Extracto
Reprimo (RPRM), un efector aguas abajo de detención del ciclo celular inducida por p53 en G2 /M, se ha propuesto como un gen supresor de tumor putativo (TSG) y como un biomarcador potencial para la detección no invasiva de cáncer gástrico (GC). El objetivo de este estudio fue evaluar el silenciamiento epigenético del gen RPRM por la metilación del promotor y su función supresora de tumores en líneas celulares de GC. Además, se exploró la importancia clínica del producto proteico RPRM y su asociación con p53 /p73 de la familia proteína supresora de tumor. silenciamiento epigenético del gen RPRM por la metilación del promotor se evaluó en cuatro líneas celulares GC. Expresión de proteínas de RPRM se evaluó en 20 tumor y no tumor casos igualada. El significado clínico de la asociación RPRM con p53 /p73 supresor de tumores familia de proteínas se evaluó en 114 casos de CG. la función supresora de tumores se examinó mediante ensayos funcionales. la expresión génica RPRM se correlacionó negativamente con la metilación del promotor (rango de Spearman r = -1; p = 0,042). sobreexpresión RPRM inhibió la formación de colonias y el crecimiento independiente de anclaje. En muestras clínicas, se detectó la expresión de proteínas de genes RPRM en el 75% (15/20) de la mucosa adyacente no tumoral, pero sólo en 25% (5/20) de los tejidos tumorales gástricas (p = 0,001). correlaciones clínico-patológicas de pérdida de la expresión RPRM se asociaron significativamente con la fase invasiva de GC (etapa I a II-IV, p = 0,02) y una asociación positiva entre RPRM y expresión de la proteína del gen p73 se encontró (p & lt; 0,0001 y el valor kappa = 0,363 ). En conclusión, el silenciamiento epigenético del gen RPRM por el promotor de la metilación se asocia con la pérdida de expresión RPRM. Los ensayos funcionales sugieren que RPRM se comporta como ETG. La pérdida de expresión del producto proteico del gen RPRM está asociado con la etapa invasiva de la GC. asociación positiva entre RPRM y expresión de p73 sugiere que otros miembros de la familia de genes p53 podrán participar en la regulación de la expresión RPRM
Visto:. Saavedra K, J Valbuena, Olivares W, Marchant MJ, Rodríguez A, Torres Estay V, et al. (2015) La pérdida de expresión de Reprimo, una detención del ciclo celular p53 inducida, se correlaciona con invasiva etapa de la progresión tumoral y la expresión de p73 en el cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (5): e0125834. doi: 10.1371 /journal.pone.0125834
Editor Académico: Mohammed Soutto, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos |
Recibido: Enero 16, 2015; Aceptado: March 25, 2015; Publicado: May 8, 2015
Derechos de Autor © 2015 Saavedra et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel y su apoyo a los archivos de información
Financiación:.. Estos trabajos fue apoyado por becas CONICYT-FONDECYT#1111014 (AHC) y CONICYT-FONDAP#15130011 (AHC y JCR) del Gobierno de Chile
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer y el quinto más enfermedad común en todo el mundo [1]. A pesar de la disminución de la incidencia de GC, en parte debido al reconocimiento de ciertos factores de riesgo (por ejemplo,
Helicobacter pylori Opiniones y factores ambientales), sigue siendo uno de los cánceres más comunes en todo el mundo y sigue siendo un reto clínico [2 , 3]. carcinogénesis gástrica implica una acumulación gradual de las alteraciones genéticas y epigenéticas, lo que lleva a la desregulación de la expresión de oncogenes y genes supresores de tumores (ETG) [4]. Reprimo (RPRM) es una novela putativo TSG [5,6] y se asocia con la carcinogénesis gástrica [7]. Además hemos propuesto que el ADN libre de células RPRM metilado puede ser un biomarcador potencial para la detección no invasiva de GC [8,9].
RPRM es una proteína altamente glicosilada localizada predominantemente en el citoplasma y ha sido identificado como un efector aguas abajo de la detención del ciclo celular inducida por p53 en G2 /M [10]. Los informes sugieren que la expresión RPRM está regulada por dos mecanismos, uno a través de la metilación del ADN en su región promotora [8] y el otro por vía de p53 [10]. Sin embargo, estudios más recientes no han podido confirmar estos resultados [6]. Por otra parte, la importancia clínica de RPRM ha sido poco estudiada [11]. En el presente estudio se evaluó el papel de la metilación del ADN en la regulación de la expresión RPRM, su significado clínico y su asociación con los miembros de la familia de proteínas p53 supresor de tumores (p53 y p73 es decir). Encontramos densa metilación de la región promotora RPRM, que se asoció con la pérdida de expresión en líneas celulares de GC. En los casos clínicos, la pérdida de expresión se asoció con la etapa de invasión de GC. Asimismo, se observó una asociación positiva entre la expresión de p73 y RPRM, lo que sugiere que otros miembros de la familia de genes p53 podrían ser nuevos candidatos para la regulación de la expresión RPRM.
Métodos
Líneas celulares y muestras de tejido
Cuatro líneas de células GC (AGS, SNU-1, KATOIII y NCI-N87) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC) en diciembre de 2012 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Hyclone) y se suplementó con 10% de suero bovino fetal (FBS) y se mantuvo a 37 ° C, 5% de CO
2. Se seleccionaron veinte mucosa adyacente muestras (NTAM) tumorales y no tumorales emparejados para la evaluación de la expresión RPRM. Se seleccionaron seis para la evaluación de la metilación RPRM. Una cohorte de 114 pacientes con cáncer gástrico fue seleccionado para correlaciones clinicopatológicas de producto de proteína del gen RPRM. Las muestras de tejido de los casos individuales se clasificaron de acuerdo a la Sociedad Japonesa de Investigación para las recomendaciones cáncer gástrico [12]. Todos los casos fueron reclutados por el Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas-Hospital Clínico San Borja Arriarán (ICHJED-HCSBA), Santiago de Chile entre 1993-2000 [13] y las características clinicopatológicas se muestran en la Tabla 1. Este estudio fue aprobado por el Institutional Juntas de revisión de la Pontificia Universidad Católica de Chile (Comité de Ética Científico) y ICHJED-HCSBA (Comité de Ética Científico, Servicio de Salud Metropolitano central Santiago, Chile). escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada participante implicado en el estudio.
microarrays de tejidos e inmunohistoquímica
microarrays de tejidos (TMA) se realiza mediante el uso de un instrumento manual de tejido de matriz II (Instrumentos Beecher ) como se describe anteriormente [14,15]. secciones de núcleo (4 micras) se sometieron a inmunotinción por Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), p53 (clon 318-6-11, Dako Dinamarca) y la proteína p73 α (clon 24, Novacastra). Los resultados de la inmunotinción en el tumor entero y NTAM así como TMA secciones se consideraron positivos para RPRM si & gt; 30% de las células epiteliales mostró tinción citoplasmática, & gt; 10% de tinción nuclear de p53, o & gt; 10% nuclear /tinción citoplásmica para p73 . Evaluación de la tinción inmunohistoquímica se realizó de forma independiente por dos patólogos (JV & Amp; GC). Que fueron cegados a los datos clínicos
secuenciación de bisulfito y Análisis de Expresión cuantitativa de RT-PCR
ADN de líneas celulares GC fue se extrajo usando el reactivo TRIzol (Life Technologies) según el protocolo del fabricante, seguido por la conversión de bisulfito usando la metilación del ADN kit EZ oro (Zymo Research). promotor RPRM se amplificó a partir de ADN tratado con bisulfito, usando los cebadores 5'-RPRM_B_FW TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 'y 5'-RPRM_B_RV CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3', que permite la detección de 52 sitios CpG dentro de una región de promotor 509 pb. Los productos de PCR se purificaron con el kit de extracción de gel QIAXEN II (QIAGEN) y se ligaron en pGEM-T vector. El producto de ligación se utilizó para transformar competente
E
.
coli
células Top10, de acuerdo con el procedimiento descrito por Inoue et al. [dieciséis]. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB suplementadas con ampicilina (100 mg /ml), X-Gal (50 mg /ml) y IPTG (100 mM). Las colonias de color blanco resultantes se evaluaron mediante PCR de colonias. Los clones positivos se cultivaron en medio líquido (LB /ampicilina) hasta que la fase tardía exponencial (OD600 = 1) y los plásmidos de ADN se purificaron utilizando el kit de sistema de miniprep Rendimiento Pure (Promega). La región promotora se secuenció usando RPRM M13 universal (W 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 'y 5'-RV CAGGAAACAGCTATGAC-3') por Macrogen (http://dna.macrogen.com). software analizador BIQ se utilizó para el análisis de clones secuenciados. Todos los clones pGEM-T positivas se cultivaron en medio LB /ampicilina y se almacenaron a -80 ° C (en 14% de glicerol). El ARN total se extrajo usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y se sintetizó ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BioRad). Posteriormente, el ADNc se utilizó para cada reacción de PCR con cada par de cebadores. Los cebadores RPRM específicos son: 5'-RPRM_FW GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 'y 5'-RPRM_RV CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3'. Análisis en tiempo real RT-PCR se realizó utilizando LightCycler Fast Start ADN MasterPlus SYBR Green I (Roche) en un sistema LightCycler 1.5 Detección en Tiempo Real (Roche). análisis cuantitativo relativa normalizada a RPL-30 se llevó a cabo a través del método ciclo umbral comparativa [17]. Los RPL-30 primers específicos son los siguientes:. RPL-5'-30_Fw ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 'y 5'-RPL30_RV AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3'
Validación de anticuerpo RPRM por inmunotransferencia e inmunofluorescencia
3x10
5 células AGS se transfectaron transitoriamente con pCMV6 /RPRM o pCMV6 (Origene) vector vacío, usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se incubaron las células durante 24 h en RPMI 1640 con 10% de FBS en presencia o ausencia de inhibidor de N-glicosilación Tunicamicyn (10 ng /ml). Se recogieron las células y lisados de células enteras se extrajeron usando tampón Triton (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 0,1 M, 0,5% de Triton X-100) con inhibidor de la proteasa Cocktail Kit (P8340, Sigma Aldrich) y el Kit de Fosfatasa Cocktail Inhibidor ( sc-45045, Santa Cruz Biotechnology). Las concentraciones de proteína se determinaron mediante Inicio rápido reactivo Bradford (Bio-Rad). Cincuenta g de proteína se separaron en SDS-PAGE 4% a 12%. Las proteínas en los geles se sometieron a electrotransferencia a membranas de difluoruro de polivinilideno usando el mini sistema transblotter (Bio-Rad, Hercules, CA). Las membranas de difluoruro de polivinilideno se bloquearon en 5% de leche en solución salina tamponada con Tris /Tween 20 (TBST) durante 1 h. El anticuerpo primario anti-RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) se diluyó 1: 1000 en TBST /BSA al 3% /y las membranas se incubaron en anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche. Las membranas se lavaron tres veces en TBST durante 10 min cada uno. Anti-conejo conjugado con peroxidasa de anticuerpo secundario (Santa Cruz) se diluyó 1: 2000 en TBST y se incubaron en las membranas durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron como anteriormente y se visualizaron utilizando SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Pierce) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para evaluar la localización celular de RPRM, se realizó el ensayo de inmunofluorescencia. células AGS transfectadas transitoriamente con pCMV6-RPRM o pCMV6 se hicieron crecer en cubreobjetos. Las células AGS transfectadas transitoriamente se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 20 min a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se permeabilizaron en 0,1% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich) durante 10 min, bloqueado en 3% de BSA durante 1 h a temperatura ambiente, y posteriormente se marcaron con un anticuerpo anti-RPRM (1: 1000, 38-50, Sigma-Aldrich). Después de lavar con PBS, las células se incubaron con un anticuerpo Alexa Fluor 488 conjugado (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene) durante 1 h a temperatura ambiente. Las imágenes fueron adquiridas mediante láser confocal de fluorescencia microscopía de barrido (ver información de apoyo S1 y S2 figuras).
Cultivo de células y transfección
Para los experimentos de transfección estables, las células AGS se cultivaron a 3x10
5 células /100 mm de plato de cultivo y transfectadas después de 24 h con pCMV6-RPRM o pCMV6 (Origene) vector vacío usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se cultivaron en las mismas condiciones con G418 (500 g /ml). Los medios de cultivo se cambió cada 24 horas durante 14 días.
Colonia ensayo de formación de
Para el ensayo de formación de colonias, 200 células fueron transfectadas establemente con pCMV6-RPRM o pCMV6 vector vacío. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Hyclone) y suplementado con 10% FBS. Los medios de cultivo se cambió cada 24 h. Las colonias fueron teñidas utilizando 0,4% de cristal violeta (Sigma) en 50% de metanol, 21 días después de la siembra inicial, y se contaron en 20 imágenes tomadas con un microscopio invertido (Sistema de imágenes de células Evos XL Core, Life Technologies). Cada transfección se llevó a cabo por triplicado. Además, replicar los experimentos se llevaron a cabo para obtener más clones para el análisis de expresión.
independiente del anclaje ensayo de crecimiento
crecimiento celular independiente del anclaje se analizó en placas de 1% de agarosa que contiene 2x10
5 las células estables transfectadas con pCMV6-RPRM o pCMV6 vector vacío en placas de 6 pocillos. Las células se alimentaron semanalmente por recubre solución de agar blando fresco, y las colonias fueron fotografiados después de 4 semanas de incubación. El experimento se llevó a cabo por triplicado.
Análisis estadístico
coeficiente de correlación de Spearman se calculó para analizar la correlación entre la metilación RPRM y los niveles de expresión génica. Las variables categóricas se analizaron por Pearson prueba de chi-cuadrado (dos caras), el p-valor se corrigió mediante un análisis de regresión logística. Las variables continuas se analizaron mediante
t
prueba y los datos del estudiante se expresó como media ± desviación estándar. Se utilizó la prueba de Kappa para analizar la correlación entre la expresión y la expresión de p73 RPRM. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) y el paquete estadístico GraphPad Prism5 (La Jolla, CA, Estados Unidos). Todos los valores fueron de dos colas, a excepción de correlación de Spearman. La significancia estadística se definió como p & lt; 0.05.
Resultados
metilación RPRM y expresión en líneas celulares de cáncer gástrico
Antes, nosotros y otros han informado de que la expresión RPRM puede ser restaurada por el agente de desmetilación 5-aza -2-desoxicitidina (Ver información de apoyo figuras S3 y S4) [5,8,18]. Sin embargo metilación RPRM ha sido débilmente correlacionado con su expresión [18]. A fin de evaluar la asociación entre el promotor RPRM metilación y la expresión génica, la región promotora completa del gen RPRM se analizó por secuenciación de bisulfito de ADN en cuatro líneas celulares GC (AGS, SNU-1, KATO III y NCI-N87) (Fig 1A). Por lo tanto, el estado de metilación de 52 sitios CpG, que se encuentra entre -207 y +302 nucleótidos relativos al sitio de inicio de transcripción (TSS), fueron analizados. Este análisis muestra densa metilación en líneas de células AGS y SNU-1 (89,6% y 86%, respectivamente), en comparación con KATO III y NCI-N87 (79,7% y 51,8%, respectivamente) (p = 0,0002) (Fig 1B) . A continuación, el nivel de expresión RPRM se determinó por RT-PCR cuantitativa. baja expresión de genes RPRM se observó en AGS y SNU-1 en comparación con líneas de células NCI-N87 (P & lt; 0,0001) KATO III y (Fig 1C). Por análisis de correlación de Spearman reveló se encontró correlación negativa significativa entre la densidad de metilación y la expresión génica RPRM (r = -1; p = 0,042) (Fig 1D). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la metilación de la región promotora RPRM juega un papel crítico en la regulación de la expresión RPRM.
A) RPRM región promotora analizado por cuantificación de bisulfito. B) secuenciación del ADN de bisulfito en líneas celulares de cáncer gástrico. C) Expresión relativa de RPRM en cuatro líneas celulares de cáncer gástrico ns: no significativo; * P & lt; 0,01; prueba de ANOVA de una vía. D) de Spearman de correlación de rangos entre la expresión RPRM y el estado de metilación del promotor de RPRM. E) metilación en RPRM tumoral y no tumoral mucosa adyacente (NTAM) los tejidos, el aumento de los niveles de metilación en los tejidos tumorales se observó en comparación con NTAM en los seis casos de CG pareadas.
metilación y de expresión en RPRM tejidos de cáncer gástrico
Para corroborar los datos anteriores en los tejidos de GC, los niveles de metilación RPRM se determinaron en muestras de tumores y 6 NTAM pareadas. Los resultados indican que los niveles de metilación altas en los tejidos tumorales en comparación con tejidos NTAM (Ver Figura 1E). Para investigar la expresión del producto proteico del gen en los tejidos RPRM GC se realizó un análisis IHC. expresión RPRM positiva se observó principalmente en el citoplasma de las células epiteliales gástricas. Se detectó RPRM expresión de la proteína del gen en el 75% (15/20) de las muestras de tejidos NTAM. Sin embargo, sólo 25% (5/20) de las muestras tumorales mostró expresión de RPRM producto proteína del gen (Fig 2). Estas diferencias fueron muy significativas (p = 0,001) y sugieren que la expresión de RPRM se pierde en los tejidos GC. Para evaluar la significación clínica de esta pérdida de expresión RPRM se evaluó una cohorte de 114 casos de CG. La pérdida de expresión RPRM se encontró en 62% (71/114) de los casos de GC. correlaciones clinicopatológicas de expresión RPRM se muestran en la Tabla 1. El paso de la etapa I GC a las etapas II-IV (p = 0,006) y la metástasis de los ganglios linfáticos (p = 0,037) se asociaron significativamente con la pérdida de la expresión del producto proteico del gen RPRM. Sin embargo, el análisis de regresión logística muestra que sólo la progresión de la fase I a II-IV se asocia significativamente con la pérdida del producto proteico del gen RPRM (p = 0,020).
A) Ejemplo representativo de la mucosa adyacente no tumoral (NTAM ) que muestra tinción citoplásmica positiva de RPRM en más de 30% de las células. B) Ejemplo representativo del tumor (T) muestra el cáncer gástrico que muestra tinción negativa de RPRM.
ensayo funcional de RPRM en el cáncer gástrico (la formación de colonias y el crecimiento independiente de anclaje)
la pérdida de expresión RPRM se asoció en GC y sobre todo con la progresión de la fase I a II-IV, un papel supresor de tumor de RPRM podría ser plausible. Por lo tanto, los ensayos funcionales, tales como
vitro
formación de colonias en ensayos y crecimiento independiente de anclaje se realizaron en células AGS transfectadas con pCMV6 /RPRM (Fig 3A). La no expresión de las líneas celulares AGS transfectadas con plásmidos de expresión RPRM mostraron un número significativamente menor de colonias en comparación con pCMV6- líneas vacías transfectadas con el vector de células transfectadas con el vector pCMV6 vacío (p & lt; 0,05) (Figura 3B). El efecto de la sobreexpresión RPRM en el crecimiento independiente del anclaje en un ensayo de formación de colonias en agar blando también se evaluó en los clones de línea celular AGS transfectadas estables. Se contaron las colonias después de la siembra inicial y la incubación en agar blando durante 4 semanas. Las células transfectadas con el vector vacío mostraron un robusto crecimiento de colonias, por número y tamaño de las colonias. Esto se redujo en gran medida cuando RPRM fue re-expresado en células AGS (Figura 3C).
A) transferencia de Western de células AGS con sobreexpresión de RPRM (pCMV6 /RPRM) y el control de vacío (pCMV6). B) La sobreexpresión de RPRM en células AGS (pCMV6 /RPRM) resultó en una reducción significativa de
in vitro
formación de colonias en comparación con la línea de células AGS transfectadas con el vector vacío pCMV6 (pCMV6). Cada experimento se llevó a cabo por triplicado. Hubo una reducción estadísticamente significativa de la formación de colonias en experimentos de sobreexpresión (* p & lt; 0,05). Debajo de cada gráfico son placas representativas que muestran una reducción de las colonias después de barras gen sobreexpresión de error; DAKOTA DEL SUR. C) La sobreexpresión de RPRM en células AGS (pCMV6 /RPRM) resultó en una reducción significativa de
in vitro
la formación de colonias independiente del anclaje en comparación con la línea celular AGS transfectadas con el vector vacío pCMV6 (pCMV6). Cada experimento se llevó a cabo por triplicado. Hubo una reducción estadísticamente significativa de la formación de colonias en los experimentos de sobreexpresión (* p & lt; 0,05). Debajo de cada gráfico son placas representativas que muestran una reducción de las colonias después de barras gen sobreexpresión de error; SD
asociación de la expresión RPRM y p53 /p73 familia de proteínas supresor de tumores en el cáncer gástrico
RPRM se ha definido como un gen p53 mediada en células de fibroblastos de embriones [18]. Sin embargo, se ha informado de que la regulación de la expresión RPRM podría ser independiente del estado del gen p53 en las células neuronales tratadas con cobre [19]. Por otro lado p73 puede activar la transcripción de genes sensible a p53 [20]. Teniendo en cuenta este ajuste, se evaluó la expresión de p53 y otros miembros de la familia de proteínas p53, p73 TSG. La expresión de p53 se encuentra en los núcleos de las células de la mucosa gástrica. Se detectó la expresión de p53 positiva en el 23,5% (20/114) de los casos de GC. Sólo el tamaño del tumor estaba asociado con la expresión de p53 (p = 0,035, véase la Tabla 2). La expresión de p73 se encuentra en los núcleos celulares y citoplasma de las células epiteliales. la expresión de p73 positivos se encontró en el 30,6% (34/114) de las muestras de GC. Curiosamente, las correlaciones clinicopatológicas significativa de la expresión p73 se asociaron con la etapa invasiva (estadio I 55,6%; 10/18 a las etapas II-IV 25,8%; 24/93, p = 0,012) y la metástasis de los ganglios linfáticos (p = 0,038) (Tabla 2 ). Ya que las pérdidas de expresión de genes y proteínas RPRM P73 productos tienen correlaciones clínico-patológicas similares, se evaluó la asociación entre las expresiones de los niveles de ambas proteínas. Con este fin casos se separaron en cuatro grupos de acuerdo a la expresión de la proteína p73 RPRM y productos. El análisis mostró que 22 de 111 casos de CG fueron positivos para ambas proteínas RPRM y p73, mientras que 57 111 fueron negativas. Esta asociación fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,0001) con un valor kappa de 0,363 (Tabla 3)
Discusión
RPRM es una proteína citoplasmática altamente glicosilada, inicialmente identificado. como un efector aguas abajo de la detención del ciclo celular inducida por p53 en G2 /M. Anteriormente, se ha propuesto que RPRM es silenciado por metilación del promotor, aunque se ha débilmente correlacionado con su expresión [5,8]. Además, RPRM se ha propuesto como un gen supresor de tumor putativo en el carcinoma de células renales y tumores de la pituitaria [5,6]. En este estudio, hemos demostrado que la expresión de genes RPRM está fuertemente asociado con su estado de metilación región promotora, lo que sugiere el silenciamiento epigenético de la expresión génica RPRM. Además, se muestra que el producto proteína del gen RPRM se redujo en el tejido GC en comparación con mucosa gástrica no canceroso. Estos resultados son similares a la de Luo
et al
. [11], que informó de la pérdida de RPRM en GC en comparación con muestras de tejido úlcera gástrica. Por otra parte, nuestra conclusión por lo que la pérdida de expresión de RPRM en la transición de fase I de estadios II-IV es clínicamente relevante. Luo
et al
. [11] informó de un hallazgo similar, pero en un número reducido de la etapa I GC casos (n = 15). Estos hallazgos pueden tener importancia clínica como un factor predictivo de la progresión de la GC. En consecuencia con esta pérdida de expresión RPRM en la progresión de GC, nuestros ensayos funcionales (formación de colonias y el crecimiento de anclaje independiente) también propuesto un papel supresor de tumor putativo para RPRM en GC.
Aunque p53 se describió inicialmente como una RPRM inductor [10], los estudios clínicos realizados hasta la fecha no han podido confirmar este hallazgo [6,18]. Aquí, hemos identificado que la pérdida de expresión RPRM se correlaciona con la pérdida de la expresión de otro miembro de la familia p53, p73. Aunque TSG p73 se expresa a un nivel muy bajo en tejidos humanos normales [21], se sobreexpresa en muchos diferentes tipos de cáncer humanos como el de mama, neuroblastoma, pulmón, esófago, estómago, colon, vejiga y ovario [14,22]. Además, se ha informado de que p73 puede activar la transcripción de genes sensible a p53, incluyendo p21Waf1 /Cip1, bax, MDM2, ciclina G, GADD45 y IGFBP3 [20]. Por lo tanto, en base a nuestros resultados, proponemos que la expresión RPRM podría ser regulada por p73 de una manera independiente de p53.
En resumen, nuestros datos sugieren que el silenciamiento epigenético de genes RPRM por el promotor de la metilación se asocia con la pérdida de RPRM expresión y, en consecuencia, los ensayos funcionales propusieron un papel supresor tumoral putativo de RPRM en GC. En las muestras clínicas, RPRM se pierde en las etapas invasivas de GC y su expresión se correlaciona con la de p73 lo que sugiere que otros miembros de la familia de genes p53 podrán participar en la regulación de la expresión RPRM. Se necesita más investigación para caracterizar el papel de RPRM en la progresión de GC y validar la regulación biológica de RPRM por P73.
Apoyo a la Información
S1 de datos. . Los datos que subyace en el estudio
doi: 10.1371 /journal.pone.0125834.s001 gratis (postal)
S1 Fig. Efectos de la proteína en Tunicamicyn RPRM.
RPRM es una proteína citoplasmática altamente glicosilada visualizado a 25 kD por Western blot, la tunicamicina inhibidor de la glicosilación (TK) desplaza la banda RPRM 25 kD a 15 kD en las células AGS con sobreexpresión RPRM (pCMV6 /RPRM) (RPRM predijo tamaño 12 kD). Las células se incubaron durante 24 h en RPMI 1640 con 10% de FBS en presencia o ausencia del inhibidor de tunicamicyn N-glicosilación (10 ng /ml). expresión RPRM se determinó por transferencia de Western usando un anticuerpo policlonal RPRM (panel superior, dilución 1: 1000, Sigma-Aldrich). La expresión de β-actina (panel inferior, dilución 1: 2000, Santa Cruz) representa la carga de proteínas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s002 gratis (TIF)
S2 Fig. Localización de expresión RPRM en sobreexpresan AGS línea celular de inmunofluorescencia RPRM en la línea celular de cáncer gástrico AGS transfectadas con el vector de codificación pCMV6 RPRM.
Células después de la transfección 24 h se fijaron en paraformaldehído al 4% y se incubaron con anti-RPRM-conejo (1 : 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) y anticuerpo secundario Alexa Fluor-488 (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene). Una expresión positiva de RPRM (VERDE) se observa principalmente en el citoplasma. Las imágenes fueron capturadas en el uso de software multicanal Axio Vision4 en microscopio de fluorescencia Zeiss Axio Scope.A1-
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s003 gratis (TIF)
S3 Fig. RPRM expresión es silenciada por la metilación del promotor.
A) RT-PCR análisis de la expresión de ARNm RPRM en la línea celular de cáncer gástrico AGS con y sin el inhibidor de la metilación del ADN 5-azacitidina (1 uM durante 72 horas). GAPDH se utilizó como control. B) La amplificación de RPRM por PCR específica de metilación en la línea celular de cáncer gástrico AGS. La amplificación de MYOD1 metilado se utilizó como control. línea de células AGS fue metilado en la región promotora. NC: control negativo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s004 gratis (TIF)
S4 Fig. RPRM expresión es silenciada por la metilación del promotor (gel original).
A) RT-PCR análisis de la expresión de ARNm en RPRM línea celular de cáncer gástrico AGS con y sin el inhibidor de la metilación del ADN 5-azacitidina (1 uM durante 72 horas). GAPDH se utilizó como control. B) La amplificación de RPRM por PCR específica de metilación en la línea celular de cáncer gástrico AGS. La amplificación de MYOD1 metilado se utilizó como control. línea de células AGS fue metilado en la región promotora. Carolina del Norte:.
Control negativo doi: 10.1371 /journal.pone.0125834.s005 gratis (TIFF)
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a Sabina Magedson por su contribución en la construcción Los microarrays de tejidos. También nos gustaría dar las gracias a Hiroshi Kawachi para su revisión histológica de los casos, Ignacio Wichmann por sus valiosos comentarios sobre nuestro manuscrito y Oslando Padilla por su importante apoyo en el análisis estadístico.