativamente degradado en muestras de tumores del estroma láser capturado en comparación con el paraneoplásico y el tejido normal (figuras 2B, 2C.) (
P Hotel & lt; 0,05).
A: diagrama esquemático que representa la técnica LCM. B: expresión de ARNm de estroma Cav-1 en muestras de láser capturado como se determina por RT-PCR. C: Cuantificación de mRNA por PCR en tiempo real cuantitativa. Los datos de al menos tres experimentos independientes con determinaciones por duplicado se expresan como medias ± SEM. (N) El tejido normal; tejido (P) Paracancer; (C) El tejido tumoral. *
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Expresión de Cav-1 en los CAF, PAF, y NFS
Para comprender mejor el estroma cavidad. 1 la expresión de proteínas en el estroma de páncreas (en su mayoría fibrocitos), primero se extrae CAF a partir de células de cáncer de páncreas, fibroblastos paracancer-asociado (PAF), el tejido paracancerous, y las federaciones nacionales de especímenes pancreatectomía parcial no cancerosas. Diferentes niveles de expresión de vimentina en los CAF estroma, PAF, y NFS se evaluaron mediante análisis de inmunohistoquímica. Estos resultados también verificaron que nuestro extracción de células fue exitosa (Figs. 3A, 3B). Posteriormente, se determinó y se analizaron estromal Cav-1 de expresión en los CAF y NFS teñidas con anticuerpo isotiocianato de fluoresceína de etiquetado de la IgG mediante microscopía confocal. CAV-1 señal de fluorescencia en los CAF fue menor que en las muestras de PAF y NF (Figura 3C.), Lo que sugiere que la CAV-1 se pierde en un microambiente del cáncer pancreático
A:. Cell característica morfológica de la CAF, PAF, y NFS (× 100). CAF extraídos de cáncer de páncreas y los PAF y las federaciones nacionales de tejidos y muestras paracancerous pancreatectomía parcial no cancerosas. B: Los diferentes niveles de expresión de vimentina en los CAF estroma, PAF, y NFS se evaluaron por inmunohistoquímica (x200). C: Cav-1 en la expresión de proteínas en los CAF y NFS teñidas con FITC-IgG etiquetado y analizadas por microscopía confocal. CAV-1 señal de fluorescencia en la CAF es menor que en los PAF y NFS (x200). (CAF) fibroblastos asociados con el cáncer; (PAF) Paracancerous fibroblastos asociados; (NFS) normal asociado fibroblastos.
Relaciones entre estroma Cav-1 Expresión y parámetros clínico
La Tabla 1 resume las asociaciones de estroma Cav-1 y la expresión de proteínas parámetros clínico en cáncer de páncreas . El estroma pérdida de Cav-1 se observó en seis de las 14 etapas I y II de los casos (42,9%) y fue significativamente menor que en los casos en estadio IV en estadio III (77,8%, 21 de 27 casos) y (100,0%, 4 de 4 casos ) (
P = 0,018
). Estromal pérdida de Cav-1 también se asoció con metástasis en los ganglios linfáticos (
P = 0,014
) y metástasis a distancia (
P = 0,027
). También se investigó la relación entre la edad, el sexo, el grado histológico, y el tamaño del tumor estromal con Cav-1 de expresión. Sin embargo, estadísticamente no se observaron relaciones significativas (
P Hotel & gt; 0,05).
Pérdida de estromales Cav-1 se correlaciona con HER-2 /neu amplificación génica
HER-2 /neu es un receptor del factor de crecimiento transmembrana, la sobreexpresión de que se reconoce como un factor pronóstico independiente adverso en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de páncreas [18], [19], [20], [21], [22 ], [23], [24], [25]. Para explorar más a fondo si la pérdida del estroma Cav-1 es un biomarcador pronóstico adverso en el cáncer de páncreas, se analizó la correlación entre el estroma de Cav-1 y la expresión de HER-2 amplificación de genes /neu. HER-2 /neu de amplificación de genes se evaluó mediante FISH, que se considera el estándar de oro para la medición del porcentaje de células positivas. Nuestros resultados mostraron que 64,4% de los adenocarcinomas pancreáticos exhibió HER-2 /neu amplificación de genes (Fig. 4). Estromal Cav-1 derrota tuvo una correlación positiva con HER-2 /neu amplificación génica (r = -0,697,
P
= 0,000, Tabla 2). Se observó por cuatro estromal pérdida de Cav-1 en las muestras que exhiben HER-2 amplificación de genes /neu. Por el contrario, en las muestras normales y peritumoral, estromales Cav-1 de expresión era alto cuando gen HER-2 /neu no se amplificó. En conclusión, estroma pérdida Cav-1 se correlacionó positivamente con la amplificación del gen HER-2 /neu
(N) El tejido normal negativo para la amplificación del gen HER-2 /neu.; (P) de tejido Paracancer moderada para la amplificación del gen HER-2 /neu; (C) El tejido tumoral positivo para HER-2 /neu amplificación de genes (× 1000).
Pérdida de estromales Cav-1 se correlaciona con CTC enumeración
CTC son tumoral células eliminadas desde el tumor primario en la sangre circulante. La presencia de las CTC en la sangre periférica de los pacientes se ha asociado con la metástasis y la supervivencia pobre, aunque la importancia biológica de las CTC atribuye a la inestabilidad genómica tumor y el potencial metastásico ineficacia ha sido objeto de debate [26]. En base a su relevancia clínica, CTC es recomendado por la American Society of Clinical Oncology ser un marcador de cáncer aceptable [27]. Para explorar más a fondo si la pérdida del estroma Cav-1 es un biomarcador pronóstico adverso, se analizó la correlación entre el estroma de Cav-1 de expresión y el recuento de CTC. Nuestros resultados mostraron que se detectaron CTC en un 35,71% (5/14) de los pacientes con cáncer de páncreas con estroma Cav-1 de expresión frente al 77,42% (24/31) de los pacientes con estroma Cav-1 derrota (Fig. 5). Por otra parte, se observó significativamente mayor recuento de CTC en pacientes con pérdida del estroma Cav-1 que en los pacientes con estroma Cav-1 de expresión (18.5 ± 2.0 en 7,5 ml de sangre vs 6.0 ± 1.5 en 7,5 ml de sangre). En conclusión, la pérdida del estroma Cav-1 se correlacionó positivamente con la enumeración CTC
A:. CTC negativo en pacientes con pérdida del estroma Cav-1. B: CTC positivas en pacientes con pérdida del estroma Cav-1. C: CTC negativos en pacientes con estroma Cav-1 de expresión. D: CTC positivas en pacientes con estroma Cav-1 de expresión. La barra de escala blanca indica 10 micras (x400).
Valores pronóstica de la pérdida del estroma Cav-1 en pacientes con cáncer pancreático
Para determinar el valor pronóstico del estroma Cav-1 para el cáncer de páncreas, se analizó la supervivencia acumulada de los pacientes según su estado de Cav-1 (Fig. 6). Estromal Cav-1 ausencia, como se indica por la falta de tinción, se consideró como negativo, mientras que la tinción débil o fuerte fue considerada como positiva. La tasa de supervivencia acumulada en el estroma de Cav-1 en pacientes negativos (n = 31) a los tres años fue del 8,8% (mediana de supervivencia de 16 meses). Por el contrario, la tasa de supervivencia acumulada en el estroma de Cav-1 en pacientes positivos (n = 14) fue del 20,2% (mediana de supervivencia de 28 meses), una diferencia que fue estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05).
Con base en el análisis multivariado, el resumen o de metástasis en los ganglios linfáticos en los tiempos de supervivencia acumulada a los tres años fue de 1,32 (IC 95%, 1,10-1,63), y TNM (III + IV /II + I ) etapa (OR = 1,27, IC 95%, 1,15-1,46) fue un factor pronóstico independiente de la supervivencia global en el estudio los pacientes con cáncer de páncreas. La pérdida de proteínas del estroma Cav-1 también fue un factor pronóstico independiente de la supervivencia global (
P = 0,006
). Sin embargo, el diámetro del tumor y otros parámetros clínicos fueron factores pronósticos dependientes.
Discusión
Los tumores sólidos ya no se consideran simplemente como la expansión clonal de las células cancerosas. Además de las propiedades intrínsecas de células adquiridas, la iniciación del tumor y el crecimiento están soportados por una abundancia de parénquima, los tipos de células inflamatorias, y del estroma, que se infiltran y rodean el tumor [28]. Nuestros resultados destacan la importancia de un microambiente que evoluciona y sugieren que la terapia debe dirigirse tanto a las células neoplásicas y las células del estroma de apoyo [29]. El modelo de tumor de estroma autophagic de metabolismo del cáncer [30] sugiere que la pérdida de estroma Cav-1 como un regulador clave es un objetivo potencial de la terapia, lo que sugiere además que estromal Cav-1 en las células estromales puede ser de importancia pronóstica. Por otra parte, una pérdida de estroma Cav-1 se ha notificado a ser un predictor de recurrencia temprana del tumor, metástasis a los ganglios linfáticos, la resistencia a tamoxifeno, y los pobres resultados clínicos en pacientes con cáncer de mama humano [17]. Investigamos estromal Cav-1 de expresión en el cáncer de páncreas para evaluar un posible papel de estroma Cav-1 como marcador pronóstico. Estromal Cav-1 se downregulated en el cáncer de páncreas en comparación con el tejido paraneoplásico y normal. La pérdida de estroma Cav-1 está estrechamente correlacionada con la etapa avanzada TNM, metástasis en los ganglios linfáticos, metástasis a distancia, y de mal pronóstico. La pérdida de estroma Cav-1 se correlaciona con la amplificación de los marcadores clásicos para la progresión del tumor (gen HER-2 /neu). Más importante aún, la pérdida de estroma Cav-1 se asoció con metástasis porque se encontraron células tumorales circulantes en la sangre del paciente. Estos hallazgos amplían nuestra comprensión de la función del estroma Cav-1 como un marcador de diagnóstico. Lo más importante, a nuestro entender, este estudio es el primero en mostrar que la pérdida de estroma Cav-1 en el cáncer de páncreas es un indicador pronóstico negativo. Sin embargo, el trabajo de Witkiewicz et al. [31] reveló que la co-expresión de FASN y Cav-1 puede ser un marcador clínico informativo. Witkiewicz et al. encontrado que Cav-1 y FASN tenían expresiones más altas en PDAs que en PanIN. Además de la tinción de células epiteliales neoplásicas, Cav-1 también estaba presente en los fibroblastos del estroma desmoplásico cáncer. Las células estromales en el páncreas normal o tejido pancreatitis crónica adyacente a las células tumorales fueron negativos, lo que está en contraste con nuestros hallazgos. Esta diferencia puede ser atribuida a la posibilidad de que el estudio de Witkiewicz et al. ocurrieron durante la inmunolocalización de las dos moléculas (Fasn y CAV-1), y los resultados se pueden atribuir a la interferencia mutua. Por otra parte, el utilizado Cav-1 Ab tenía una especificidad diferente. El método utilizado por Witkiewicz et al. (Inmunohistoquímica) es diferente de la utilizada en este estudio, en el que se empleó PCR con respecto a la cuantificación. Por último, la heterogeneidad de la muestra también puede haber afectado los resultados. Aunque las conclusiones de Witkiewicz et al. [17] son consistentes con los de nuestro estudio, un mayor estudio debe llevarse a cabo sobre este tema.
CTC son células tumorales desprendidas de tumor primario en la circulación sanguínea. La presencia de las CTC en la sangre periférica de los pacientes ha sido asociado con la metástasis y baja supervivencia [32] y ahora se considera un marcador de cáncer aceptable [27]. Sin embargo, las técnicas actuales son limitados. La prueba sólo está disponible comercialmente CTC (celular de la búsqueda; Veridex LLC, North Raritan, Nueva Jersey, EE.UU.) tiene una tasa de detección del 50% en pacientes en etapa tardía [33].