Extracto
Antecedentes
miR-26a juega un importante papel en la tumorigénesis, ya sea como un supresor de tumores o como un miARN oncogénicos, dependiendo de diferentes tipos de tumores. Sin embargo, la función de miR-26a en el cáncer de páncreas no ha sido claramente dilucidado. El presente estudio fue diseñado para determinar las funciones de miR-26a en el cáncer de páncreas y su asociación con la supervivencia de pacientes con cáncer de páncreas.
Métodos
La expresión de miR-26a se examinó en 15 pares de adenocarcinoma del conducto pancreático (PDAC) y sus tejidos pancreáticos benignos adyacentes (ABPT), por QRT-PCR. Los resultados fueron confirmados por
in situ
hibridación utilizando dos paneles de 106 PDAC y su microarray ABPT. Se determinó la asociación de la expresión de miR-26a con la supervivencia global. La distribución del ciclo proliferación y celular de las células Panc-1, transfectadas con imita el miR-26a o un inhibidor de miR-26a Capan-2, SW-1990 y, se evaluaron usando el Cell Counting Kit-8 de ensayo y citometría de flujo, respectivamente. La tumorigenicidad de células se evaluó a través de experimentos de xenoinjerto murino. Ciclina D2, E2, EZH2 y PCNA niveles fueron analizados por Western blot e inmunohistoquímica.
Resultados
miR-26a se expresó en el citoplasma de las células epiteliales ductales pancreáticas, mientras que su expresión fue significativamente downregulated en los tejidos PDAC en comparación con la de ABPT. Los pacientes con baja expresión de miR-26a tuvieron una supervivencia significativamente menor que aquellos con alta expresión de miR-26a. El
in vitro
y
in vivo
ensayos mostraron que la sobreexpresión de miR-26a resultó en la detención del ciclo celular, inhibe la proliferación celular, y la disminución del crecimiento tumoral, que se asoció con la ciclina E2 regulación a la baja.
Conclusiones
miR-26a es un supresor importante del carcinoma ductal pancreático, y puede llegar a ser un factor pronóstico novedoso y diana terapéutica para el tratamiento del cáncer de páncreas
Visto:. Deng J, Él M, L Chen, Chen C, Zheng J, Cai Z (2013) La pérdida de miR-26a-mediada post-transcripcional regulación de la ciclina E2 en la proliferación de células del cáncer pancreático y disminución de la supervivencia del paciente. PLoS ONE 8 (10): e76450. doi: 10.1371 /journal.pone.0076450
Editor: Vincenzo Coppola, Universidad Estatal de Ohio Comprehensive Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de noviembre de 2012; Aceptado: 27 Agosto 2013; Publicado: 8 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Deng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Proyecto Nº 81.172.077) y la red de biobancos de Shanghai de fondo de tejido tumoral humana común (Proyecto N 12DZ2295102). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas, adenocarcinoma de páncreas particularmente conducto (PDAC), es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo. Con una mediana de supervivencia de menos de 6 meses y una tasa de supervivencia a 5 años promedio de menos de 5%, la tasa de mortalidad, incidencia de pacientes con cáncer de páncreas es de aproximadamente 99%, con muy mal pronóstico [1], [2] . Por lo tanto, los mecanismos moleculares implicados en el proceso de transformación maligna del tumor, incluyendo el papel de los microRNAs (miRNAs), deben entenderse para mejorar el diagnóstico y el manejo del cáncer de páncreas [3], [4].
miRNAs son naturalmente que ocurre, pequeños RNAs no codificantes, de cadena sencilla, que median la expresión de genes a nivel post-transcripcional y traduccional en plantas y animales [5], [6]. Estas moléculas juegan papeles críticos en cánceres humanos tales como cáncer de páncreas [7], [8], así como en el comportamiento de cáncer, incluyendo su proliferación, la invasión, la migración, la apoptosis y la resistencia a los medicamentos. La red funcional miRNA de cáncer está relacionado con varios aspectos de la patogénesis del tumor [9]. Esta red puede ser utilizada para evaluar el diagnóstico y pronóstico de cáncer, así como para evaluar posibles opciones terapéuticas.
miR-26a es un supresor de tumor demostrado que está regulado por disminución de manera significativa en el carcinoma hepatocelular (HCC) [10]. Disminución de los niveles de miR-26a se han asociado con un mal pronóstico; estos niveles son predictivos de la respuesta terapéutica de pacientes con HCC al interferón-α. Además, la sobreexpresión de miR-26a se ha correlacionado con la regresión tumoral significativa, lo que indica que la reintroducción de miR-26a en pacientes con cáncer puede ser una estrategia de tratamiento eficaz [11]. Nuestro estudio anterior mostró que la sobreexpresión de miR-26a específico de tumor, impulsado por un promotor dual hAFP-de TERT, disminución de la viabilidad de células tumorales en HCC mediante la regulación de la expresión del receptor de estrógeno (ER) -α, receptor de progesterona (PR) , p53, ciclina D2, E2 y [12]. Sin embargo, aún se desconoce la relación exacta entre el miR-26a y cáncer de páncreas.
En el presente estudio, se examinaron los niveles de expresión de miR-26a en los tejidos humanos PDAC. Se determinó la significación clínica de regulación a la baja miR-26a y sus papeles en el crecimiento celular y la distribución del ciclo celular. Además, se utilizó un modelo murino para investigar el papel potencial de miR-26a en la tumorigénesis pancreática. Nuestros resultados proporcionan información básica para comprender mejor la patogénesis del cáncer de páncreas y sus posibles estrategias terapéuticas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio se realizó de acuerdo con el Helsinki directrices para los estudios de sujetos humanos y fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Segunda Universidad médica Militar, Shanghai, china. firmado el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes en el estudio para la recogida y análisis de muestras. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Segunda Universidad Médica Militar.
Pacientes y muestras de tejidos
Los datos sobre pacientes con PDAC se recuperaron más de un 3 años periodo (enero 2008-diciembre 2010), del Departamento de Patología de archivos del hospital Changhai, Segunda Universidad médica Militar en Shanghai, china y la Red de Biobancos de Shanghai de tejido tumoral humano común. Todos los pacientes fueron tratados con cirugía, y en total, se incluyeron 106 pares de muestras de PDAC y su ABPT. Además, otros 15 pares de PDAC y sus muestras ABPT se obtuvieron de los pacientes durante las resecciones quirúrgicas y almacenadas en nitrógeno líquido. Las características de los pacientes, presentación clínica, estadificación, hallazgos de laboratorio, tratamiento, la respuesta objetiva, supervivencia, y otra información relevante se obtuvieron del sistema de información hospitalaria. Los pacientes fueron evaluados mediante métodos estándar, incluyendo su historia, el examen físico y pruebas bioquímicas-hematológicas. Se utilizó el sistema de estadificación TNM para determinar el estado de la enfermedad del paciente.
Análisis morfológico y construcción de los microarrays de tejidos
Todas las muestras se obtuvieron por medio de cirugía, se fijaron en formalina y embebidos en parafina. Secciones de espesor 4-micras se tiñeron con hematoxilina y eosina antes de ser evaluadas por tres patólogos para las características morfológicas de cáncer de páncreas, de acuerdo con la clasificación de la Organización Mundial de la Salud del sistema digestivo [13]. microarrays de tejidos (TMA) se construyeron como se describe anteriormente [14]; cada uno de microarrays contenía dos paneles de 106 PDAC y su ABPT que fueron dispuestos en núcleos mm de diámetro 2.0.
transcripción inversa-reacción y la PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR)
En total , se utilizaron 15 pares de PDAC congelados y sus muestras ABPT (macro-diseccionado) para QRT-PCR según el protocolo del Invitrogen. U6 se utilizó como control endógeno para normalizar la cantidad de ARN total en cada muestra. QRT-PCR se realizó por triplicado, con controles nontemplate. La expresión relativa se calculó basándose en el método comparativo Ct (2
-ΔΔ
Ct
) [12]. El primer secuencias se enumeran en la Tabla S1
ácido nucleico miRCURY LNA microARN Detección
La hibridación in situ
y Análisis de supervivencia
bloqueado (LNA) -.
In situ
hibridación (ISH) se realizó en PDAC TMA utilizando la respectiva miRCURY LNA ™ sondas contra has-miR-26a o tiene-miR-21 (como control positivo) (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca). Estas sondas se utilizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante, tal como se describe anteriormente [15]. detección colorimétrica se realizó mediante la incubación de las muestras durante 30 min utilizando una solución de sustrato-cromógeno, con 0,04% DAB (DAKO, Dinamarca) y 0,05% H
2O
2. Las secciones se counterstained con hematoxilina antes del examen usando un microscopio óptico (Leica, Alemania) [16].
Se evaluó semi-cuantitativamente los resultados de LNA-ISH. Sobre la base de la intensidad de la hibridación, las muestras se calificaron como "0" para el negativo; "1" para débilmente positivo; "2" para moderadamente positiva; y "3" para fuertemente positiva. El porcentaje de células epiteliales positivas se anotó como "0" para ≤10%; "1" para el 11% -25%; "2" para el 25% -50%; y "3" para ≥50%. Las puntuaciones de intensidad y porcentaje se suman para obtener la puntuación ISH final, que fue clasificado como "negativo" (& lt; 3) o (≥ 3) [17]
Los resultados "positivos" LNA-ISH para. fueron analizados los datos de tratamiento clínico de 106 pacientes de miR-26a o miR-21 y. La respuesta al tratamiento con quimioterapia y radioterapia, incluyendo las manifestaciones clínicas del paciente, la tomografía computarizada (TC), resonancia magnética (RM) y los niveles de CA19-9, fueron evaluados de forma objetiva. Por lo tanto, todos los pacientes incluidos en el estudio fueron evaluados por su respuesta al tratamiento, lo que fue calificado como "respuesta completa", "respuesta parcial", "enfermedad estable", "enfermedad progresiva", "muerte temprana de la enfermedad o toxicidad", y así sucesivamente.
ciclina D2, ciclina E2, y PCNA inmunoquímica en cáncer de páncreas tejidos
Las secciones se trataron previamente a 65 ° C durante 2 h, seguido de desparafinación graduada. La recuperación del antígeno se llevó a cabo antes de la incubación con los anticuerpos primarios de ciclina D2 (1:300 dilución; Millipore), ciclina E2 (1:300 dilución; Millipore), y el antígeno de células en proliferación nuclear (PCNA) (1:300 dilución; Dako) , durante la noche a 4 ° C, con IgG normal como control negativo. A partir de entonces, los portaobjetos se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario conjugado con HRP (DAKO); 1:100. la actividad de HRP se detectó usando un sistema líquido DAB + sustrato-cromógeno (DAKO). Por último, las secciones se counterstained con hematoxilina y fotografiada. Los resultados de inmunohistoquímica se evaluaron utilizando un método semicuantitativo, con las puntuaciones finales sobre la base de la intensidad y el porcentaje de células epiteliales positivas determinadas por su inmunoquímica; estos resultados se clasificaron como "negativo" (& lt; 3) o "positivo" (≥3) [17]. Los niveles de PCNA fue evaluado de acuerdo con el porcentaje de células epiteliales positivas como "0" para ≤5%; "1" para el 5% -25%; "2" para el 25% -50%; "3" para ≥50%. Las muestras se clasificaron en grupos con un "bajo índice de proliferación" (& lt; 2) o "alto índice proliferativo" (≥2) [13], [17]. Los resultados inmunohistoquímicos fueron luego analizados con datos de seguimiento.
Cell Cultura y
Las líneas celulares PDAC Capan-2, SW-1990, y Panc-1, para así (Grado 1) , moderado (grado 2), y mal (Grado 3) diferenció el cáncer de páncreas, respectivamente, se obtuvieron del Centro chino para el Type Culture Collection (Wuhan, china). Las células fueron cultivadas en medio esencial mínimo de Dulbecco (suplementado con suero bovino fetal al 10%) y se mantuvieron en un 5% de CO
2 atmósfera a 37 ° C en una incubadora.
Plásmidos y transfección celular
Las líneas celulares PDAC Capan-2, SW-1990, y Panc-1 fueron sembradas a 3 × 10
5 células por pocillo en placas de 12 pocillos, y se transfectaron con imita el miR-26a, inhibidores, o ciclina E2 siRNA (Dharmacon) a una concentración final de 100 nm utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
miR-26a sobreexpresión vector p-hTERT-miR-26a (pTM) y su vector de control p-hTERT (pT) se construyeron como se describe anteriormente [12]. Para generar líneas celulares estables, 4 × 10
5 células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos se transfectaron con 2 g de plásmidos (PTM o Pt) usando Lipofectamine 2000, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron los cultivos positivos con 800 mg /ml de G418 durante 2 semanas.
Análisis Western Blot
Las células se lavaron con PBS helado, se lisaron, y se suspendieron en un tampón de lisis (Promega). El extracto de proteína total resultante se separó en un 12% en geles de SDS-PAGE. La inmunotransferencia se realizó en membranas de fluoruro de polivinilideno. Los anticuerpos primarios y secundarios utilizados fueron un anticuerpo de conejo anti-humana y una IgG anti-conejo de cabra, respectivamente (Sigma). La inmunodetección se realizó utilizando un sustrato quimioluminiscente basado-HRP [18]. Tabla S2 se enumeran los anticuerpos utilizados en este estudio.
Proliferación celular y el ciclo celular Los ensayos
El potencial de proliferación de las células se analizaron de acuerdo con el protocolo del Cell Counting Kit-8 (CCK-8 ) ensayo (Dojindo, Japón). se tripsinizaron las células, se lavaron dos veces con PBS, se recogió por centrifugación, se fijaron en 70% de etanol frío, se incubaron con yoduro de propidio, y se analizaron por fluorescencia de células activadas por la clasificación (Miltenyi, Alemania).
En vivo
Tumorigénesis Ensayo
células SW-1990 de PDAC moderadamente diferenciado fueron transfectadas establemente con pTM (p-hTERT-miR-26a) o pt (control vectorial). Se recogieron las células transfectadas, se suspendió en 200 l de PBS (1 × 10
7 células), y se inyectaron por vía subcutánea, en 4 semanas de edad de sexo masculino ratones BALB /c desnudos (
n
= 8). Para evitar las diferencias preexistentes entre ratones individuales, tanto las líneas celulares estables (PTM o PT) fueron inyectados de forma individual en los flancos opuestos de la misma de ratón; células transfectadas con pTM se inyectaron en el flanco izquierdo, mientras que los controles (transfectadas con el vector pT) se inyectaron en el flanco derecho. Los ratones se mantuvieron en un entorno específico libre de patógenos durante 5 semanas y luego se sacrificaron. El volumen del tumor
V
se calculó usando su longitud
L
y anchura
W
, de acuerdo con la ecuación
V
= 0,4
LW
2. Los xenoinjertos de tumores de ratón se fijaron en formalina y embebidos en parafina para el análisis de inmunoquímica de la ciclina D2, E2, y PCNA.
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar ( DAKOTA DEL SUR). Las asociaciones de expresión de miR-26a con las características patológicas clínicas se analizaron mediante las pruebas de Chi-cuadrado o de Mann-Whitney. La curva de supervivencia se calculó utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank. Los grupos se compararon usando de Student
t-test
. El análisis de correlación se realizó mediante análisis de correlación de Pearson. Todos los valores de probabilidad se analizaron mediante una prueba de dos colas y consideraron significativas cuando
P Hotel & lt; 0,05. Los análisis se realizaron con el programa SPSS (versión 17.0) software (SPSS Inc., Chicago, EE.UU.).
Resultados
regulación a la baja de miR-26a en el cáncer de páncreas Los tejidos se asocia con una supervivencia
las características clínico-patológicas de 106 casos de PDAC se presentan en la Tabla 1. la mayoría de estos pacientes se encontraban en estadio II (70,8%), lo que indica que los resultados son importantes para los pacientes que todavía están resecable quirúrgicamente con la mejor oportunidad para una supervivencia a 5 años. QRT-PCR análisis demostró que la expresión de miR-26a fue significativamente menor en los tejidos PDAC que en los tejidos normales (
n =
15,
P
& lt; 0.05; Fig. 1A), que era más confirmado por el análisis de LNA-ISH de 106 casos de PDAC. LNA-ISH mostró que miR-26a estaba presente en el citoplasma de células epiteliales ductales pancreáticas (Figs. 1C y 1D). De acuerdo con la intensidad y el porcentaje de puntuaciones de los criterios de puntuación ISH [17], 44 de los 106 (41,5%) los tejidos de cáncer de páncreas y 84 de los 106 (79%) los tejidos normales adyacentes (ISH ≥3;
P
& lt; 0,001) fueron positivos para el miR-26a. expresión de miR-21 como control positivo se analizó en los mismos pacientes. miR-21 fue positiva en 99 de los 106 (93,4%) y los tejidos PDAC en 25 de los 106 (23,6%) los tejidos normales adyacentes, sobre la base de los criterios de puntuación ISH (figuras 1E y 1F;. ISH ≥3;
P
& lt; 0,01). Relación de las características clínicas con la expresión de miR-26a en los tejidos PDAC, según lo determinado por LNA-ISH, se presenta en la Tabla 2.
(A) nivel medio de expresión de miR-26a en muestras humanas PDAC (
n
= 15) y tejidos pancreáticos normales (
n
= 15). miARN abundancia se evaluó mediante qRT-PCR y normalizado a ARN U6. Los valores se presentan como la media ± S.D. (B) En general la supervivencia después de la resección del cáncer pancreático con el miR-26a-negativas frente a los grupos de miR-26a-positivos. El grupo de miR-26a-negativo tuvieron una supervivencia significativamente más corto que el grupo de miR-26a-positivo (
P = 0,029
). (C, D)
In situ
hibridación para miR-26a en las lesiones pancreáticas.
In situ
hibridación mostraron mucho más baja expresión de miR-26a en los tejidos PDAC (C) que en ABPT (D). El recuadro muestra el control negativo (sonda de secuencia codificado). La tinción citoplasmática en las células epiteliales ductales está en contraste con la tinción negativa con la sonda revueltos. (E, F)
In situ hibridación para
(control positivo) miR-21 en lesiones pancreáticas.
In situ
hibridación mostraron mucho más fuerte expresión de miR-21 en tejidos PDAC (E) que en ABPT (F). El recuadro muestra el control negativo (sonda de secuencia codificado). La tinción citoplasmática en las células tumorales está en contraste con la tinción negativa de la sonda revueltos. Aumento original, 100 ×.
Los datos de seguimiento obtenidos a partir de 73 de los 106 pacientes demostraron que un total de 18 pacientes fueron tratados con quimioterapia adyuvante de gemcitabina y oxaliplatino, mientras los 55 pacientes restantes no fueron tratados con quimioterapia o radioterapia. Entre los 73 pacientes que recibieron de seguimiento, 68 murieron, con 16 pacientes que reciben quimioterapia y 52 sin tratamiento adicional. Sin embargo, 5 de los 73 pacientes de seguimiento sobrevivieron. La supervivencia global fue medida específica para el cáncer; el tiempo medio de supervivencia fue de 8,7 meses en el grupo de miR-26a-negativo (& lt; 3;
n
= 43) y 12 meses en el grupo de miR-26a-positivo (≥3;
n
= 30). Las tasas de supervivencia de 1 y 3 años fueron del 39,5% y 0%, respectivamente, en el grupo de miR-26a-negativo, pero eran 50% y 6,3%, respectivamente, en el grupo de miR-26a-positivo. El análisis de supervivencia global reveló que el grupo de miR-26a-negativo tuvieron una supervivencia significativamente más corto que el grupo positivo (
P = 0,029
, Fig. 1B). La quimioterapia adyuvante no se asoció con la supervivencia de los pacientes con PDAC (
P = 0,417
). La asociación entre la expresión de miR-26a y otros parámetros (tales como la edad, el género, la ubicación de la masa tumoral, tamaño tumoral, la diferenciación de células tumorales, invasión neural, el número de ganglios linfáticos, metástasis a distancia) no fueron estadísticamente significativos (Tabla 2). El análisis de supervivencia multivariante (regresión de Cox) de los factores pronósticos clínicos convencionales y miR-26a afirmó que el miR-26a es un factor pronóstico independiente en el cáncer de páncreas (
P = 0,001
; IC del 95%, 0,185-0,650; Tabla 3).
ciclina D2, ciclina E2, y PCNA inmunoquímica en cáncer de páncreas los tejidos y su asociación con la supervivencia
las muestras de tejido immunostained reveló que tanto las células tumorales y epiteliales del conducto células de los tejidos pancreáticos benignos adyacentes no expresaban ciclina D2 (Figs. 2A y 2D). Sin embargo, la ciclina E2 muestra fuerte tinción positiva en las células tumorales (90/106) y células epiteliales de los conductos de los tejidos pancreáticos benignos adyacentes (76/106;
P
= 0,024;. Figs 2B y 2E). No hubo diferencia significativa en la tasa de supervivencia general entre los 73 pacientes de seguimiento que fueron positivos (
n =
61) o negativo (
n = página 12) para la ciclina E2 (
P
= 0,676; Fig. 2G). Los resultados presentados tinción PCNA positivas para las células tumorales (93/106) y para las células epiteliales del conducto de los tejidos pancreáticos benignos adyacentes (68/106;
P
& lt; 0,01). La fuerte tinción positiva de PCNA en los tejidos PDAC indicó una actividad proliferativa de células mayor en el cáncer de páncreas (Figs. 2C y 2F), en comparación con tinción negativa en los tejidos normales adyacentes. El análisis de supervivencia global reveló que los casos con un índice de PCNA alta proliferativa (
n
= 51) en los tejidos del PDAC tenían una supervivencia significativamente más corta que los casos con un bajo índice de proliferación PCNA (
n =
22;
P = 0,007
, la figura 2H).. Los pacientes con un índice de proliferación alta PCNA también eran ciclina E2 positivo.
Los tejidos tumorales PDAC (PDAC) fueron negativos para ciclina D2 (A) y fuertemente positiva para ciclina E2 (B), con un índice de proliferación alta PCNA (DO). Los tejidos pancreáticos benignos adyacentes (ABPT) fueron negativos para ciclina D2 fue (D), y positivo para la ciclina E2, como se observa en las células epiteliales ductales de ABPT (E). PCNA fue muy baja en los tejidos normales de páncreas (F). Las inserciones de A, B, y C muestran los controles negativos. El recuadro en D indica que la ciclina D2 es un control positivo de adenocarcinoma de pulmón. Aumento original, 200 ×. La supervivencia global después de la resección del cáncer pancreático con el cyclinE2 positivos frente a los grupos cyclinE2-negativos no fue significativa (
P = 0,676
) (G), mientras que la supervivencia global después de la resección del cáncer pancreático con el alto índice de proliferación PCNA frente grupos de bajo índice de proliferación PCNA tuvieron una supervivencia significativamente más corta (
P
= 0,007) (H).
un análisis de correlación para ambos miR-26a y la expresión de ciclina E2 (coeficiente de Pearson,
R
2
= 0,004) y para el miR-26a y la expresión de PCNA (
R
2
= 0,024), mostraron una relación significativa. Los gráficos de dispersión del análisis de correlación se presentan en la Figura S1.
miR-26a-expresión inhibió el crecimiento de células de cáncer pancreático por la regulación a la baja de la ciclina E2 y EZH2 Expresión
Para explorar el efecto de miR-26a en el crecimiento de células de cáncer de páncreas, las líneas celulares PDAC con diferentes grados Capan-2, SW-1990, y Panc-1 fueron transfectadas transitoriamente con un mímico miR-26a o inhibidor. El análisis de QRT-PCR mostró que la transcripción de miR-26a en el grupo de imitador fue significativamente mayor (4,44 veces en Capan-2, 3,45 veces en SW-1990, y 3,59 veces en Panc-1), mientras que la transcripción de miR-26a en el grupo de inhibidor fue significativamente menor (0,35 veces en Capan-2, 0,43 veces en SW-1990, y 0,44 veces en Panc-1), en comparación con las líneas de células de control (
P
& lt; 0,05;.. Figs 3A-3C)
el análisis qRT-PCR demostraron la transcripción de miR-26a en imita, inhibidor, y los grupos de control (a, B, C), y el expresión de la ciclina E2 en la ciclina E2 siRNA, el control de siRNA, y los grupos de control (D, e, F). La proliferación de líneas de células transfectadas transitoriamente con PDAC imita miR-26a, inhibidor de miR26a o ciclina E2 siRNA se analizó por el ensayo de proliferación de CCK-8 (G, H, I). La regulación de la ciclina E2 o EZH2 expresión de miR-26a se analizó mediante Western blot (J, K, L), y análisis de transferencia Western también confirmaron la eficiencia esperada de la ciclina E2 siRNA en tres líneas celulares PDAC (M, N, O) .
Para explorar el efecto de la ciclina E2 en el crecimiento de células de cáncer de páncreas, la ciclina E2 siRNA se transfectó en cada una de las tres líneas celulares PDAC, y la caída fue confirmada por análisis de QRT-PCR, que mostró que la expresión de la ciclina E2 en el grupo de siRNA-transfectadas de manera significativa se disminuyó en comparación con las células control (0,201 veces en Capan-2, 0,274 veces en SW-1990 y 0.327 veces en Panc-1) (Fig. 3D -3F).
Para determinar el papel de miR-26a en el crecimiento de células de cáncer de páncreas, el ensayo de proliferación de CCK-8 se llevó a cabo en Capan-2, SW-1990, y las células Panc-1 que fueron transfectadas transitoriamente con una mímica de miR-26a o inhibidor. Los resultados mostraron que miR-26a-imita inhibió el crecimiento de células tumorales, mientras que el miR26a-inhibidor promovió el crecimiento de células tumorales. Además, la ciclina E2 siRNA tenía un papel similar como el miR-26a-mímica en la inhibición de proliferación de células tumorales (Figs. 3G-3I).
miR-26a se informó de mediar directamente la ciclina E2 y ciclina funciones D2 en HCC [12] y el cáncer de mama [19]. La expresión de la proteína Polycomb EZH2 se incrementó en PDAC, que en consecuencia aumenta la proliferación celular y la quimiorresistencia [20]. Sin embargo, nuestros estudios mostraron que la ciclina D2 tinción era casi negativo en tejidos de cáncer de páncreas. Por lo tanto, la relación entre miR-26a y ciclina E2 o EZH2 se analizaron mediante transferencias Western. Los resultados revelaron que la ciclina E2 y EZH2 niveles eran tanto disminuido en las células imitan transfectadas miR-26a, pero se incrementaron en las células transfectadas con inhibidor de miR-26a (Figs. 3J-3L) en comparación con las células de control. análisis de transferencia Western confirmó la eficiencia esperada de la ciclina E2 siRNA en las tres líneas celulares PDAC (Figs. 3M-3O).
Posteriormente, se analizó la distribución del ciclo celular de la Capan-2, SW-1990, y células Panc-1 que fueron transfectadas con imita miR-26a o el inhibidor de miR-26a, así como los controles. Las células transfectadas con el imitador miR-26a acumulado en el G
1 fase, mientras que la población fase S disminuyeron. Sin embargo, se observó un resultado contrario en las células transfectadas con el inhibidor de miR-26a (Fig. 4). Estos resultados sugieren que la inhibición de proliferación de miR-26a se debió en parte a un arresto G
1-fase de las tres líneas celulares de cáncer de páncreas.
Las células fueron transfectadas con cualquiera imita el miR-26a o inhibidores. Los controles se dejaron sin tratar. D, H y L indican la distribución del ciclo celular estadística para Capan-2, SW-1990 y Panc-1, respectivamente.
Expresión ectópica de miR-26a inhibe el crecimiento del cáncer de páncreas en ratones desnudos
la
vivo
ensayo de tumorigénesis en reveló que el crecimiento del tumor fue significativamente más lenta en ratones desnudos inoculados con las células SW-1990 transfectadas con pTM, en comparación con ratones desnudos inoculados con el SW-transfectadas pT -1990 células (Fig. 5A). Este resultado fue confirmado por las mediciones del volumen del tumor en 5 semanas (Fig. 5B). El nivel de ciclina E2 fue mucho menor en los tejidos tumorales que sobreexpresan el miR-26a y la expresión de PCNA siguió un patrón similar. Ciclina D2 no se detectó en los tumores (figuras 5C-5H.)
(A) Los ratones desnudos fueron inoculados por vía subcutánea con células SW-1990 transfectadas con pTM (PTM: plásmido hTERT-miR-26a). O TE ( pT: plásmido de control hTERT), en sus flancos. La imagen puede no coincidir con tumores formados en 8 ratones. curvas (B) El crecimiento de los volúmenes tumorales. La gráfica es representativa del crecimiento del tumor, 5 semanas después de la inoculación. El volumen del tumor se calculó y todos los datos se muestran como la media ± S. D. (
n
= 8). (C-H) expresión de la ciclina D2, ciclina E2, y PCNA se midió por inmunohistoquímica en los tejidos de los ratones inoculados con células transfectadas pTM- SW-1990 o las células de control. Las inserciones en la figura C, E, y G indican un campo de control negativo. Las células de color marrón indican tinción positiva. Aumento original, 200 ×.
Discusión
La secuencia madura de miR-26a se observa en 3
p
23, que es una región cromosómica asociada con la frágil diversos cánceres humanos [21] - [23]. Aproximadamente la mitad de todos los miRNAs humanos se encuentran en regiones genómicas asociadas con el cáncer; por lo tanto, pueden funcionar como supresores de tumores o oncogénicos miRNAs, en función de sus objetivos [3] - [5]. Por lo tanto, miR-26a puede funcionar como un oncogén en gliomas pero sirve como un supresor de tumores en el cáncer de hígado [12], [23] - [26]. Sin embargo, hasta la fecha, existen informes limitados sobre el papel y la tumorigénesis de miR-26a en el cáncer de páncreas.
En el presente estudio, se encontró que la expresión de miR-26a se downregulated significativamente en comparación con los tejidos PDAC la de ABPT. Para explorar más a fondo los mecanismos moleculares de la promoción del crecimiento celular mediante la regulación a la baja de miR-26a en el tejido de cáncer de páncreas, se analizó el papel de la sobreexpresión de miR-26a o downexpression en la proliferación de células de cáncer de páncreas, el ciclo celular y el crecimiento tumoral ,. Nuestros datos demostraron que el nivel de expresión de miR-26a influye en la proliferación de las tres líneas celulares de diferentes PDAC-grados. los niveles de miR-26a se asociaron con G
1 detención en las células de cáncer de páncreas. Además, la sobreexpresión de miR-26a en células SW-1990 suprimió la tumorigénesis de páncreas en ratones desnudos, lo que sugiere que las funciones de miR-26a como un supresor tumoral en este tipo de cáncer.
La ciclina D2 y E2 ciclina son reguladores esenciales de la transición de fase G
1-a-S durante el ciclo celular. Estos ciclinas son de particular interés en el cáncer de páncreas. Kota [11] y Zhou [27] informó de que el miR-26a regula al alza directamente la expresión de la ciclina D2 y ciclina E2 ARNm en el CHC. Por lo tanto, ambos genes son posibles objetivos de miR-26a en el cáncer de páncreas. Por otro lado, los niveles de EZH2 se incrementaron en PDAC para promover la proliferación celular y la quimiorresistencia [20]. Por lo tanto, determinamos si el miR-26a podría regular el ciclo celular de cáncer de páncreas a través de sus genes diana, ciclina D2 y ciclina E2. Ciclina D2 no se detectó en las células tumorales y las células epiteliales del conducto de ABPT, mientras que la ciclina E2 se correlacionó positivamente con la expresión de miR-26a en el cáncer de páncreas. Ciclina E2 disminuyó con la regulación positiva de miR-26a en Capan-2, SW-1990, y las células Panc-1. Los efectos observados sobre la proliferación celular y la ciclina E2 expresión eran consistentes con los observados para EZH2 en células PDAC. Estos datos sugieren que la regulación por disminución miR-26a condujo a la regulación positiva de la ciclina E2 y EZH2, pero no de la ciclina D2, en los tejidos PDAC. Por lo tanto, el miR-26a downregulated contribuyó a la proliferación celular y la supervivencia de los pobres en el cáncer de páncreas. Estos resultados son consistentes con estudios en otros tumores, como el HCC, cáncer de mama, APN, y linfomas [12], [27] - [30]. La expresión alterada de miRNAs específicos en los tumores se informa, asociada con la metástasis del cáncer y mal pronóstico [29] - [32]. Heinzelmann et al., [33] detecta una firma de miRNA que distingue entre metastásico de células claras y carcinomas de células renales metastásicos. Un grupo de 12 miRNAs, incluyendo la familia let-7, miR-30c, y miR-26a, se encontró que la disminución de los tumores metastáticos primarios altamente agresivos.