Extracto
Antecedentes
La proteína tirosina fosfatasa de tipo receptor D (PTPRD ) es un supresor tumoral putativo en varios tipos de cáncer, incluyendo carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC). STAT3 es un oncogén hiperactivado con frecuencia en HNSCC. Como STAT3 es un sustrato directo de PTPRD, hemos tratado de determinar las alteraciones genéticas o epigenéticas de
PTPRD
que contribuyen a STAT3 hiperactiva en los CECC.
Métodos
Se analizaron los datos de Atlas del Genoma del cáncer (TCGA) y nuestro estudio anterior secuenciación del exoma y resumida la mutación, metilación, y copia el estado número de
PTPRD Hoteles en CECC y otros tipos de cáncer.
in vitro
estudios incluyeron transfección estándar y protocolos de MTT, así como la PCR específica de metilación.
Resultados
Nuestros hallazgos indican que
PTPRD
mutación, en lugar de la metilación o número de copias de alteración, es el mecanismo principal por el cual la función PTPRD se pierde en HNSCC. Se demuestra que la sobreexpresión de tipo salvaje en las células PTPRD HNSCC inhibe significativamente el crecimiento y la activación de STAT3, mientras que los mutantes PTPRD no, lo que sugiere que la mutación puede conducir a la pérdida de la función y la subsiguiente hiper-fosforilación de sustratos PTPRD, especialmente STAT3. Es importante destacar que, se determinó que las células que albergan un HNSCC endógena de
PTPRD
mutación son más sensibles al bloqueo de STAT3
PTPRD
células de tipo salvaje. Estamos, además, encontramos que
PTPRD
la expresión de ARNm no se correlaciona con la expresión pSTAT3, lo que sugiere que las alteraciones que se manifiestan a través de la expresión de ARNm alterado, incluyendo hipermetilación de genes y alteraciones del número de copias, no contribuyen de manera significativa a la sobreactivación de STAT3 en CECC.
Conclusión
PTPRD
mutación, pero no metilación o copia número pérdida, puede servir como un biomarcador predictivo de la sensibilidad a los inhibidores de STAT3 en HNSCC
Cita.: Peyser ND, Du Y, Li H, V Lui, Xiao X, Chan TA, et al. (2015) La pérdida de la función de
PTPRD
mutaciones conducen a un aumento de activación de STAT3 y sensibilidad a la inhibición de STAT3 en cáncer de cabeza y cuello. PLoS ONE 10 (8): e0135750. doi: 10.1371 /journal.pone.0135750
Editor: Qian Tao, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 26 Marzo, 2015; Aceptado: July 25, 2015; Publicado: 12 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Peyser y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Genómica y proteómica están disponibles de The Atlas del Genoma del cáncer (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm) y el cáncer del Proteoma Atlas (http://app1.bioinformatics.mdanderson.org/tcpa/_design datos /basic/index.html)
financiación:. Este trabajo fue apoyado por los Institutos nacionales de Salud (www.nih.gov) P50CA097190 financiación y R01CA77308 a JRG, y F31DE024007 al PND, la Sociedad Americana del cáncer (www .cancer.org) para JRG, el Consejo de Becas de china (http://en.csc.edu.cn) para YD, y el Fondo general de Investigación del Consejo de Ayuda de Investigación de Hong Kong (http: //www.ugc. edu.hk/) 17114814 y capital semilla para la Investigación básica de VL
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
proteína tirosina fosfatasa receptor de tipo D (PTPRD) es un miembro de la familia de tipo receptor de la proteína tirosina fosfatasa (PTPR). Ptprs son enzimas de membrana integral, que catalizan la eliminación de grupos fosfato de proteínas específicas, afectando de ese modo la señalización celular. La desregulación de la señalización PTPR por mecanismos genéticos y /o epigenéticos puede, por tanto, en última instancia conducir a fenotipos cancerosos. [1] Varios miembros de la familia, incluyendo PTPR PTPRD, han informado a funcionar como supresores de tumores donde la pérdida de alteraciones de la función puede impulsar el crecimiento del tumor. [2,3] eventos genéticos que incluyen la mutación, deleción del gen, o el silenciamiento epigenético puede conducir a la disminución de la actividad fosfatasa de Ptprs y la señalización oncogénica mejorada. [1] |
Nos informó recientemente el perfil mutación acumulada de la
PTPR
familia de genes en el cáncer con un enfoque en
PTPRT
mutación conduce a la activación de STAT3 en la cabeza y el cuello escamoso carcinoma de células (HNSCC). [4] El análisis reveló que 15 tipos de tumores sólidos albergaban mutaciones de al menos un
PTPR
gen.
PTPRD
es uno de los más comúnmente mutado
PTPR Buscar miembros de la familia en HNSCC, y PTPRD se ha informado a funcionar como un supresor tumoral en este tipo de cáncer. [5]
PTPRD
también es mutado, borrar o hiper-metilado en el glioblastoma (GBM), mientras que el gen no está metilado y se expresa en el tejido cerebral normal. [6] Además,
se encontraron PTPRD
mutaciones que se asocia con una mayor expresión de STAT3 fosforilado, un sustrato PTPRD directa, en GBM. Además de GBM, 13% y 25% de los tumores HNSCC analizados en el estudio anterior albergado
PTPRD
mutación o la metilación del promotor, respectivamente. homocigotos supresión de
PTPRD
, además, se ha informado en el cáncer de laringe, lo que sugiere que las aberraciones genéticas que afectan la función PTPRD pueden ser un evento común en muchos tipos de cáncer. [5]
Estos resultados acumulativos nos llevó a formular la hipótesis de que la alteración genética y /o epigenética de
PTPRD
puede contribuir a mejorar la señalización y el crecimiento en los CECC donde los componentes clave de la vía pueden servir como plausibles dianas terapéuticas. A continuación, se resume el perfil genético y epigenético de
PTPRD Hoteles en HNSCC de Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) y nuestro estudio mutacional paisaje CECC anterior. [7] A continuación, probamos las consecuencias de
PTPRD
alteraciones encontradas en los tumores humanos HNSCC en modelos preclínicos relevantes para evaluar la actividad STAT3 y la sensibilidad a la inhibición de STAT3.
Materiales y Métodos
cultivo celular, tratamiento farmacológico, y transfección
Todas las líneas celulares fueron verificadas HNSCC genotípicamente como se describió anteriormente. [4] células Cal27 se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA). células PE /CA-PJ34clone12 y PE /CA-PJ49 se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). 686LN células se obtuvieron de Georgia Chen en el MD Anderson Cancer Center de (Houston, TX). células Cal27 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Mediatech, Inc., Manassas, VA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA). 686LN células se cultivaron en DMEM /F12 (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con 10% FBS. PE /CA-PJ34clone12 y PE /CA-PJ49 se cultivaron en Modificación de Iscove de DMEM (Mediatech Inc., Manassas, VA) suplementado con 10% FBS y 2 mM L-glutamina (Life Technologies, Grand Island, NY). Todas las células se mantuvieron en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO
2. JSI-124 (Calbiochem, Billerica, MA) se disolvió en DMSO. La transfección se realizó con Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY) o FuGENE HD (Promega Corporation, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante con DNA 4 g diluidos en Opti-MEM (Life Technologies, Grand Island, NY).
mutagénesis dirigida
PTPRD
mutaciones (K1502M, S384R, T1100M y L1147F) se generaron a partir del plásmido de tipo salvaje usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Phusion ( Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) siguiendo el protocolo del fabricante y se confirmó mediante secuenciación de Sanger. amplificaciones de plásmidos se realizaron utilizando el QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) o el Kit de huracán Maxi Prep (GerardBIOTECH, Oxford, OH) según las instrucciones del fabricante.
inmunotransferencia
Primaria anticuerpos para pSTAT3 (Y705) y STAT3 se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). anticuerpo primario beta-tubulina fue adquirido de Abcam (Cambridge, MA). Los anticuerpos secundarios fueron adquiridos de BioRad (Hercules, CA). Las transferencias se cuantificaron por densitometría usando software ImageJ.
ensayo MTT
ensayos de MTT se realizaron por las células en incubación en 5 mg /ml de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2 , 5 difenil tetrazolio bromuro en PBS a durante 30 min a 37 ° C y 5% de CO
2. Después de la incubación, la solución se aspiró y se reemplazó con DMSO. Absorbancia de esta solución se midió a 570 nm en un espectrofotómetro.
PCR específica de metilación
El tumor y el tejido normal se obtuvieron bajo los auspicios de un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pittsburgh. ADN fue aislado de parafina de tejido fijado con formalina usando el kit QIAamp DNA de tejidos FFPE, y la línea celular de ADN se aísla utilizando el QIAamp DNA Mini Kit. la conversión de bisulfito se realizó utilizando el Kit de EpiTect bisulfito y reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación (MSP) se llevó a cabo usando el kit EpiTect MSP. Todos los kits se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Hilden, Alemania). MSP cebadores fueron diseñados utilizando el software MethPrimer. [8] Para la metilación, las secuencias de cebadores directo e inverso fueron GTTTTATTTTGGATTTTTGGAATC y TACCTAACGCGACCTAAACG, respectivamente. Para no metilación, las secuencias de cebadores directo e inverso fueron TATTTTGGATTTTTGGAATTGT y AACTACCTAACACAACCTAAACAAA, respectivamente. Los cebadores fueron específicos para el estado de metilación destinado como se determina usando el DNA Control Conjunto EpiTect (Qiagen, Hilden, Alemania).
Descarga de datos y el análisis
La mutación, alteración del número de copias, y RNA-Seq se sumaron los datos desde el Portal CBio [9,10] y los informes publicados. [6,7,9] Los datos de metilación del ADN se obtuvieron a través de la matriz de datos TCGA (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm). secuencias de ADN y de proteína y las anotaciones de dominio se obtuvieron del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). datos de la matriz de proteínas de fase inversa se obtuvieron del cáncer proteoma Atlas (http://app1.bioinformatics.mdanderson.org/tcpa/_design/basic/index.html). Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA).
de exclusión de azul de tripano
p>
Resultados
mutaciones PTPRD ocurren con frecuencia en HNSCC y otros cánceres
la mutación somática es un evento común que conduce a gen alterado y la función de las proteínas en el cáncer. Dieciocho no es sinónimo de
PTPRD
mutaciones se han identificado hasta la fecha en los tumores HNSCC. [6,7,9,10] Estas mutaciones aparecen dispersos a lo largo de la secuencia del gen y la proteína. (Figura 1A) Todos ellos son de carácter no recurrente, con cada uno se presenta en un solo tumor CECC, lo que sugiere que dichos productos puedan ser mutaciones de pérdida de función. De estos 18 mutaciones, 12 se producen en el dominio extracelular, 1 se localiza en el dominio catalítico, y 5 están en la región transmembrana, donde se ha identificado ningún dominio conservado. Además de CECC,
PTPRD
mutaciones se observaron también ampliamente en otros tipos de cáncer. (Figura 1B) de la colección del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA),
PTPRD
se usa más frecuentemente mutado en el melanoma cutáneo (59/344 casos, 17,2%), seguido de adenocarcinoma de pulmón (33/230 casos, el 14,3% ), y el adenocarcinoma de estómago (30/289 casos, 10,4%). [9,10] Al igual que en los CECC,
PTPRD
mutaciones en estos cánceres no parecen agruparse en regiones críticas o residuos, lo que sugiere que la pérdida de la función PTPRD por mutación somática es un evento común en varios tipos de cáncer.
(a) La localización de las mutaciones de proteínas PTPRD reportados en los tumores HNSCC. tumores del TCGA [9,10];: Rojo Verde: a partir de [6]; Azul: a partir de [7]. IG, inmunoglobulina; IG2, Segunda inmunoglobulina (Ig) -como dominio de la proteína tirosina fosfatasa receptor (RPTP) -F; FN3, fibronectina tipo 3 de dominio; PTVC, proteína tirosina fosfatasa, dominio catalítico. (B) La frecuencia de
PTPRD
mutaciones en los cánceres humanos según lo determinado por TCGA, con CECC se muestra en rojo.
La única mutación detectada en HNSCC que ha sido identificado previamente en otro cáncer es T1100M, que fue reportado en la leucemia linfocítica crónica. [11] Curiosamente, varios otros sitios de mutación se encuentran en HNSCC tienen una sustitución de aminoácido diferente reportado en otros tipos de cáncer. Por ejemplo, mientras K204E se observa en HNSCC, K204Q se ha informado en el cáncer de esófago. [12] Además, una revisión de la base de datos cósmicos (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/) demuestra la detección de cáncer de hígado en L503V (en comparación con L503I en CECC) y L1036M en el colon adenocarcinoma (en comparación con L1036P en HNSCC). Ding
et al
, además, informó de una mutación en este sitio (L1036Q) en el adenocarcinoma de pulmón. [13] Curiosamente, mientras K1502M es la única mutación dominio catalítico identificado hasta la fecha en el CECC, TCGA ha identificado una mutación sin sentido K1502 * en el adenocarcinoma de pulmón. En conjunto, estos resultados sugieren que mientras que el específico
PTPRD
mutaciones encontradas hasta la fecha en HNSCC son únicos, los sitios de aminoácidos en las que se producen pueden representan residuos importantes que son susceptibles a las alteraciones genéticas. De hecho, el análisis de alineación de secuencias múltiples indica que estos residuos están altamente conservados entre especies, lo que sugiere que pueden tener un papel crítico en la función PTPRD adecuada (análisis no se muestra).
mutantes PTPRD HNSCC derivados conducen a un aumento del crecimiento celular
PTPRD ha informado para servir como un supresor de tumores en el cáncer humano. [3,5,6] Para determinar las consecuencias funcionales de
PTPRD
mutación en HNSCC, se generaron varias HNSCC derivados mutantes PTPRD representativos por mutagénesis dirigida al sitio, incluyendo una mutación en el dominio extracelular (S384R), uno en el dominio catalítico (K1502M), y dos en la región transmembrana (T1100M y L1147F). sobreexpresión transitoria de estas construcciones en una línea celular HNSCC sin endógena de
PTPR
mutaciones familiares (PE /CA-PJ34clone12) reveló que todos los mutantes PTPRD ensayadas ha llevado a un mayor crecimiento según lo determinado por el ensayo de MTT en relación con PTPRD salvaje células de tipo-transfectadas. (Figura 2A) los resultados del ensayo MTT se ve confirmado con los mutantes representativos mediante el ensayo de exclusión con azul de tripano en células PE /CA-PJ34clone12 (Figura 2B). En conjunto, estos resultados sugieren que
PTPRD
mutaciones inactivan la función de supresión tumoral de PTPRD independientemente de su localización a lo largo del gen, dando lugar a un aumento del crecimiento /proliferación en células HNSCC.
El crecimiento celular (A) se evaluó mediante el ensayo de MTT 48 horas después de la transfección y se normalizaron a los controles transfectados con vector. ANOVA de una vía P = 0,0007. Los valores de p descritos representan los resultados de pares de dos colas pruebas t no pareada. El experimento se realizó tres veces con resultados similares. proliferación (B) celular se evaluó mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano 72 horas después de la transfección. ANOVA de una vía P & lt; 0,0001. Los valores de p descritos representan los resultados de pares de dos colas pruebas t no apareados.
PTPRD mutación se asocia con una mayor expresión pSTAT3
STAT3 se hiper-activa por fosforilación constitutiva de la tirosina 705 ( Y705) en muchos tipos de cáncer, incluyendo CECC. [14,15] Es importante destacar que, pSTAT3 (Y705) es un sustrato directo conocida de PTPRD. [6] Para determinar el efecto de
PTPRD
mutación sobre la fosforilación de STAT3 en HNSCC, lo primero que examinó 200 tumores HNSCC con todo, tanto la secuenciación del exoma y RPPA análisis realizados por TCGA y el cáncer del Proteoma Atlas (TCPA). HNSCC tumores con no sinónimo
PTPRD
mutaciones expresan niveles significativamente más altos de pSTAT3 relativa (Y705) a tumores de tipo salvaje
PTPRD gratis (Figura 3A). En particular,
PTPRD
es la única
PTPR
miembro de la familia para la que se observó esta correlación. Para probar la asociación entre el
PTPRD
mutación y expresión pSTAT3 directamente, transfectadas una línea celular con CECC conocida endógena de
PTPRD (mutación Cal27 albergar S387L)
mutación de tipo salvaje
PTPRD
o el control de vectores y se encontró que la sobreexpresión de tipo salvaje PTPRD conduce a la disminución significativamente la expresión pSTAT3 (P ≤ 0,05). (Figura 3B y 3C) Por otra parte, la sobreexpresión de PTPRD mutante en células HNSCC sin endógena de
PTPR
mutaciones familiares (PE /CA-PJ34clone12) conduce a un aumento pSTAT3 (Y705) expresión en relación con las células de tipo salvaje que sobreexpresan PTPRD durante casi probaron todas las mutaciones. (Fig 3D y 3E) En conjunto, estos resultados demuestran que
PTPRD
mutación conduce a un aumento de señalización STAT3 en células HNSCC y tumores.
(A) tumores HNSCC albergar
PTPRD
mutaciones expresan aumentaron pSTAT3 relativa (Y705) a
PTPRD
tumores de tipo salvaje como se determina mediante secuenciación del exoma y la matriz de proteínas de fase inversa (RPPA). prueba t no pareada de dos colas. (B) La sobreexpresión de tipo salvaje PTPRD en un
PTPRD
línea celular -mutant (Cal27) conduce a una disminución de pSTAT3 (Y705) expresión (C) Cuantificación de tres experimentos repetidos como se muestra en B. no pareada de dos colas prueba de la t. (D)
PTPRD
células de tipo -wild CECC (PE /CA-PJ34clone12) que sobreexpresan de forma transitoria exhibición PTPRD mutante aumenta pSTAT3 (Y705) expresión en relación con las células de tipo salvaje que expresan. (E) La cuantificación de tres experimentos repetidos como se muestra en D. prueba t no pareada de dos colas.
HNSCC células con la mutación PTPRD endógena son más sensibles a la inhibición de la vía STAT3
Desde
PTPRD
mutaciones aumentan la activación de STAT3 en HNSCC, el próximo tratado de determinar si
PTPRD
mutación conduce a una mayor sensibilidad a la inhibición de la vía STAT3. Para probar nuestra hipótesis, se emplearon células que albergan un HNSCC endógena de
PTPRD
mutación (PE /CA-PJ49). El tratamiento con el inhibidor de JAK /STAT JSI-124 revela que estos
PTPRD
células mutantes presentan una mayor sensibilidad con respecto a
PTPR
células familia de tipo salvaje (PE /CA-PJ34clone12), lo que sugiere que
PTPRD
mutación puede servir como un biomarcador predictivo de la respuesta a inhibidores de la vía STAT3 (Fig 4).
Las células se trataron con concentraciones crecientes de JSI-124 durante 24 horas seguido por el ensayo de MTT. El experimento se realizó tres veces con resultados similares.
PTPRD expresión de ARNm no se correlaciona con la expresión pSTAT3
hipermetilación del promotor y la pérdida del número de copias de genes representan dos mecanismos adicionales que pueden conducir a la pérdida de la función de
PTPRD
a través de la regulación por disminución de la expresión de ARNm. Es importante destacar que,
PTPRD
la expresión de ARNm no se correlaciona con la expresión en muestras de pSTAT3 TCGA HNSCC, lo que sugiere que la metilación y copia número pérdida no contribuyen de manera significativa a STAT3 sobreactivación en HNSCC (S1A Fig). De hecho, un análisis más detallado revela que mientras
PTPRD
metilación se correlaciona con la expresión de ARNm como sería de esperar para cualquier gen (Fig S1B), se observa ninguna correlación entre la metilación y la expresión pSTAT3 (S1C Fig), ni tampoco observamos ningún caso de hipermetilación aberrante promotor (que se define aquí como un nivel de metilación superior a tres desviaciones estándar por encima de la media de metilación del mismo locus genético en muestras de órganos normales emparejados). Con el fin de validar estos hallazgos, se realizó PCR específica de metilación en una cohorte independiente de los tumores HNSCC y encontramos evidencia de (30/40) (análisis representativo
PTPRD
promotor de la metilación en el 75% de los tumores analizados en la figura S2 ). Es importante destacar que, también observamos
PTPRD
la metilación del promotor de cada cinco muestras pareadas de mucosa oral normal de estos pacientes CECC (S3 FIG), lo que sugiere además que el
PTPRD
metilación observados en los CECC no es específico de tumor .
PTPRD
alteraciones en el número de copia se produce en un grado sustancial de la CECC y otros tipos de cáncer (figura 5A), donde la pérdida de copias del gen, en particular la pérdida heterocigóticos, ocurre con más frecuencia que el aumento en el CECC y todos cánceres analizados con la excepción de colorrectal y los cánceres cervicales. Es importante destacar que no se observa una correlación significativa entre las alteraciones del número de copias y la expresión de ARNm en CECC (figura 5B). En conjunto, estos resultados sugieren que la hipermetilación del promotor y la pérdida del número de copias de genes no contribuyen de manera significativa a la sobreactivación de STAT3 en CECC.
(A) Copia número alteración de
PTPRD
en los cánceres humanos según lo determinado por TCGA . (B)
PTPRD C Número
opiar alteraciones no se correlacionan con la expresión alterada PTPRD
mRNA en CECC. Una prueba de Jonckheere-Terpstra se realizó utilizando el software StatXact (Cytel, Cambridge, MA).
Discusión
STAT3 es un oncogén que está hiper-activa en muchos tipos de cáncer, incluyendo CECC, donde hiper-activación de STAT3 se asocia con una menor supervivencia y resistencia emergente a la terapia EGFR. [9,16,17] Los mecanismos potenciales que pueden resultar en un aumento de la activación de STAT3 en el cáncer incluyen el aumento de la señalización a través del receptor o no receptores tirosina quinasas aguas arriba como EGFR y JAK y /o inactivación de reguladores negativos de STAT3, incluyendo proteína tirosina fosfatasas . [18,19] Recientemente hemos informado de que el receptor de tipo tirosina fosfatasa de proteína (PTPR) la familia es frecuentemente mutado en el CECC y otros tipos de cáncer y se demostró que las mutaciones HNSCC derivados de PTPRT inducen la fosforilación de STAT3 y la supervivencia celular en coche CECC. [4] Como PTPRD representa una fosfatasa de tipo receptor adicional que se dirige directamente a STAT3, hemos tratado de determinar si la pérdida genética o epigenética de la función PTPRD puede contribuir a la sobreactivación de STAT3 en CECC.
En el presente estudio, primero identificado 18
PTPRD
mutaciones previamente no en los tumores HNSCC. Estas mutaciones son todos no recurrente y se encuentran a lo largo de gen, un patrón que es consistente con la observada en general para genes supresores de tumores. Hemos demostrado que la sobreexpresión de tipo salvaje PTPRD conduce a la supresión del crecimiento en células HNSCC, mientras que la sobreexpresión de los mutantes representativos no lo hace, estableciendo de este modo una consecuencia funcional de
PTPRD
mutación en modelos HNSCC. Estos resultados son consistentes con los de anterior
in vitro
estudios a través de varios tipos de cáncer, incluyendo glioblastoma, melanoma, cáncer colorrectal, y neuroblastoma, donde de tipo salvaje PTPRD se ha observado para suprimir la formación de colonias y el crecimiento celular, así como potenciar la apoptosis, mientras que los mutantes PTPRD derivados del cáncer no lo hacen. [3,6,20] Estos resultados acumulados sugieren que
PTPRD
mutaciones en el cáncer de llevar a la pérdida de su función supresora de tumores.
Con el fin de determinar si
PTPRD
mutación afecta a la actividad de STAT3, un sustrato PTPRD, se analizaron los datos del TCGA y TCPA y encontraron que los tumores con HNSCC
PTPRD
mutaciones expresar significativamente elevados pSTAT3 (Y705) con respecto al
PTPRD
de tipo -wild tumores. Hemos informado anteriormente de una asociación similar entre pSTAT3 expresión y mutación de un grupo de putativa
genes supresores tumorales PTPR
, incluyendo
PTPRD gratis (Y705). [4] Cuando se considera cada gen individual en lugar de como un grupo,
PTPRD
es la única
PTPR
miembro de la familia para la que la mutación se asocia significativamente con la expresión pSTAT3 (Y705) (Fig S4) . Este resultado sugiere que, si bien el número de tumores que albergan una mutación en un solo
PTPR
miembro de la familia puede ser insuficiente para detectar una diferencia significativa en la expresión pSTAT3 (Y705),
PTPRD
mutación en particular es asociado únicamente con un aumento en la expresión de pSTAT3 (Y705) que es suficientemente grande para detectar la significancia estadística. Futhermore, la sobreexpresión de tipo salvaje PTPRD en líneas celulares HNSCC albergar endógena de
PTPRD
mutaciones conduce a la regulación a la baja de pSTAT3 (Y705), lo que confirma que PTPRD regula la activación de STAT3 en modelos HNSCC. Si bien de tipo salvaje PTPRD conduce a regulación a la baja de pSTAT3 (Y705) en células HNSCC, la sobreexpresión de la mayoría de los mutantes HNSCC derivados no altera pSTAT3 (Y705) expresión en relación con el control de vectores, lo que sugiere que estas mutaciones conducen a pérdida de la función, pero no en de una manera negativa dominante. En el caso de la mutación L1147F probado en el presente documento, la sobreexpresión en células HNSCC conduce a un aumento del crecimiento, pero no el aumento de expresión pSTAT3 (Y705) (ver figuras 2A y 3D), lo que indica que ciertas mutaciones pueden conducir a fenotipos cancerosos de una manera STAT3-independiente . Estas mutaciones pueden manifestarse a través de mecanismos alternativos que pueden incluir interacciones extracelulares o alteración de las afinidades relativas de sustratos enzimáticos alternos.
PTPRD
mutación conduce a un aumento de la activación de STAT3 en HNSCC, próximo a prueba si las células que alberga un
PTPRD
mutación pueden ser más sensibles a la inhibición de la vía STAT3. Aquí demostramos que las células HNSCC con un endógena de
PTPRD
mutación son más sensibles al inhibidor de JAK /STAT JSI-124 HNSCC que las células que albergan ninguna
PTPR
mutaciones familiares, lo que sugiere que los tumores con HNSCC
PTPRD
mutaciones pueden ser muy sensibles a los inhibidores de la STAT3 que están actualmente en desarrollo preclínico y clínico. Con el fin de diseñar una estrategia de tratamiento óptimo para los pacientes con CECC
PTPRD
mutaciones, el estudio adicional de proteínas que interaccionan con PTPRD adicionales que pueden servir como dianas terapéuticas puede estar justificada. En particular,
PTPRD
mutación puede conferir adicionalmente la sensibilidad a los inhibidores de la quinasa Aurora A actualmente en desarrollo clínico, donde aurora quinasa A la fosforilación y la estabilidad normalmente están reguladas por PTPRD. [3] |
Otro mecanismo por el cual
PTPRD
función se puede perder es a través de regulación a la baja de ARNm, incluyendo por hipermetilación del promotor o pérdida del número de copias de genes. En primer lugar, se determinó que
PTPRD
la expresión de ARNm no se correlaciona con la expresión pSTAT3 en HNSCC, lo que sugiere que estos mecanismos no son susceptibles de contribuir de manera significativa a la sobreactivación de STAT3 en CECC. Cabe señalar que este análisis puede ser complicado por los varios casos en que
se detectó poca o ninguna PTPRD
mRNA. De hecho, nuestros estudios de sobreexpresión en células HNSCC sugieren que sería de esperar la expresión de PTPRD para impactar pSTAT3 expresión (Y705). Sin embargo, esta correlación no ha surgido en los tumores HNSCC analizados hasta la fecha.
Un análisis más detallado de estos mecanismos próxima reveló que el
PTPRD
promotor no hypermethylated en HNSCC en relación con los órganos de concordancia el tejido normal, un hallazgo hemos validado en una cohorte independiente de tumor CECC y parejas normales emparejados por PCR específica de metilación. La disparidad entre nuestros resultados actuales y los informes anteriores de
PTPRD
promotor de la metilación en HNSCC es probablemente debido a la falta antes de la comparación entre el tumor y el tejido normal. [6] El bajo nivel de
PTPRD
metilación del promotor observado en CECC es, además, no está asociado a la expresión alterada pSTAT3 (Y705), lo que sugiere, además, que este evento no contribuye significativamente al fenotipo de cáncer en los CECC. La misma falta de aberrante
PTPRD
hipermetilación del promotor también ha sido reportado en el carcinoma cutáneo de células escamosas, lo que sugiere que esto puede ser un evento poco común en múltiples neoplasias epiteliales. [21]
Nuestro análisis de los datos TCGA indica que casi la mitad de los tumores HNSCC albergan una alteración del número de copias de
PTPRD
y que la pérdida del número de copias es más frecuente que el aumento de número de copias en el CECC y en todo casi todos los cánceres analizados.
PTPRD
supresión homocigotos o heterocigotos también se ha reportado en el carcinoma cutáneo de células escamosas [21,22], GBM [6,20,23,24], el cáncer de pulmón [25,26], neuroblastoma [27], melanoma metastásico [28,29], carcinoma de células escamosas de la vulva [30], carcinoma hepatocelular [31], y el carcinoma de células escamosas de laringe [5]. Es importante destacar que no se detectó ninguna asociación significativa entre la
PTPRD
número de copia alteración y
PTPRD
expresión de mRNA en HNSCC, lo que sugiere que la pérdida del número de copias no es el mecanismo principal de la pérdida de la función PTPRD en CECC.
en conclusión, hemos demostrado en este documento que la mutación somática de
PTPRD
es el principal mecanismo por el cual la pérdida de la función PTPRD se produce en los CECC. Proponemos que casi la totalidad de estas mutaciones conducen a la pérdida de la actividad catalítica y por lo tanto reduce la desfosforilación de la pSTAT3 sustrato (Y705). Mientras que la metilación del promotor y de la copia número pérdida son detectables en el
PTPRD
locus, estos eventos no están asociados con la regulación positiva de la expresión pSTAT3 (Y705). En contraste, la mutación somática de
PTPRD
conduce a aumento de la activación de STAT3 en tumores y líneas celulares HNSCC, concomitante con el aumento de crecimiento celular y la sensibilidad a la inhibición vía STAT3. Estos hallazgos sugieren que
PTPRD
mutación puede representar un biomarcador predictivo de la respuesta a la exquisita STAT3 terapia dirigida en el CECC.
Apoyo a la Información
S1 Fig.
PTPRD
promotor metilación se correlaciona con
PTPRD
la expresión de ARNm pero no se correlaciona con pSTAT3 (Y705) expresión en CECC.
(A)
PTPRD expresión de ARNm no es
significativamente asociado con pSTAT3 expresión (Y705). n = 172, Pearson r = 0,05157, P = 0,5017, R
2 = 0,002659. (B)
PTPRD
promotor metilación se correlaciona con
PTPRD
la expresión del ARNm. n = 172, Pearson r = -0,5242, P & lt; 0,0001, R
2 = 0,2747. (C)
PTPRD
metilación del promotor no está asociado de forma significativa con la expresión pSTAT3 (Y705). n = 211, Pearson r = 0.0008795, P = 0,9899, R
2 = 7.735e-007
doi:. 10.1371 /journal.pone.0135750.s001 gratis (TIF)
S2 Fig. análisis de MSP de muestras tumorales HNSCC representativos.
metilación se observó en 30/40 tumores (75%) HNSCC analizados. M denota cebadores que amplifican secuencias metiladas, mientras que U indica cebadores amplificar secuencias no metiladas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0135750.s002 gratis (TIF)
S3 Fig. El
PTPRD
promotor no es hiper-metilado en los tumores HNSCC en comparación con la mucosa normal adyacente.
Cinco tumores CECC y la mucosa normal correspondiente de los mismos pacientes fueron recogidos y analizados por MSP. M denota cebadores que amplifican secuencias metiladas, mientras que U indica cebadores amplificar secuencias no metiladas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0135750.s003 gratis (TIF)
S4 Fig.
PTPRD
es el único miembro de la familia para la que la mutación se asocia con pSTAT3 expresión (Y705) en el CECC.
Secuenciación del exoma entero y de fase inversa revelan datos de la matriz de proteínas que ningún otro
PTPR
mutaciones familiares están asociados significativamente con pSTAT3 (Y705).