Extracto
Aproximadamente el 50% de los pacientes con cáncer vesical infiltrante (MIBC) desarrollar metástasis enfermedad, que es casi invariablemente letal. Sin embargo, nuestra comprensión de las vías que conducen a un comportamiento agresivo de MIBC es incompleta. Los miembros de la subfamilia FOXA de factores de transcripción están implicados en el desarrollo de tumores malignos urológicos y urogenitales normales. Foxa proteínas están implicadas en la diferenciación urotelial normal, pero su papel en el cáncer de vejiga es desconocida. Se examinó la expresión comúnmente utilizada en FOXA
in vitro y modelos de cáncer de vejiga y en muestras de cáncer de vejiga humana, y se utiliza una novela
sistema de recombinación
tejido in vivo para determinar el significado funcional de la expresión en FOXA1 cáncer de vejiga. El análisis de regresión logística mostró una disminución de expresión FOXA1 se asocia con el aumento de la etapa del tumor (p & lt; 0,001), y la pérdida de FOXA1 se asocia con el grado histológico alto (p & lt; 0,001). Además, se encontró que urotelio de la vejiga que se ha sometido a queratinizante metaplasia escamosa, un precursor al desarrollo de carcinoma de células escamosas (SCC) exhibió la pérdida de expresión FOXA1. Por otra parte, el 81% de los casos de SCC de la vejiga fueron negativos para la tinción FOXA1 en comparación con sólo el 40% de los carcinomas de células uroteliales. Además, se demostró que una subpoblación de células tumorales negativos uroteliales FoxA1 son altamente proliferativas. Desmontables de FOXA1 en células de cáncer de vejiga RT4 resultó en el aumento de expresión de UPK1B, UPK2, UPK3A, y UPK3B, disminución de la expresión de E-cadherina y aumentó significativamente la proliferación celular, mientras que la sobreexpresión de FOXA1 en células T24 aumentó E-cadherina expresión y disminuyó significativamente el crecimiento celular y la invasión.
In vivo
recombinación de las células del cáncer de vejiga diseñados para exhibir la expresión reducida FOXA1 con embrionaria mesénquima vejiga de rata y posterior injerto cápsula renal dio lugar a la proliferación tumoral mejorada. Estos resultados proporcionan la primera evidencia de la pérdida de expresión FOXA1 con subtipos histológicos de MIBC y la proliferación de células uroteliales que une, y sugieren un papel importante para FOXA1 en el fenotipo maligno de MIBC
Visto:. DeGraff DJ, Clark PE, Cates JM, Yamashita H, Robinson VL, Yu X, et al. (2012) La pérdida de la diferenciación FOXA1 urotelial marcador se asocia con el alto grado, finales de la etapa del cáncer de vejiga y el aumento de la proliferación tumoral. PLoS ONE 7 (5): e36669. doi: 10.1371 /journal.pone.0036669
Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de noviembre de 2011; Aceptado: April 9, 2012; Publicado: 10 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 DeGraff et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. DJD era con el apoyo de la Sociedad Americana del cáncer de los Grandes Lagos Cancer Research Fund-División de Michigan beca posdoctoral. PEC fue apoyada por los Estados Unidos Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención K08-CA113452. Este estudio también fue apoyado en parte por el NIH subvención CA143971 a DT, una Mérito concesión de la revisión de la Administración de Veteranos de XW, y NIH subvención R01-DK55748 a RJM. Esta investigación también fue financiada en parte por Vanderbilt CTSA UL1RR024975-01 subvención del CNRR /NIH. Los autores desean reconocer la experiencia técnica y el asesoramiento de Doug Strand y Simon Hayward durante el diseño de experimentos de recombinación del tejido, y el apoyo de Michael Kidd, Tom Case y Manik Paul, así como la Red de Investigación de Cáncer de Vejiga (BCRN), la Red de Defensa de la vejiga cáncer (BCAN), y Diane Zipursky Quale por su apoyo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. DJD, PEC, JMC, SFS, HFF, DT, y RJM haber presentado una divulgación de la invención con la Universidad de Vanderbilt para el uso de FOXA1 como un diagnóstico y /o marcador pronóstico de cáncer de vejiga. No hay otros productos en desarrollo o los productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Se estima que en 2011 más de 69.250 personas en los Estados Unidos se les diagnosticará carcinoma de la vejiga urinaria [1]. Más de 90% de los cánceres de vejiga se histopatológicamente clasificado como carcinomas uroteliales de células (UCC), mientras que los adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas (SCC) y carcinomas de células pequeñas representan variantes histológicas menos comunes. La mayoría de los pacientes presentan enfermedad no invasiva, pero a menudo se desarrollan recurrencia, a veces con la progresión de la invasión del estroma. Por lo tanto, la vigilancia atenta de estos pacientes por cistoscopia y citología de orina periódica se requiere el tratamiento de tumores siguiente. Por lo tanto, el manejo clínico de los pacientes con la enfermedad de Tis o Ta es extraordinariamente caro [1]. Por otra parte, la intervención clínica tras el diagnóstico de cáncer de vejiga invasivo muscular (MIBC; tumoral stage≥T2) por lo general implica la cistectomía radical. A pesar de la intervención quirúrgica agresiva, aproximadamente el 50% de los pacientes sometidos a cistectomía radical experimentará recurrencia de la enfermedad, por lo general en la forma de la enfermedad metastásica. El desarrollo de la enfermedad metastásica es casi siempre mortal, y se estima que en 2011 más de 14.990 personas en los Estados Unidos morirán de cáncer de vejiga metastásico en los Estados Unidos [1].
En relación con otros tumores malignos, la vejiga el cáncer está muy poco estudiada y con fondos insuficientes. Dado el alto costo de la vigilancia y la alta tasa de mortalidad en pacientes con enfermedad avanzada, el aumento de los esfuerzos para definir son necesarios los procesos biológicos críticos a tales problemas urgentes clínicos de la recidiva del tumor, así como la progresión de la invasión del músculo, y /o metástasis a distancia. Un enfoque consiste en identificar aquellas vías que influyen en la diferenciación normal que son perturbados durante la iniciación y progresión tumoral. Un grupo de proteínas que parece desempeñar un papel importante en el desarrollo y control de la expresión específica de tejido en el urotelio de la vejiga consiste en seleccionar a los miembros de la familia forkhead caja (FOX) de factores de transcripción. Varios informes recientes han implicado un papel central para un miembro de esta familia, FOXA1, en la diferenciación urotelial [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Mientras FOXA1 se expresa en murino adulto normal y urotelio humano, la extensión de la expresión miembro de la familia FOXA en el carcinoma de vejiga es desconocida. Desde otras proteínas FOX han sido implicados en el desarrollo y la progresión de una variedad de tumores malignos [8], se inició un estudio para interrogar expresión miembro de la familia FOXA en líneas celulares de cáncer de vejiga humanos y en muestras de tumores humanos, así como para determinar el funcional papel de FOXA1 en un modelo de recombinación del tejido de la biología de las células tumorales urotelial.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
muestras de tejido de la vejiga humana identificados-de se obtuvieron a partir del tejido de Vanderbilt Adquisición Core a través del Departamento de Patología de acuerdo con protocolos Vanderbilt IRB. microarrays de tejido fueron creadas como se describe anteriormente [9] a partir de tejido de vejiga humano de-identificado obtenido de la Universidad de Virginia, y se utiliza de acuerdo con la Universidad de Virginia protocolos IRB. Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado que se aprueba el uso de sus tejidos con fines de investigación no especificados. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo como se define en Vanderbilt número de protocolo de animales M-10 a 411, y de acuerdo con la Ley de Protección de los Animales y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de Vanderbilt Institucional. cuidado de los animales /bienestar y la supervisión veterinaria fue proporcionada por el Vanderbilt División de Cuidado de Animales.
Cultivo de células
Las líneas celulares de cáncer de vejiga humana previamente establecidos RT4 [10] y T24 [11] se mantuvieron en medio modificado de McCoy suplementado con 10% FBS. J82 [12], 5637 [13] y UMUC-3 [14] las líneas celulares de cáncer urotelial humanos se cultivaron en DMEM con L-glutamina y glucosa alta (4,5 g /L; Mediatech) suplementado con 10% de FCS (Atlanta Biologicals) y 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina (BioWhittaker /Cambrex). 253J-P y 253J-BV se obtuvieron [15] las células a través de un acuerdo de transferencia de material desde el laboratorio del Dr. Colin Dinney (Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center) y se cultivaron en MEM (Mediatech) suplementado con 10% de FCS (Atlanta Biológicos ), 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina (BioWhittaker /Cambrex), 10 mmol /L de piruvato sódico (Mediatech), aminoácidos no esenciales 1x (Mediatech) y solución de vitaminas 2x MEM (Mediatech). células scaber [16] se obtuvieron de ATCC y se mantuvieron en medio esencial mínimo (Eagle) (Invitrogen) que contiene 10% de FCS con 2 mM L-glutamina (Mediatech) y solución salina equilibrada de Earle (Invitrogen) ajustado para contener 1,5 g /L de sodio bicarbonato, 0,1 mM aminoácidos no esenciales, y 1,0 mM de piruvato de sodio. La líneas celulares de adenocarcinoma prostático humano LNCaP previamente establecida [17] y PC3 [18] y la línea celular de carcinoma hepatocelular HepG2 [19] se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en 5% de CO
2.
PCR
extracción de ARN se realizó con kits RNeasy (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante con la digestión con ADNasa. Posteriormente, el ADNc se amplificó de acuerdo con protocolos estándar. PCR se realizó con grupos de cebadores para FOXA1 humana (fwd-CGCTTCGCACAGGGCTGGAT, rev-TGCTGACCGGGACGGAGGAG), FOXA2 (fwd-TGCCATGCACTCGGCTTCCA, rev-CCCAGGCCGGCGTTCATGTT), FOXA3 (fwd-CTGGCCGAGTGGAGCTACTA, rev-GAGGATTCAGGGTCATGTAGGA). Las secuencias de cebadores utilizados para la PCR de uroplakin transcripciones estándar se han informado anteriormente [20]. Los conjuntos de cebadores para el análisis Q-RT-PCR incluyen UPK1A FWD-GGTGTGGGTGCCGCACTCTG, rev-GGTCGGTGTCCGCGCTGTAG), UPK1B (fwd-GCCCTACCGTGTGCGCAGAAA, rev-AGCAGGCCCTGGAAGCAACG), UPK2 (fwd- CTCTGCTGTCCCCAGGGGCT, rev-GGCAACCAGCAGGCTCTCCG), UPK3A (fwd-TCACTGGCACCCACGAGGTCT, REV- CGTTGAGCCCAGTGGGGTGTT), y UPK3B (CCCTGGCCCTGGACCCTATCG fwd-, rev-CCACAGGCTGGAGAAGCGCA). GAPDH (fwd-TGCACCACCAACTGCTTAGC, rev-GGCATGGACTGTGGTCATGAG) se utilizó como se informó anteriormente [21] como un control interno para las reacciones de PCR.
muestras de tejidos humanos
El presente estudio incluyó dos cohortes de pacientes independientes de Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt y la Universidad de Virginia Medical Center (que se resumen en la Tabla 1). Los estudios se realizaron después de la aprobación de las Juntas de Revisión Interna en cada una de las instituciones participantes. secciones de tejido enteras se han preparado a partir de muestras de resección transuretral del tumor endoscópicos de 18 pacientes con enfermedad en estadio Ta grado bajo tratados en la Vanderbilt University Medical Center. Las muestras de tejido de muestras de tumores primarios derivados de la cohorte de pacientes de la Universidad de Virginia estaban representados en una micromatriz de tejido previamente descrito (TMA) [9]. núcleos de tejido cuadruplicado (0,6 mm) de tumor viable se recogieron de los bloques de tejido de zinc-fijado en formol archivados de 167 especimenes de la cistectomía. Las muestras de patología originales fueron revisados para registrar el subtipo histológico y grado, así como confirmar el estadio patológico de los tumores. Los tumores se clasifican histológicamente en una escala de 1-4, con grado 4 como el más alto grado. De los 19 pacientes que recibieron terapia neoadyuvante, 6 fueron tratados con radioterapia, 8 con quimioterapia y el resto con la combinación de quimiorradioterapia. La cohorte TMA incluye 112 carcinomas uroteliales, 21 carcinomas de células escamosas, 5 adenocarcinomas primarios, 3 de células pequeñas (neuroendocrinos de alto grado) carcinomas, 1 uroteliales mixta y carcinoma escamoso, 1 adenocarcinoma con focos sarcomatoide y 2 carcinomas uroteliales con focos sarcomatoide (Tabla 1). Un TMA adicional de la Universidad de Virginia consistió en núcleos de tejido por cuadruplicado (0,6 mm) de metástasis de ganglios linfáticos disecados de 28 pacientes representados en el tumor primario TMA (Tabla 1).
Además de tumor muestras para las cuales se dispone de datos demográficos como se describe en la Tabla 1, archivo de tejidos que consiste en tumor y el tejido normal adyacente (NAT) de 10 pacientes que se sometieron a cistectomía para el cáncer de vejiga avanzado en la Universidad de Vanderbilt se recogieron para el análisis de FOXA1 y uroplakin. Además, se identificaron archivo de tejidos que consta de 21 pacientes con metaplasia escamosa no queratinizado. De estos, 2 pacientes tenían áreas de queratinizante metaplasia escamosa, y 15 pacientes tenían NAT, que sirvió como control.
inmunohistoquímica e inmunofluorescencia doble
La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente [22], [23]. Brevemente, los portaobjetos se desparafinaron, rehidratada a través de una serie de alcoholes graduados y se lavó en agua doblemente desionizada durante 5 minutos. Los tejidos se colocaron a continuación en una solución de desenmascaramiento antígeno (Vector Labs, Burlingame, CA) y se llevó a cabo la recuperación de antígeno por las muestras de microwaving durante 20 minutos a una potencia del 30% en un horno de microondas de 900 vatios. Las láminas fueron luego se enfrió a temperatura ambiente, y después se lavó 3 veces durante 10 minutos en PBS (pH 7,4). Para la inmunohistoquímica, todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con el uso de reactivo de bloqueo de peroxidasa (Dako América del Norte, Carpinteria, CA) durante 20 minutos, después de lo cual las secciones se lavaron de nuevo en PBS 3 veces durante 10 minutos. muestras preparadas se incubaron en suero de cabra durante 30 min para reducir la unión de anticuerpo no específica. Diapositivas, donde después se incubaron durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda con 1:1000 diluciones de cualquiera de cabra FOXA1 policlonal (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA), policlonal de cabra FOXA2 (Santa Cruz Biotechnology) o un anticuerpo pan-uroplakin, AUM [ ,,,0],24] diluida en PBS 1:5000. a continuación, se lavaron los portaobjetos 3 veces durante 10 minutos con PBS y el anticuerpo secundario biotinilado diluido en PBS se añadió a continuación. El anticuerpo primario se visualizó usando el kit Vectastain Elite ABC peroxidasa (Vector Labs) de acuerdo con el protocolo del fabricante con DAB en tampón de sustrato como cromógeno (Thermo Scientific, Fremont CA). Para FOXA1 y FOXA2, las diapositivas se anotó la presencia o ausencia de tinción nuclear específica. El control positivo para FOXA1 eran de tipo salvaje tejido de la próstata murino, y el control positivo para FOXA2 era tejido prostático de probasina-antígeno T anteriormente descrito //activa beta-catenina ratones bigenic dominantes [21]. Para pan-UPK, se registró la presencia o ausencia de inmunorreactividad citoplásmica en las células tumorales. La inmunotinción de tejido de la vejiga humana se llevó a cabo para la citoqueratina escamosas marcador de epitelio 10 (1:100; Dako, Carpinteria CA), y el basal citoqueratina marcador de células 14 (1:200; Dako). La tinción de inmunofluorescencia se realizó en tejidos de la vejiga humanos con anticuerpos para Ki67 (1:100; Dako; Carpinteria, CA; clon MIB-1) y FOXA1 (1:100: Santa Cruz)
Stable línea celular Generación
Después de la transfección de células de empaquetamiento phoneix, las partículas retrovirales se filtraron y se purifica, y las partículas virales se utilizaron para la infección de RT4 y líneas de células de vejiga T24 diana. Después de la infección retroviral, se puromicina seleccionaron las células RT4 para expresar de manera estable un FOXA1 dirigido constructo shRNA que resulta en una disminución de expresión FOXA1 (RT4-FOXA1 KD) o revueltos shRNA que expresan las células de control (RT4-SCR) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Origene, Rockville, MD) . Del mismo modo, se puromicina seleccionaron las células T24 después de la infección viral para expresar de forma estable el plásmido que contiene un inserto pLPCX FOXA1 (T24-FOXA1) o vector vacío (T24-pLPCX). Los datos de los análisis de microarrays descritos en este manuscrito se depositarán en una base de datos a disposición del público en cumplimiento de las directrices MIAME.
Tejido recombinación xenotrasplante
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la aprobación institucional IACUC. Aislamiento de mesénquima embrionario vejiga (EBLM), la preparación de recombinantes de tejido, y cirugías cápsula renal se realizaron como se describe anteriormente [2]. ratas preñadas (Harlan Laboratories, Tampa FL) fueron sacrificados en el día embrionario 16 (E16) (enchufe día = 0). Las vejigas fueron entonces microdissected de embriones aislados, y vejigas de embriones se separaron del seno urogenital en el cuello de la vejiga y los uréteres adjuntos diseccionaron cuidadosamente. vejigas enteros A continuación se colocaron en solución salina de calcio y magnesio libre de Hanks (Gibco) que contiene EDTA 25 mM (Sigma, St. Louis MO) durante 90 minutos para liberar el urotelio de la vejiga. El mesénquima y urotelio se separaron manualmente bajo examen microscópico, dejando atrás el mesénquima como un revestimiento de cámara. Cincuenta mil células RT4-Scr y células RT4-FOXA1 KD se resuspendieron en 50 microlitros de una relación 03:01 de colágeno de cola de rata y la solución de ajuste, y se sembraron en placas de 10 cm. Después de la inserción de 1 EBLM por alícuota, los recombinantes de tejido se colocaron a 37 ° C para promover la solidificación. medio de McCoy modificado (Gibco) que contiene 10% de FBS se aplicó luego a solidificado injertos y se incubó durante la noche. El día siguiente, dos recombinantes de tejido se colocaron bajo la cápsula renal del riñón izquierdo de 5 ratones SCID, resultando en un total de 10 injertos. Tres semanas después de la implantación, los ratones fueron inyectados con BrdU y se sacrificaron. riñones disecados que contienen los recombinantes de tejido se fijaron en formalina y se sometieron a procesamiento estándar en preparación para inmunohistoquímica. Los experimentos con animales se repitieron una vez. mediciones de volumen del tumor se realizaron mediante métodos estándar y se representan como el volumen del tumor veces.
Western Blot análisis
Análisis de Western Blot se realizó como se informó anteriormente [25]. Brevemente, los lisados celulares se prepararon con completa kit de lisis-M (Roche, Nutley NJ) según el protocolo fabricación y las concentraciones de proteína se determinaron mediante el protocolo BCA estándar (Pierce, Rockford, IL). Los lisados celulares (30 g) se sometieron a electroforesis en un 10% Bis-Tris geles durante 50 minutos a 200 V. transferencia electroforética a membranas de nitrocelulosa (nylon reforzado Osmonics, Minnetonka, MN) se llevó a cabo durante la noche a 30 V, seguido de Ponceau- S tinción (Sigma) con el fin de verificar la carga igual de proteínas y transferencia. Las membranas se bloquearon durante la noche en leche en 5% sin grasa seca (NFDM), 0,1% de Tween 20 (Sigma) en 1X solución salina tamponada con Tris. El día siguiente, las membranas de nitrocelulosa se incubaron con anticuerpo de cabra anti-FOXA1 (Santa Cruz; 1/1000), anti E-cadherina (BD Biosciences; 1/1000) o actina contra beta (Sigma; 1/1000) seguido de HRP apropiado anticuerpo secundario conjugado (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) a una dilución de 1 /2.000.
Crystal ensayos de crecimiento violeta
Las células (5.000 por pocillo) se sembraron en placas de cultivo de 24 pocillos ( Falcon) y se dejaron unir durante la noche en medio de McCoy que contenía 10% de FBS y 0,5 g /ml de puromicina. El día siguiente, el medio de cultivo se aspiró, y las células fueron fijadas en 11% de glutaraldehído (Sigma) y se incubó a temperatura ambiente en un conjunto agitador orbital a 500 ciclos /min. Las células se lavaron a continuación 3 veces por inmersión en agua desionizada y se dejaron secar al aire y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta disuelto en 200 mM de ácido bórico (Sigma), pH 8,0. Después de la incubación durante 20 minutos en un agitador orbital, el exceso de violeta cristal se separó después por lavado en agua desionizada y se dejó secar al aire. Crystal mancha violeta se disolvió a continuación en 10% de ácido acético (Sigma) y la absorbancia se leyó a 590 nm después de la sustracción del fondo. ensayos de crecimiento de cristal violeta se llevaron a cabo durante cinco días por triplicado y se repitieron dos veces.
Los ensayos in vitro de invasión
in vitro
invasión ensayos se realizaron como se informó anteriormente [26]. Falcon insertos de cultivo celular (8 micras poros) se lavaron dos veces con medio de McCoy y posteriormente recubiertos con 20 l de factor de crecimiento reducido Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes NJ) diluido 1:06 y se dejó solidificar durante 30 minutos. RT4-Scr, RT4-FOXA1 KD, T24-pLPCX, y T24-FOXA1 (1 × 10
5 /pocillo) se añadieron a pocillos individuales en 200 l si medio de McCoy (10% de FBS, 0,5 mg /ml de puromicina) , y 300 ul de medio idéntico se añadió a la cámara inferior. Después de 24 y 48 horas de incubación, el medio se aspiró de la cámara inferior, y las células invadidas se fijaron en 5% de glutaraldehído disuelto en 1x PBS durante 10 min a temperatura ambiente, y las células se lavaron posteriormente en agua desionizada tres veces. células invadidas se tiñeron mediante la adición de 0,5% de azul de toluidina (Sigma) en carbonato de sodio 2% e incubando 20 min, después de lo cual colorante toluidina y medio fue aspirado de la cámara superior e inferior, respectivamente. La cámara inferior se lavó entonces tres veces con agua desionizada, y las células no invadidos se eliminaron por limpiar el interior de la cámara superior suavemente con un hisopo de algodón, e invadió las células se contaron bajo un objetivo 20x. Invasión ensayos se realizaron por triplicado y se repitieron dos veces.
El análisis estadístico
Las asociaciones entre FOXA1 nuclear y la tinción FOXA2 y parámetros clínico se evaluaron utilizando métodos univariados estándar. FOXA1 y expresión FOXA2 estado fue resumida por el estadio del tumor, estado ganglionar, tipo histológico y grado. pruebas de la X2 de asociación se realizaron entre los valores de expresión en dicotomía y cada parámetro patológico. Para la expresión FOXA1, la regresión logística se utilizó para probar el predictor "estadio del tumor" como una variable ordinal con cinco categorías (Ta, T1, T2, T3 y T4). Las pruebas de asociación se realizaron tanto en el conjunto de datos y el subconjunto de muestras únicas de TCC. El análisis estadístico se realizó en SAS 9.2. Todas las pruebas se evaluaron a α = 0,05. La evaluación estadística de las diferencias en el volumen del tumor entre RT4-revueltos y RT4-FOXA1 KD se realizaron por métodos univariados estándar, con p & lt; 0,05 consideró significativo
Resultados
FOXA1 y expresión está restringida a FOXA2. líneas celulares de cáncer de vejiga específicas: Read
en los estudios sobre el desarrollo de la vejiga urinaria, se encontró expresión FOXA1 nuclear estar restringido al compartimiento urotelial y se mantuvo en el urotelio de adultos [27]. Por el contrario,
In situ
análisis de hibridación expresión indicada de FOXA2 durante el desarrollo embrionario temprano [28], mientras que ninguna expresión fue evidente en etapas posteriores del desarrollo urotelial o en el urotelio de la vejiga adultos [27]. Como un primer paso en la caracterización de la expresión de los miembros de la familia Foxá en el cáncer de vejiga, se realizó RT-PCR en las líneas celulares de cáncer de vejiga humana comúnmente utilizados RT4, T24, J82, 5637, 253J, 253J-BV, UMUC3 scaber. Curiosamente, sólo la línea celular RT4, que se propaga originalmente de un tumor bien diferenciado [10], mostró una expresión de alto FOXA1. Además, la expresión de FOXA1 se asoció con la presencia de transcritos UPK (Fig 1A), de los cuales se utiliza UPK2 como un marcador de diferenciación urotelial. 5637 células también co-expresan bajos niveles de ARNm y FOXA1 UPK. células T24 expresan niveles muy bajos de FOXA1 y UPK2, pero también mostraron evidencia de expresión FOXA2 (Fig. 1A). Quantitative análisis RT-PCR de células scaber establecidas a partir de un tumor SCC primaria mostró que la expresión FOXA1 fue significativamente menor en comparación con éstos cuando RT4 (Fig. 1B). Ninguna de las líneas celulares examinadas expresó FOXA3, un tercer miembro relacionado de la familia FOXA (datos no mostrados). Como expresión FOXA1 se asoció con UPK en RT4 y 5637 células, se determinó la expresión de estos marcadores en muestras de cáncer de vejiga humana. De las 10 muestras positivas con FOXA1 NAT, y el tumor asociado negativo FOXA1, 4 tumores exhiben tinción AUM negativa, mientras que los tumores 6 retenidos tinción AUM (Fig. 1C). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la pérdida de expresión FOXA1 se asocia con disminución o expresión UPK ausente en líneas celulares de cáncer de vejiga humana ampliamente utilizados y en un subconjunto de tejido del tumor de vejiga humano
A:. Un panel de uso general líneas de células uroteliales se proyectó a través tradicional RT-PCR para la presencia de FOXA1, FOXA2, y las transcripciones FOXA3, así como los miembros de la familia uroplakin (UPK). las células HepG2, que expresan cada miembro de la subfamilia FOXA, se utilizaron como controles positivos (datos no presentados). células RT4 exhibieron sólida expresión de FOXA1 y como se informó anteriormente, miembros de la familia UPK [20]. se detectó expresión FOXA2 en células T24, pero no se correlacionó con la expresión miembro de la familia UPK. FOXA3 no se detectó en cualquier línea celular probado (datos no mostrados). B: Análisis de Q-RT-PCR muestra la expresión FOXA1 en la línea celular derivada de un SCaBER SCC primaria y en T24 es significativamente menor en comparación con RT4. expresión FOXA1 C:Decreased se asocia con una disminución de la expresión de UPK en el tejido humano. tejido normal adyacente Archivo (panel superior) y músculo de la vejiga invasivo del tumor se inmunotiñó con un anticuerpo pan-UPK, AUM [24], así como un anticuerpo dirigido contra FOXA1. De las 10 muestras positivas con FOXA1 NAT, y el tumor asociado negativo FOXA1, 4 tumores mostraron tinción negativa AUM.
caída FOXA1 en RT4 células aumenta uroplakin expresión
El uroplakin (UPK) familia de genes en los seres humanos consiste en UPK1A, UPK1B, UPK2, UPK3A y UPK3B [29]. Aunque disminución de la expresión FOXA1 parecía estar correlacionada con la disminución de la expresión UPK en líneas celulares de cáncer de vejiga de uso común, y en una minoría de muestras de cistectomía humanos (figura 1), el anticuerpo AUM utilizado para estos estudios reconoce todos los miembros de la familia uroplakin [30] . Además, se informó previamente que desmontables de FOXA1 dio lugar a aumentos y disminuciones en la expresión de miembros de la familia UPK [5]. Por lo tanto, no estaba claro si la expresión alterada FOXA1 dio lugar a cambios de miembros de la familia uroplakin individuales. A medida que las células RT4 expresan FOXA1 y cada miembro de la familia UPK (figura 1), se utilizó un enfoque para diseñar shRNA células RT4 estables con una disminución de la expresión FOXA1 para determinar el impacto de silenciamiento de la expresión FOXA1 UPK (figura 2). Curiosamente, los estudios realizados sobre microarrays RT4-Scr y RT4-FOXA1 KD KD indicaron FOXA1 se asoció con un aumento de la expresión miembro de la familia UPK. Los estudios cuantitativos de RT-PCR de células RT4-SCR y RT4-FOXA1 KD validan esta observación, lo que demuestra que FOXA1 KD resultó en un aumento significativo en la expresión de UPK1B, UPK2, UPK3A, y UPK3B (Figura 2C-F). Por lo tanto, aunque FOXA1 y UPK se pierden en la mayoría de líneas celulares establecidas a partir de alto grado, tumores MI y en un subconjunto de muestras de cistectomía humanos, FOXA1 KD en RT4 células da como resultado significativamente el aumento de expresión miembro de la familia UPK
in vitro
a:. derribo estable de FOXA1 en células de cáncer de vejiga humana RT4 (Ver Figura 6 para los niveles de proteína FOXA1 tras caída en RT4). B: No se detectaron cambios significativos en UPK1A siguiente KD FOXA1. (CF): los niveles de mRNA de UPK1B, UPK2, UPK3A, y UPK3B se incrementaron significativamente después de la caída FOXA1
La pérdida de expresión FOXA1 se asocia con estadio tumoral avanzado y de alto grado histológico
Para determinar la extensión de FOXA1 y expresión FOXA2 en varias etapas de cáncer de vejiga, se realizó un análisis inmunohistoquímico en muestras de tumores humanos (Fig. 3). La prevalencia de expresión FOXA1 disminuyó con el aumento estadio del tumor (Tabla 2). FOXA1 se expresó de manera uniforme en los tumores de vejiga Ta etapa, en comparación con sólo el 67% de los tumores T1 etapa, el 59% de los cánceres de etapa T2, el 42% de los tumores en estadio T3, y el 34% neoplasias etapa T4. análisis de regresión logística demostró que la pérdida de expresión FOXA1 se asoció significativamente con el aumento de la etapa del tumor (p & lt; 0,001). La pérdida de expresión FOXA1 también se produjo en los tumores de alto grado histológico (p & lt; 0,001; Tabla 2). FOXA1 también fue negativa con más frecuencia en los tumores de pacientes de sexo femenino. Sin embargo, esta asociación no alcanzó significación estadística tras la normalización de estadio y grado tumoral (p = 0,096). FOXA2 no se detectó en los tumores en estadio Ta y sólo estaba presente en el 12% de los cánceres en etapas superiores. No se encontraron asociaciones significativas entre la expresión FOXA2 y el estadio tumoral o el grado histológico.
AJCC estadio Ta, T1, T2, T3 y T4 tumores de vejiga se immunostained para FOXA1 y FOXA2. Casos representativos se ilustran en los paneles superiores. área Tis se representa en un paciente diagnosticado de tumor T1 AJCC etapa vejiga. Asociación entre la pérdida de expresión FOXA1 y la etapa de aumento fue confirmada por regresión logística (panel inferior, p & lt; 0,001). Un pequeño subgrupo de tumores invasivos exhibió expresión nuclear de FOXA2.
FOXA1 expresión se reduce significativamente en queratinizante metaplasia escamosa y carcinomas de células escamosas de la vejiga urinaria
La mayoría de las los cánceres de vejiga se identificaron histológicamente como UCC. SCC es la siguiente variante histológica más común de cáncer de vejiga. Un precursor reconocido de SCC es el desarrollo de metaplasia escamosa queratinizante (KSM). KSM es distinta de no-KSM, que es relativamente común y benigno. A medida que el pronóstico de los pacientes con SCC nonbilharzial de la vejiga urinaria es especialmente grave [31], se comparó la expresión FOXA1 en KSM, no KSM y SCC. El análisis histológico reveló que mientras FOXA1 se expresó en no KSM (Fig. 4A, inserción, panel izquierdo), y se superponen con la expresión de CK14 células basales positivos, FOXA1 no se expresó en KSM (Fig. 4A) o la mayoría de SCC (Fig . 4B). expresión FOXA1 se perdió en 81% de las muestras de SCC (Fig 4B.) en comparación con 40% de UCC de la vejiga (prueba exacta de Fisher, p & lt; 0,001) (Tabla 3). Mientras que la mayoría de SCC se diagnostica en una etapa relativamente avanzada del tumor, la asociación entre el SCC y la pérdida FOXA1 siguió siendo significativa (p = 0,0043), incluso después de ajustar por el estadio del tumor. Además, la tinción FOXA1 de un TMA que consiste en depósitos tumorales metastásicos de ganglios linfáticos positivos disecados de 28 pacientes representados en el tumor primario TMA (Fig. 4C) reveló una asociación entre la pérdida de más FOXA1 y SCC. Fuera de los originales 28 casos, el tejido suficiente para el análisis quedó en sólo 22 muestras. Cinco casos de metástasis en los ganglios linfáticos (23%) fueron negativos para la expresión FOXA1. Tres de cada 5 ganglios linfáticos FoxA1-negativas (60%) fueron disecados de los pacientes con diagnóstico de SCC primaria. De estos, 2 (un estadio T4 y una etapa T2) fueron emparejados a los tumores primarios FoxA1-negativos, uno se corresponde con un tumor primario estadio T3 con la pérdida de expresión FOXA1. Los restantes 2 metástasis en los ganglios linfáticos FoxA1-negativos fueron disecados de los pacientes diagnosticados con TCC estadio T3 y el carcinoma de células pequeñas, los cuales fueron negativos para la expresión FOXA1
(A) H & amp;. E y la inmunotinción de no queratinizante Alabama.