Extracto
Antecedentes
La activación de la vía de señalización de Wnt está implicada en proliferación celular aberrante en diversos tipos de cáncer. En 40% de los cánceres de ovario endometrioide, la activación constitutiva de la vía se debe a mutaciones oncogénicas en β-catenina u otras mutaciones inactivadoras en reguladores negativos clave. proteína relacionada con frizzled secretada 4 (SFRP4) ha propuesto que tenían actividad inhibidora través de la unión y el secuestro de ligandos Wnt.
Metodología /Principales conclusiones
Se realizó RT-qPCR y Western-Blot en primaria las culturas y las líneas de células de ovario de SFRP4 y sus reguladores aguas abajo del teclado activado β-catenina, β-catenina y GSK3. SFRP4 se examinó por inmunohistoquímica en una cohorte de 721 pacientes y debido a su función secretora propuesto, en el plasma, presentando la primera ELISA para SFRP4. SFRP4 fue más altamente expresado en el epitelio de trompas y disminuyó con la transformación maligna, tanto en el ARN y en el nivel de proteínas, en el que fue aún más profundo en la fracción de membrana (p & lt; 0,0001). SFRP4 se expresó en el nivel de proteínas en todas las histotypes de cáncer de ovario, pero se redujo de tumores borderline a los cánceres y con la pérdida de la diferenciación celular. La pérdida de la expresión en la membrana fue un predictor independiente de mala supervivencia en pacientes con cáncer de ovario. (P = 0,02 sin ajustar; p = 0,089 ajustada), lo que aumenta el riesgo de un paciente de morir de esta enfermedad por el factor 1,8
conclusiones /Importancia
Nuestros resultados apoyan el papel de
SFRP4
como un gen supresor tumoral en el cáncer de ovario
a través de
inhibición de la vía de señalización Wnt. Esto tiene implicaciones no sólo predictivos sino que también podría facilitar un papel terapéutico utilizando objetivos epigenéticos
Visto:. Jacob M, Ukegjini K, S Nixdorf, Ford CE, Olivier J, Caduff R, et al. (2012) La pérdida de la proteína relacionada con Frizzled secretada 4 se correlaciona con un fenotipo agresivo y predice el resultado pobre en cáncer de ovario pacientes. PLoS ONE 7 (2): e31885. doi: 10.1371 /journal.pone.0031885
Editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital de & amp; Centro de Investigación, Arabia Saudita
Recibido: 15 de agosto de 2011; Aceptado 14 de enero de 2012; Publicado: 21 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Jacob et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Cancer Liga Cantón de Zúrich (VHS); Oncosuisse (02115-08-2007 a V.H.S.); Fundación Nacional de Suiza (320000-12.543 a V.H.S .; PBZHP3-133289 a F. J.); Fundación Europea de la Ciencia (a V.H.S.); Instituto de Cáncer de Nueva Gales del Sur (09 /CRF /2-02 a V.H.S.); Real de Australia y Nueva Zelanda Colegio de Obstetras y Ginecólogos (a V.H.S.); William Maxwell Trust (a V.H.S.) y el Royal Hospital for Women Foundation (a V.H.S.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cáncer de ovario
epitelial (EOC) es la quinta causa más común de muerte por todos los cánceres se producen en las mujeres y la principal causa de muerte por tumores malignos ginecológicos. Más del 75% de las mujeres presentan con enfermedad localmente avanzada o diseminada, por lo general se caracteriza por una invasión gradual de los órganos circundantes y, en los casos de la etapa alta, de la cavidad peritoneal. Survival ha cambiado poco desde la década de 1980 a pesar de los nuevos medicamentos quimioterapéuticos. La tasa de supervivencia de las tres cuartas partes de los pacientes que presentan enfermedad metastásica generalizada es sólo alrededor del 20% [1].
Este pobre pronóstico resultados globales de la falta de los primeros síntomas y el diagnóstico precoz, el tratamiento ineficaz para la enfermedad avanzada, resistencia a quimioterapias a base de platino y de comprensión limitada de los eventos de iniciación de primeros y primeras etapas de desarrollo del cáncer de ovario. Un gran reto sigue siendo la identificación de las vías oncogénicas de cáncer de ovario para ayudar en el diagnóstico, como indicadores de pronóstico y como objetivos para nuevas estrategias terapéuticas [2]. Muchos grupos, incluido el nuestro, han utilizado las plataformas de descubrimiento de todo el genoma basadas en matrices para identificar la expresión de ARNm aberrante y la secuencia de ADN somáticamente adquiridas variantes o mutaciones para determinar los cambios moleculares que subyacen en el desarrollo del cáncer de ovario, como un primer paso para identificar marcadores moleculares con potencial utilidad clínica [3], [4].
Utilizando esta tecnología, los miembros de la vía de señalización Wnt han sido implicados en la carcinogénesis de ovario, como teniendo el potencial para objetivos de diagnóstico, pronóstico y terapéuticas [5], [6]. La vía de señalización Wnt está altamente conservada a lo largo de los animales y media una variedad de funciones celulares, incluyendo la polaridad celular, los patrones de tejido, control de la proliferación y el desarrollo de neoplasia [7] celular, [8]. proteínas Wnt se secretan, las moléculas de señalización ricos de cisteína con estructuras conservadas. proteínas diecinueve Wnt han sido identificados y vinculados a las distintas etapas del desarrollo humano y la carcinogénesis, incluyendo los cánceres de mama, pulmón, colon, ovarios y la piel [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Las proteínas Wnt señal
a través de los receptores Frizzled
a través de una serie de diferentes pero interconectados vías de señalización, incluyendo la Wnt /Ca
2 +, β-catenina y de células planas vías de polaridad [15], [16] , [17]. En general, la familia Wnt está clasificado en base ligando y la implicación del receptor en la vía canónica /β-catenina y la β-catenina vía independiente /no canónica. la señalización de Wnt Curiosamente, no canónica puede antagonizar la señalización de Wnt canónica, y puede representar una nueva vía para apuntar cánceres impulsados por canónica Wnt de señalización [18]. los genes diana de la vía de señalización de Wnt /β-catenina /TCF han sido identificados como cruciales para la transformación de células epiteliales de ovario, y se upregulated en todos los cánceres de ovario endometrioide con defectos de la vía Wnt [19], [20]. Varios otros estudios apoyan esta observación, reportando la sobreexpresión de ciclina D1 en el cáncer de ovario que portan mutaciones β-catenina [21], [22], [23], [24].
proteínas relacionadas con frizzled secretadas (SFRPs) son inhibidores extracelulares de señalización de Wnt que actúan uniéndose directamente a ligandos Wnt [25] o a los receptores Frizzled [26]. receptores Frizzled se encuentran exclusivamente en la membrana plasmática, que se encuentra en la superficie de las células Wnt-respuesta. En los últimos años, numerosos informes han descrito silenciamiento epigenético de estos antagonistas canónica de señalización Wnt en diversos cánceres humanos, lo que sugiere que pueden funcionar como supresores de tumores [27]. En el cáncer de ovario,
SFRP1
fue el primer miembro de la familia informado de que se hypermethylated y silenciado en líneas celulares de cáncer de ovario y las muestras de pacientes, pero no en los controles normales, lo que sugiere un papel potencial como un supresor de tumores [28]. La hipermetilación del promotor de
SFRP2
y
SFRP5
fue posteriormente también se encuentran en el cáncer de ovario [29]. Un estudio reciente informó de la pérdida de
SFRP5
expresión que se asocia con la progresión de la carcinogénesis de ovario y de resistencia a la quimioterapia [29].
Como habíamos identificado previamente
SFRP4
para ser expresado de forma aberrante en el nivel de ARN en un gran experimento perfil transcripcional de los pacientes con cáncer de ovario (datos no publicados), aquí investigamos por primera vez SFRP4 ARN y la expresión de proteínas en 725 pacientes usando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR), Western -blot, inmunohistoquímica (IHC) y la captura ligado a enzimas (ELISA) en cultivos primarios de células de ovario, líneas, ascitis, tejidos y plasma.
Métodos
paciente clínico-cohorte
La aprobación ética y el consentimiento informado por escrito se le concedió en tres sitios diferentes en Suiza, Alemania y Australia: 1. Departamento de Ginecología, hospital Universitario de Zurich y el Departamento de Ginecología y Obstetricia, Spital Limmattal, Zurich (SPUK, StV06 /2006, de VHS); 2. Departamento de Ginecología y Obstetricia de la Universidad de Schleswig-Holstein (Comité de Ética de la Universidad de Schleswig-Holstein, Campus Lübeck; a D. H.); y 3. Centro de Cáncer Ginecológico, Royal Hospital for Women, Sydney (HREC 08/09/17 /3,02, a V.H.S.). archivo de tejidos de 721 pacientes en la cohorte suiza con cánceres /trompas /normal, benignos y de ovario peritoneales o de endometrio se incluyeron en microarrays de tejidos (281 diagnósticos benignos, 440 cánceres), con la mayoría de los cánceres son de origen ovárico (69,8%; tabla 1). Hematoxilina & amp; Eosina (H & amp; E) manchadas secciones de cada muestra tanto de los suizos y las cohortes de Australia fueron revisados por un patólogo especializado en patología ginecológica (R. C. para Swiss cohorte; J. S. para la cohorte de Australia) y las áreas correspondientes a tejido tumoral /benigna marcada. biopsias de tejido de 1,0 o 2,0 mm se incorporaron en microarrays de tejidos de densidad media (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, EE.UU.). Cada paciente fue representado por dos núcleos de la muestra desde diferentes áreas del tumor. Las secciones de cada matriz eran H & amp; E tiñeron para confirmar la inclusión del tejido seleccionado en cada núcleo, y los pacientes con histologías poco claras o mixtos excluidos. Todos los datos del paciente clínico-patológicos tales como el estadio FIGO, el grado, la enfermedad residual, la presencia de ascitis, pasado y enfermedades médicas presentes, los hallazgos ecográficos y datos de los resultados se almacenan en una base de datos especialmente diseñado en el local (Perov) basado en Microsoft Access (sin publicar; Microsoft , Seattle, EE.UU.). Los pacientes con antecedentes de cáncer o enfermedades inflamatorias /autoinmunes fueron excluidos de este estudio.
Nuestra cohorte de plasma se extendió por 52 pacientes (cohorte alemana) con el fin de facilitar un grupo de pacientes con endometriosis más grande. Las muestras de sangre se recogieron en tubos de sangre con EDTA (BD Vacutainer®, BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA) antes de la cirugía y almacenadas en hielo hasta su posterior procesamiento. Las muestras fueron procesadas a menos de 3 h por centrifugación de 3'000 g durante 10 min a 4 ° C y el plasma se almacenaron a -80 ° C.
Cultivo de células
La línea celular SKOV3 (cáncer de ovario seroso ) se cultivó en RPMI 1640 que contiene penicilina /estreptomicina (Pen /Strep), 10% de suero de ternera fetal (FCS) y L-glutamina (L-GLUT). TOV112D (cáncer de ovario endometrioide) y TOV21G (cáncer de ovario de células claras) se cultivaron en DMEM + Pen /Strep + 10% FCS + L-GLUT. células de ovario humano epiteliales normales de superficie (HOSE6-3) se cultivaron en medio 199 /MCDB 105 (01:02) que contenía Pen /Strep + 10% de FCS + L-GLUT. Todas las líneas celulares de cáncer se obtuvieron a partir de ATCC (www.atcc.org), HOSE6-3 fue un regalo del Instituto Garvan de Investigación Médica, Sydney, Australia.
cultivos primarios
Los cultivos primarios se recogieron durante la cirugía o varias veces durante la paracentesis requerida para la enfermedad progresiva quimioresistente (cohorte de Australia). Se tomaron cultivos de cáncer de ovario derivados durante paracentesis del sedimento celular generada después de la centrifugación de la ascitis a 4 ° C con 3'000 g. Se recogieron las células de las trompas de cultivo utilizando un citocepillo en la fimbria del tubo inmediatamente después de salpingo-ooforectomía bilateral. Las dos líneas celulares de trompas utilizadas en esta publicación se obtuvieron a partir de dos pacientes sometidos a cirugía de reducción de riesgos para
BRCA1
estado de mutación (1 Tubo) y un fuerte historial familiar de cáncer de ovario /mama (2 Tubo), donde informado por escrito se otorgó el consentimiento ético (HREC 08/09/17 /3,02, con VHS). Después de la recolección, los cultivos se almacenan inmediatamente en DMEM y se transfieren al laboratorio para el cultivo. Los cultivos primarios se cultivaron en DMEM + o bien penicilina /estreptomicina + 10% FCS + L-Superabundancia (líneas celulares de cáncer de ovario) o Medio 199 /MCDB 105 (01:02) que contiene penicilina /estreptomicina + 10% FCS + L-Superabundancia (normal líneas celulares de trompas) hasta la confluencia. El segundo paso de cada cultivo se utilizó para los experimentos.
RT-qPCR
RT-qPCR se realizó de acuerdo a las directrices de MIQE células fueron cultivadas en placas de 6 pocillos (NUNC, Thermo Fisher Scientific , Roskilde, Dinamarca) a una confluencia del 60%, se lavó con 1 x DPBS (Gibco, Invitrogen Australia Pty Ltd, Mulgrave) y ARN extraído (kit NucleoSpin total de ARNII, Macherey & amp; Nagel, Duren, Alemania). La concentración de ARN se midió utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca), la integridad confirmado por electroforesis en gel de agarosa (1,7% de gel de agarosa) y una relación de densidad óptica de 260/230 nm≈2.1 (2,0 a 2.2) y 260 /280≈2.0 (1/8 a 2/2) seleccionado como criterios de inclusión. QPCR se realizó en tres genes de referencia, así como el gen diana,
SFRP4
utilizando 500 ng de ARN transcrita inversa en un volumen total de 20 l (iScript transcripción inversa Supermix, Bio-Rad Laboratories Pty Ltd, Gladesville, Australia ). Los cebadores para genes de referencia fueron seleccionados debido a su expresión estable: proteína de unión a TATA [30] adelante 5'-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3 'y revertir 5'-CACATCACAGCTCCCCACCA-3'; beta-glucuronidasa [31] adelante 5'-AGCCAGTTCCTCATCAATGG-3 'y 5'-revertir GGTAGTGGCTGGTACGGAAA-3'; succinato deshidrogenasa, subunidad A [32] adelante 5'-TGGGAACAAGAGGGCATCTG-3 'y revertir 5'-CCACCACTGCATCAAATTCATG-3'; y
SFRP4
adelante 5'-ACACCCTCTTAAGCAGCACCAG-3 'y 5'-reverse AGGGTGGATGTCCTGGGAAGTAAG-3' [33] (Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, Australia). QPCR realiza en el Mx3005® Stratagene (Ciencias Integradas Pty Ltd, Chatswood, Australia) utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos (Bio-Rad Laboratories (Pacífico) Pty Ltd, Gladesville, Australia) y el kit de SYBR ™ SensiFAST lo-ROX (Bioline ( Aust) Pty Ltd, Alexandria, Australia) con bajo ROX como el colorante de referencia de fluorescencia. condiciones de reacción óptimas se obtuvieron por 2 × mezcla SensiFAST ™ SYBR, 400 nM de cebador sentido específico, 400 cebador antisentido específico nM, RNasa agua /libre de DNasa y 25 ng de ADNc de la plantilla hasta un volumen final de 20 l. Las amplificaciones se llevaron a cabo a partir de la activación de la enzima 30 seg a 95 ° C seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 5 segundos y recocido /extensión a 60 ° C durante 30 seg. Una curva de fusión se produce posteriormente a 65-95 ° C. Todas las muestras y los controles negativos fueron amplificados por triplicado y la media de las señales de fluorescencia normalizados de línea de base corregidas (DRN) obtenidos para los cálculos posteriores. ciclo de cuantificación (CQ) valores de nuestros genes de referencia se combinaron en una media geométrica para cada muestra [32] y restan de
SFRP4
expresión: ΔCq = Cq
SFRP4
-Cq
Ref. Para cuantificar relativamente
SFRP4
expresión (R) en todas las líneas celulares estudiadas, HOSE6-3 fue seleccionado como nuestro control y expresiones de otras líneas se calcula como una relación en comparación con HOSE6-3 de la siguiente manera: R = 2
-. [ΔCqSFRP4- ΔCqHOSE6-3]
El análisis de Western-blot
La ascitis se recogió durante la paracentesis de dos pacientes con cáncer de ovario en dos puntos de tiempo consecutivos, tres meses de diferencia. Tubulina se utilizó como control de carga para líneas celulares y anti-beta-2-microglobulina para los extractos de proteína ascitis de pacientes. Las alícuotas de 30 mg se combinaron con la muestra NuPAGE® LDS y tampones reductores (Invitrogen Australia Pty Ltd, Mulgrave) y se hierve antes de cargar en dodecilsulfato de sodio (SDS) poliacrilamida geles. Todos los geles se transfirieron eléctricamente a membranas de PVDF, antes de ser bloqueado por 1 h a RT en 0,01% TBS /Tween que contenía 3% de leche sin grasa en polvo (TBS /Tween con leche no grasa). Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C en TBS /Tween con leche no grasa y después se lavaron tres veces durante 5 minutos en TBS /Tween. La visualización de las proteínas se realizó
vía
la adición de un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (HRP), que se incubó durante 1 h a TA en TBS /Tween con leche no grasa. Las membranas se lavaron tres veces durante 10 min en TBS-Tween, se incubaron en ECL y desarrollados con Hyperfilm. De exploración y cuantificación de las intensidades de señal se ha realizado mediante un densitómetro Bio-Rad GS-800 con un software Cantidad (Hercules, CA, EE.UU.). Los anticuerpos se utilizaron a las siguientes diluciones: SFRP4 (Abnova,#6424-A01): 1:1'000, que se activa β-catenina (Millipore,#05-665) 1:1'000, β-catenina (Santa Cruz Biotechnology,#SC-7963), GSK3 (Sigma,#G7914) 1:1'000, anti-beta-2-microglobulina (Sigma,#WH0000567M1, 1:1'000). Todos los anticuerpos secundarios eran de Dako (Dako Australia Pty Ltd, Botánica, Australia) y se utilizaron a las siguientes diluciones: cabra anti-conejo, 1:5'000 y de cabra anti-ratón, 1:5'000
la inmunohistoquímica
Para la detección de la expresión SFRP4 en diversos tejidos, las diapositivas de microarrays de tejidos fueron analizados utilizando el sistema de tinción automatizado Ventana Benchmark (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, EE.UU.). Para la recuperación de antígenos, las diapositivas se calienta la solución de acondicionamiento celular durante 1 h (CC1; búfer basado en Tris con un pH ligeramente alcalino) usando un protocolo estándar. Las láminas fueron incubadas durante 1 hora con el anticuerpo anti-humano SFRP4 policlonal de ratón primaria (1:30; Abnova, Taipeh, Taiwán). La detección se llevó a cabo utilizando el sistema UView HRP (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, EE.UU.). Los controles negativos omite el anticuerpo primario, y un tejido de control positivo y negativo para cada anticuerpo se identificó a partir de datos de transferencia de Northern electrónico o la literatura publicada. Contratinción se realizó con hematoxilina y alcohol ácido al 1%. La inmunotinción se anotó como el porcentaje y la intensidad de expresión SFRP4 en varios compartimentos celulares (membrana, citoplasma, núcleo). La puntuación se evaluaron de forma independiente por dos investigadores y las discrepancias se resolvieron por consenso. SFRP4 expresión de todos los núcleos de un paciente se promedió.
ELISA
Las concentraciones séricas de sFRP4 se determinaron por un emparedado de desarrollo propio ELISA. Inmunoplacas (96 pocillos NUNC MaxiSorp; Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con un anticuerpo policlonal de captura de ratón generado contra una proteína humana recombinante SFRP4 parcial (# H00006424-A01, Abnova, la ciudad de Taipei, Taiwán) y se diluyeron 1:250 en tampón fosfato 0,1 M pH 7,2. Recubrimiento y la incubación se llevaron a cabo durante la noche a 4 ° C. La proteína recombinante, primaria y secundaria de anticuerpos se diluyeron en PBS y las placas se lavaron tres veces con 0,05% (v /v) de Tween 20 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza). Las placas se bloquearon con PBS que contenía 5% (w /v) de leche en polvo disponible comercial estándar durante 40 min a 37 ° C y se lavaron tres veces. Tras el bloqueo de los sitios de unión no específica de una curva estándar fue desarrollado mediante el uso de la proteína recombinante SFRP4 (# H00006424-Q01, Abnova, la ciudad de Taipei, Taiwán) que van desde 3'200 ng /ml a 12,5 ng /ml. muestras de plasma no diluidas se incubaron por duplicado durante 1 h a TA. SFRP4 unido se detectó usando anticuerpo de conejo policlonal primario a SFRP4 humano a TA durante 60 min (Dr. R. Friis, Universidad de Berna, Suiza). Las placas se lavaron tres veces seguido de la incubación con anticuerpo anti-ratón policlonal secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante de conejo (1:1'000, Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante 60 min a TA. Después de cinco etapas de lavado, cromógeno TMB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza) se aplicó como un sustrato y la reacción de la peroxidasa se detuvieron en 30 min por un volumen igual de ácido sulfúrico 2 M. Se midió la densidad óptica utilizando un lector de ELISA 450 nm (Tecan Spectrafluor Plus, Tecan, Mannedorf, Suiza).
El análisis estadístico
Mientras que la expresión de proteínas en los tejidos SFRP4 se cuantificó inicialmente como citoplásmica, la membrana y tinción nuclear, los números eran a menudo demasiado bajo para otros análisis estadísticos de los subgrupos histológicos individuales. Por lo tanto, la expresión SFRP4 se combinó, independiente de la localización de la tinción, y fue llamado en general "expresión SFRP4" (unidades arbitrarias). SFRP4 expresión tanto en el tejido y plasma fue descrito inicialmente utilizando diagramas de caja para diversas agrupaciones de diagnóstico. Un diagrama cuantil normal para la expresión SFRP4 en el plasma era indicativo de asimetría positiva de hacer cualquier análisis posteriores que requieren un supuesto de distribución normal cuestionable. Sin embargo, la estabilización de la varianza de la transformación logarítmica mejorado el tema. Las diferencias en la expresión SFRP4 entre los grupos de diagnóstico se evaluó a través de una serie de modelos lineales generales, junto con un ajuste de Bonferroni para comparaciones por pares. Las posibles asociaciones entre la expresión SFRP4 y los parámetros clínicos se evaluó mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Enfermedad y la supervivencia específica y la supervivencia libre de recaída para la expresión de SFRP4 se describieron mediante curvas de Kaplan-Meier y la significación estadística se determinó mediante regresión de Cox mediante el cálculo de los coeficientes de riesgo no ajustados y ajustados. modelos de Cox ajustados incluyen categorías de edad (≤60, & gt; 60), el grado del tumor (1-2, 3), etapa FIGO cáncer (I-II, III-IV) y la enfermedad residual (& lt; 10 mm, ≥10 mm) . Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los análisis de datos se generaron utilizando el software SAS (v9.2, Cary, NC, EE.UU.).
Resultados
La pérdida de expresión se correlaciona con SFRP4 fenotipo agresivo
SFRP4
fue altamente expresado en cultivos primarios de trompas en comparación con la línea celular epitelial de la superficie ovárica normal HOSE6-3 y fue particularmente alta en el paciente con la mutación BRCA (tubo 1) en comparación con los pacientes con historia familiar positiva de cáncer de mama /cáncer de ovario (tubo 2; Figura 1 A). Mientras que una célula clara y línea celular de cáncer de ovario endometrioide (TOV21D, TOV 112D, respectivamente) expresado
SFRP4
en niveles similares a uno de los controles de trompas, la línea celular de cáncer de ovario seroso indiferenciado (SKOV3) muestran niveles muy bajos de
SFRP4 gratis (Figura 1 A). entonces la expresión SFRP4 se midió a nivel de proteínas en diversas líneas celulares de cáncer de ovario y saludables a través de Western-blot. SFRP4 expresión se comparó con su clave de aguas abajo reguladores activan y β-catenina total. HOSE6-3 se comparó a varias líneas celulares de cáncer de ovario de diferentes histotypes y la diferenciación celular. SFRP4 expresión se pierde en todas las líneas celulares de cáncer en comparación con HOSE6-3 (Figura 1 B). Curiosamente, TOV112D, la línea celular de cáncer de ovario endometrioide, expresó altos niveles tanto de β-catenina activa y total, la interrupción constante de señalización Wnt conocido en el cáncer endometrioide (Figura 1 B) [19]. a continuación, líquido ascítico recogido durante resistencia a la quimioterapia progresiva se analizó por su expresión de SFRP4 y objetivos de abajo como una medida de la progresión en el tiempo. Uso de ascitis en dos puntos de tiempo consecutivos a partir de dos pacientes con cáncer con supuestamente diferente agresividad (Pt 1 mixta G1 cáncer de ovario, Pt 2 serosa G3 cáncer peritoneal), estos experimentos mostraron una reducción de la expresión de proteínas SFRP4 durante la enfermedad quimiorresistente progresiva (Figura 1 C, D ). En paralelo con disminución SFRP4, también se redujeron los niveles del regulador de señalización Wnt aguas abajo GSK3, mientras activado β-catenina aumentó, lo que sugiere que la señalización de Wnt se activa de hecho en estos pacientes.
Pérdida de
SFRP4
expresión a partir de líneas de células epiteliales primarias de trompas hacia líneas celulares de cáncer de ovario se muestra en diversos parámetros experimentales. fluorescencia (A) Hemos aplicado basa RT-qPCR para investigar
SFRP4
la expresión génica en pacientes sanos () trompas primarios y líneas celulares inmortalizadas. HOSE6-3 fue seleccionado como el control y expresiones de otras líneas celulares se calcularon como una relación en comparación con HOSE6-3: R = 2
- [ΔCq
SFRP4 CD - ΔCqHOSE6-3]. (B) SFRP4 y de los objetivos activado β-catenina (ABC), β-catenina y GSK3 β se midieron por Western-blot en varias líneas celulares (HOSE6-3, TOV21G (células claras, Tipo I cáncer de ovario), TOV112D ( endometrioide) y SKOV3 (serosa) Tipo II cánceres de ovario), así como en (C) ascitis muestras de pacientes de alto grado seroso de ovario cáncer con quimio-resistencia, recogidos en dos momentos consecutivos durante la progresión de la enfermedad (TP, punto de tiempo mostrado como Western-blot ; B2M, beta-2-microglobulina se utilizó como control de carga). (D) Resultados para SFRP4, activado β-catenina (ABC), β-catenina, β GSK3 se presentan cuantitativamente utilizando análisis densitométrico de un experimento en muestras de ascitis de pacientes.
Correlación de la expresión tejido SFRP4 con diversos parámetros clinicopathological
entonces localización SFRP4 se midió a nivel de proteínas, debido a su función propuesta en la membrana, citoplasma y, ocasionalmente, también en el núcleo de las células (Figura 2) mediante IHC en una gran cohorte de 721 pacientes en microarrays de tejidos relacionados con extensos datos de seguimiento (Tabla 1). tinción membranosa podría ser identificado en el límite célula-célula y en la membrana apical, que es coherente con su función secretora sugerida. Nuestra cohorte de 281 pacientes de control incorporado que estaban sanos o tenían condiciones benignas, como la endometriosis o cistadenomas /-fibromas. El grupo de cáncer también consistió en 440 pacientes con tumores borderline o cánceres invasivos de ovario en su mayoría (69,8%), pero también de endometrio (11,3%) y otros orígenes (18,9%). La edad media al diagnóstico fue de 57,1 años (19-88 años) para toda la cohorte, con la media del grupo de control es cinco años menor que la cohorte de cáncer (53,7
vs.
58,9 años). Nuestra amplia base de datos incorpora los datos de seguimiento de un periodo máximo de 29 años (media de ambas cohortes 48,4 meses (1-348 meses)).
IHC demuestra la expresión de proteínas SFRP4 representante en dos ampliaciones (10 × columna de la izquierda , × columna 40 a la derecha) en los tejidos normales (epitelio ovárico superficie (a) y el epitelio de trompas (B)) y diversos tipos de cánceres de ovario (endometrioide (C), serosa (D) y de células claras (e)).
SFRP4 se expresó positivamente en el tejido en 296 de 721 tejidos del paciente (41,1%) y en 128 de 142 muestras de plasma (90,1%). Dentro de la cohorte de cáncer, 279 pacientes (86,4%) tenían tumores de alto grado (grado 3) y 221 pacientes (55,3%) presentaron avanzados (FIGO III /IV) enfermedad en estadio. La tasa de mortalidad 5 años en toda la cohorte de cáncer /Tipo I /Tipo II era 29,5 /20,6 /41,3%, respectivamente. La tasa de recaída de cinco años en los mismos subgrupos de cohorte fue de 20,5 /15,3 /27,5%, respectivamente, lo que refleja una cohorte representativa del cáncer.
Las posibles asociaciones entre la expresión SFRP4 determinada tanto en tejidos y plasma, con parámetros clínico deriva de nuestra base de datos en la empresa clinicopatológica (base de datos Perov; Acceso (Microsoft, Seattle EE.UU.)) se evaluó mediante el coeficiente de correlación de Pearson, r. parámetros clínico que eran accesibles dentro de nuestra cohorte incluyen abortos, la edad al momento del diagnóstico, índice de masa corporal, los niveles de CA125, CA72-4 niveles, niveles de HE4, grado y estadio de los cánceres, enfermedad residual, ascitis el momento del diagnóstico, el tamaño y la bilateralidad de los tumores de ovario, el rendimiento estado al momento del diagnóstico, la duración del seguimiento, específica de la enfermedad y la supervivencia libre de recaída, la quimioterapia de platino, anticonceptivos o de reemplazo hormonal terapias orales, los embarazos /partos, la edad de la menarquia y la menopausia, la presencia de acné, ovarios poliquísticos, el exceso de vello, la infertilidad , las infecciones, la diabetes, la hipertensión, la ingesta de alcohol /drogas, el tabaquismo, la ingesta de fármacos no esteroideos, antecedentes de hospitalizaciones, enfermedades de mama, endometriosis, fibromas, quistes ováricos, y antecedentes de cáncer o cánceres familiares.
la correlación sólo moderadamente fuerte que se encuentra para la expresión SFRP4 tanto en el tejido y plasma se detectó en el caso de ascitis que están presentes en el primer diagnóstico (SFRP4 IHC: r = 0,55, p = 0,01; SFRP4 ELISA: r = -0,60, p = 0,03 ). Otra correlación moderadamente fuerte estuvo presente para la lactancia materna, cuando correlacionada con la expresión de plasma SFRP4 (r = -0,79; p = 0,06). Sin embargo, esto es de importancia límite como el tamaño de la muestra para la lactancia materna era más bien pequeño. Se encontraron correlaciones débiles para el IMC (IHC SFRP4: r = 0,19, p = 0,003) y el nuevo marcador tumoral HE4 (SFRP4 ELISA: r = -0.25, p = 0,02) [34]. Una relación marginalmente significativa podría ser detectada por la historia pasada de las operaciones ginecológicas (IHC: p = 0,038, ELISA: p = 0,099), la terapia de reemplazo hormonal (ELISA: p = 0,097) y la ingesta de alcohol. (IHC: p = 0,098)
SFRP4 se pierde cada vez más durante la transformación maligna
como se habría previsto de su supuesta función, expresión SFRP4 presentó especialmente en lo que la membrana citoplasmática y la tinción. De todos los tejidos examinados, sólo el extremo fimbrial de la trompa de Falopio expresó tinción SFRP4 nuclear, que fue un hallazgo inesperado en lugar (Figura 2 B). epitelio superficial del ovario, que fue hasta hace poco propuso ser el lugar de origen uniforme para la mayoría de los cánceres de ovario, muestra sólo una mínima tinción citoplasmática y sin membrana, como fue el caso de los quistes de inclusión, la ubicación de cambios de metaplasia dentro del ovario. La expresión SFRP4 más alto dentro de todos los tejidos estudiados se encontró en el epitelio de las trompas, lo cual es consistente con nuestros hallazgos a nivel de ARN en cultivos primarios de trompas (Figura 1 A). Las nuevas propuestas de los cánceres de tipo II se cree cada vez más a tener su origen en el extremo fimbrial de la trompa de Falopio, que debe ser entonces más bien el control normal para la mayoría de tipos de cáncer (38). De hecho, encontramos una disminución en la expresión SFRP4 acumulada en el epitelio de las trompas, los tejidos benignos (incluyendo el epitelio superficial del ovario y quistes de inclusión), la endometriosis a límite tumores y cánceres (Figura 3.1 A, B), de nuevo en coherencia con la tendencia que encontramos por RT -qPCR en líneas celulares (Figura 1 a). La pérdida de expresión SFRP4 de benigno a cáncer fue estadísticamente significativa tanto cuando se mide como expresión en la membrana por sí sola (p & lt; 0,0001 global, la figura 3.2; benigna
vs
cáncer, p = 0,07;. Borderline
vs.
cáncer, p & lt; 0,0001) y cuando la membrana, citoplasma y la expresión nuclear se midieron en combinación (p = 0,0004 en general, la Figura 3.1 a; benigna
vs
cáncer, p = 0,039;. Borderline
vs.
cáncer, p = 0,002). Mientras que una subdivisión de la tinción de membrana era difícil de medir debido a los pequeños tamaños de muestra en tejidos de la membrana que expresan, la expresión más alta en el grupo benigno para la expresión total de SFRP4 estaba en el epitelio de las trompas, seguido de la endometriosis y la más baja en el epitelio superficial del ovario y la inclusión quistes (Figura 3.1 B; Tubo vs. OSE, p & lt; 0,0001; Tubo vs. endometriosis, p = 0,014).
Boxplots que representan la expresión SFRP4 acumulativa (unidades arbitrarias) en el citoplasma, la membrana y el núcleo (expresión SFRP4 en