Extracto
Antecedentes
Los genes que codifican las desaturasas de ácidos grasos (FADS1, 2 , 3) localizada en el punto de acceso genómico cáncer se requieren 11q13 locus para la biosíntesis de 20 ácidos grasos de carbono poliinsaturados (PUFA) que son precursores de eicosanoides directos. En varias líneas celulares de cáncer, FADS2 codificado Δ6 y desaturación Δ8 no es funcional.
Metodología /Principales conclusiones
El análisis de los ácidos grasos de células MCF7 con espectrometría de masas estructural detallada, se muestra que en ausencia de FADS2 actividad, el producto FADS1 Δ5-desaturasa opera para producir 5,11,14-20:3 y 5,11,14,17-20:4. Estos PUFA se echa en falta el 8-9 doble enlace de la señalización de los precursores del ácido araquidónico (5,8,11,14-20:4) y ácido eicosapentaenoico (5,8,11,14,17-20:5) eicosanoides. La expresión heteróloga de FADS2 restaura la actividad Δ6-desaturasa y Δ8 y la síntesis de eicosanoides precursor de lo normal.
Conclusiones /Importancia
La pérdida de actividades FADS2-codificado en las células cancerosas se apaga la biosíntesis normal de PUFA, la supresión de la suministro endógena de eicosanoides y precursores docosanoid aguas abajo, y reemplazándolos con ácidos grasos butileno-interrumpido inusuales. Si recapitulado
in vivo
, el eicosanoides normal y señalización celular medio docosanoid se agotaría y alterado debido a la reducción y sustitución de sustratos normales con sustratos inusuales, con consecuencias impredecibles para la comunicación celular.
Visto : Parque WJ, Kothapalli KSD, Lawrence P, Brenna JT (2011) FADS2 función de pérdida en el cáncer hotspot 11q13 Locus desvíos de señalización de lípidos Precursor de síntesis de eicosanoides inusuales ácidos grasos. PLoS ONE 6 (11): e28186. doi: 10.1371 /journal.pone.0028186
Editor: Daniel Tomé, Instituto de Tecnología de París para la vida, la alimentación y Ciencias Ambientales, Francia |
Recibido: 16 Septiembre, 2011; Aceptado: 2 de noviembre de 2011; Publicado: noviembre 30, 2011
Derechos de Autor © 2011 Park et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Varios estudios citogenéticos humana y mapeo fino tienen alfiler puntiagudo HSA 11q13 locus como un punto de acceso importante para un número de cánceres humanos [1], [2], [3], [4], [5]. Se han reportado numerosos mecanismos genéticos, incluyendo deleciones, 11q13 pérdida de heterocigosidad, translocaciones y amplificación alélica [3], [5]. El cúmulo de ácido graso desaturasa (DCP), codificadas por los genes
FADS1
,
FADS2
, y
FADS3
, localizar dentro de una región de 100 kb en el cromosoma humano 11q12-13.1 [ ,,,0],6], [7]. FADS2 y FADS1 codifican para enzimas críticas para la biosíntesis de cadena larga de ácidos grasos poliinsaturados (AGPICL), la introducción de dobles enlaces entre los átomos de carbono específicos. Omega-3 (ω3 o n-3) y omega-6 (ω6 o n-6) PUFA son nutrientes fundamentales relacionados con la mayoría de las enfermedades de los seres humanos, especialmente cardiovasculares (ECV), el cáncer, la diabetes y el síndrome metabólico, y son la clave componentes estructurales de tejido neural [8], [9]. El AGPICL DGLA (20:3n-6), ARA (20:4n-6), EPA (20:5n-3) y DHA (22:6n-3) son precursores de eicosanoides de señalización celular y su modificación por la inhibición de biosíntesis de metabolismo de aguas abajo son dianas farmacológicas muy valiosas, por ejemplo, inhibidores, ciclooxigenasa y lipoxigenasa, y más recientemente docosanoids que son candidatos a fármacos [10].
el Δ6-desaturasa FADS2 codificada cataliza la primera y la tasa de limitación de paso en la biosíntesis de AGPICL. En varias células de cáncer no se produce la desaturación, que puede ser debido a la inactivación de la desaturasa o de aguas arriba (por ejemplo, la producción CoA) o aguas abajo (por ejemplo, acil transferasa) pasos. La razón de este defecto se ha sugerido que es debido a amplias deleciones cromosómicas, pero no hay evidencia molecular está disponible [11], [12]. El sustratos Δ8-desaturación 20:2n-6 y 20:3n-3 se detectan a menudo, lo que sugiere que la etapa de elongación es funcional [12], [13]. Hasta hace poco, los sustratos Δ8-desaturación 20:2n-6 y 20:3n-3 fueron ampliamente considerados productos sin salida, a pesar de que se encuentran en las células plasmáticas y rojos humanos, así como otros tejidos. Nos mostró la primera evidencia molecular que cataliza FADS2 Δ8-desaturación para ambos sustratos, lo que representa una ruta alternativa para la biosíntesis de AGPICL en los mamíferos en los que se convierten en precursores de eicosanoides AGPICL [14]. Esta vía puede estar disponible cuando se ve comprometida la actividad Δ6-desaturasa
.
Nos La pérdida inusual de la actividad desaturasa de PUFA en varias células cancerosas llevó a formular la hipótesis de que el defecto primario reside en el propio desaturasa, y no en otra parte, como en la activación de PUFA por síntesis o síntesis de CoA fosfoglicéridos como aceptadores de AGPICL naciente. Se confirmó que las células de cáncer de mama MCF7 humano no poseen ninguna capacidad para la biosíntesis de AGPICL debido a la ausencia de la actividad Δ6-desaturasa [12]. Aquí se muestra la restauración de este defecto metabólico mediante la expresión heteróloga de FADS2, la evidencia de la novela de especificidad de sustrato para FADS1, y la competencia entre FADS1 y FADS2 para los mismos sustratos, lo que lleva a la producción de AGPICL inusual que no son sustratos para la producción de eicosanoides.
resultados y Discusión
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A:. No producto se observó en las células transfectadas FADS1. B: FADS2 células transfectadas Δ6-desaturar 18:2n-6 → 18:3n-6 (9,12-18:2 → 6,9,12-18:2) y 18:3n-3 → 18:4n-3 (9,12,15-18:3 → 6,9,12,15-18:4).
Cuando las células FADS1 transfectadas se incubaron con 20:2n-6 y 20:3n -3, CACI-MS /MS muestra la ganancia de la función de síntesis para generar dos nuevos butileno-interrumpido picos PUFA: 5,11,14-20:3 y 5,11,14,17-20:4, respectivamente (Figura 2) . Estos dos AGPICL son análogos a ácido araquidónico (5,8,11,14-20; 4) y ácido eicosapentaenoico (5,8,11,14,17-20:5), respectivamente. Nuestros datos demuestran que en la ausencia sustancial de actividad Δ8-desaturasa (FADS2), la Δ5-desaturasa (FADS1) opera en 20:2n-6 y 20:3n-3. Δ6-desaturación (FADS2) normalmente es aproximadamente 10 veces más activo que Δ5-desaturación (FADS1), por lo tanto, es plausible que la actividad de transformación de células durante FADS1 persistiría cuando FADS2 está inactivo. Sin embargo, los sustratos preferidos para FADS1 no son ácidos grasos esenciales (18:2n-6 y 18:3n-3), pero sus productos de elongación 20:2n-6 y 20:3n-3. FADS1 actúa sobre estos sustratos genera productos de carbono butileno-interrumpido inusuales y nuestros resultados demuestran que estos ácidos grasos raros se pueden producir en células de cáncer. Esta es la primera evidencia molecular que muestra novela FADS1 especificidad de sustrato para los ácidos grasos 20:2n-6 y 20:3n-3. Por otra parte, las células transfectadas con FADS2 demuestran de manera concluyente que el
FADS2
producto génico Δ8-desatura 20:2n-6 y 20:3n-3 a 20:3n-6 (DGLA) y 20:4n-3 (ETA ), respectivamente, equivalente a nuestros resultados en la levadura transformada de forma heteróloga [14]
a:. FADS1 células transfectadas Δ5-desaturar 20:2n-6 → 5,11,14-20:3 y 20:3n- 3 → 5,11,14,17-20:4. B: FADS2 células transfectadas Δ8-desaturar 20:2n-6 → 20:3n-6 y 20:3n-3 → 20:4n-3
Además, aunque es bien conocido que tanto. n-3 y n-6 PUFA sustratos de enzimas compiten por los mismos, nuestros datos actuales muestran FADS1 y FADS2 compitiendo por los mismos sustratos (Figura 2). La consecuencia final es la sustitución de los inactivos y 5,11,14-20:3 5,11,14,17-20:4 de ARA (5,8,11,14-20:4) y EPA (5, 8,11,14,17-20; 5), respectivamente, con consecuencias impredecibles para la señalización paracrina célula-célula mediada por eicosanoides. Desregulación de la señalización de eicosanoides está vinculado con el desarrollo tumoral, la angiogénesis y la metástasis en modelos animales [15]. Se requiere un doble enlace en la posición 8 de la ciclooxigenasa (COX), lipoxigenasa (LOX) y el tromboxano biosíntesis, y por lo tanto la ausencia del doble enlace en la posición 8 hace 5,11,14-20:3 y 5,11,14, 17-20:4 inactivo como sustratos para la biosíntesis de la mayoría de los eicosanoides [16], [17], [18]. Por otra parte, la posible acción del PUFA butileno-interrumpido como inhibidores competitivos de enzimas biosintéticas de eicosanoides es desconocida, como es la actividad de otras enzimas de síntesis de eicosanoides clave (por ejemplo, citocromo P450) cuyas acciones en las piezas normales de los ácidos grasos inusuales resultaría en productos con activit desconocido (s).
Las modas genes, que codifican enzimas requeridas para la biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados surgió evolutivamente por la duplicación de genes. A pesar de la importancia clave de la FADS2 y la pérdida de su función en varias células cancerosas, los detalles moleculares y las consecuencias de la pérdida de FADS2 no se ha descrito o investigado. FADS2 se sabe que tiene actividad hacia al menos siete sustratos (18:2n-6, 18:3n-3, 20:2n-6, 20:3n-3, 24:4n-6, 24:5n-3, 16: 0). La pérdida de las actividades de FADS2 codificada en células de cáncer se apaga completamente las vías clásica y alternativa de PUFA, eliminando de eicosanoides y la biosíntesis de precursor docosanoid de la linoleico PUFA a base de plantas y linolénico y limitando de este modo la señalización célula-célula (Figura 3). Muchos estudios han encontrado una fuerte asociación entre polimorfismos de nucleótido único dentro del grupo de genes de las modas y fenotipos complejos relacionados con las enfermedades crónicas, así como a los niveles de PUFA de cadena larga [19], [20]. Se necesitan más estudios para comprender plenamente las consecuencias de la pérdida y /o modulación de la función de genes DCP basados en SNPs en neoplasia. Los primeros estudios demostraron que la micro-celular mediada por la transferencia de HSA11 en células MCF7 reduce la tumorigenicidad, sugestivo de potenciales genes supresores de tumores en este cromosoma [21].
Δ6- y pasos Δ8-desaturación están ausentes en MCF7, dando lugar a Δ5-desaturación de 11,14-20:2 a 5,11,14-20:3 cuando FADS1 es funcional. Las vías análogas para n-3 AGPICL convierten 11,14,17-20:3 → 5,11,14,17-20:4 (no mostrados). FADS2 También se cree que está implicado en la biosíntesis de AGPICL C22 (no se muestra).
Nuestros resultados muestran que un defecto molecular primaria en las células MCF7 se encuentra dentro del gen que causa la pérdida de FADS2 FADS2 codificada Δ6-desaturasa actividad. Compensación para la función FADS2 por FADS1 conduce a la producción de 5,11,14-20:3 y 5,11,14,17-20:4, ambos productos principalmente de ácidos grasos sin salida que no pueden ser precursores para la mayoría de los eicosanoides y son probabilidades de ser inhibidores competitivos. La importancia fisiológica de butileno interrumpió PUFA en células de cáncer de llamadas para una investigación más detallada. Nuestros resultados actuales proporcionan un impulso para entender mejor el papel de las desaturasas de ácidos grasos, especialmente FADS2 como un supresor de tumores en los trastornos neoplásicos.
Materiales y Métodos
plásmido vector de la construcción
la proteína secuencias de FADS1 (GenBank adhesión#EF531577) y FADS2 (GenBank adhesión#EU780003) de codificación se clonaron en el vector de expresión pcDNA3.1 usando ADNc a partir de tejido de hígado de babuino recién nacido. El cDNA se obtuvo de muestras en bancos extraídas de un estudio aprobado por el Comité Institucional de la Universidad de Cornell Uso y Cuidado de Animales (IACUC, protocolo#02-105). El análisis y la comparación de la secuencia de aminoácidos de babuino FADS1 mostraron 95% de identidades y 97% de positivos con FADS1 humana (AF084558), mientras que, babuino FADS2 mostró 98% de identidades y 99% de positivos con FADS2 humana (NM_004265). Anteriormente, hemos demostrado función novedosa Δ8-desaturación usando babuino FADS2 [14].
cultivo de células MCF7 y la administración de suplementos de ácidos grasos
Para los experimentos de transfección se cultivaron células MCF7 en medio MEM-α con 10 % de lípido reducido FBS (medios de comunicación y el suero obtenido de HyClone) a 37 ° C en un ambiente humidificado con 5% de CO
2. MCF7 células de cáncer de mama humano (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD) fueron la especie de regalo del Dr. Rui Hai Liu, la Universidad de Cornell. Las construcciones FADS1 y FADS2 se transfectaron en células MCF7 utilizando Lipofectamine LTX (Invitrogen, EE.UU.) según las recomendaciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las células MCF7 se complementaron con 100 mM de albúmina unida 18:2n-6, 18:3n-3, ácidos 20:2n-6 y 20:3n-3 grasos y se incubaron durante 24 horas adicionales.
Fatty análisis de ácidos
Después de la incubación con los ácidos grasos, las células se lavaron dos veces con 1X PBS y se eliminan mediante tripsinización. Las células se recogieron por centrifugación y el sedimento de células se procesaron para su extracción. Fatty preparación de éster metílico del ácido se llevó a cabo usando un método de una etapa modificada de Garces y Mancha [22]. El análisis fue por detección de ionización de gas cromatografía de llama (GC-FID) [8] y el pico de identificación se confirmó mediante GC-covalente químico aducto de ionización espectrometría de masas (GC-CACI-MS /MS) [14], [23].