Extracto
antecedentes
el objetivo de este estudio fue demostrar la anti-cáncer de la piel y el potencial quimiopreventivo de 1,1-bis (3'-indolil) -1- (p-clorofenil) metano (DIM-D) usando un modelo in vitro.
Métodos
In vitro la citotoxicidad de células y ensayos de viabilidad se realizaron en la línea celular de carcinoma epidermoide A431 humano y queratinocitos normales humanos epidérmico (NHEK), respectivamente, por tinción con cristal violeta. Inducción de la apoptosis en células A431 (DIM-D tratada) y las células NHEK pretratados con DIM-D (2 hr) antes de la irradiación UVB, se evaluaron. La acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS) en DIM-D pretratado células NHEK (2 hr) antes de la exposición a UVB también fue determinada. Se realizó inmunocitoquímica y Western blot para determinar la caspasa 3 y marcadores de daño de ADN escindidos en DIM-D tratada células A431 y en DIM-D pretratados células NHEK antes de la irradiación UVB.
Resultados
La valores de IC50 de DIM-D fueron 68,7 ± 7,3, 48,3 ± 10,1 y 11,5 ± 3,1 M mientras que para galato de epigalocatequina (EGCG) fueron 419,1 ± 8,3, 186,1 ± 5,2 y 56,7 ± 3,1 mM para los tratamientos 24, 48 y 72 hr, respectivamente. DIM-D exhibió una significativa (p & lt; 0,05) mayor inducción de la fragmentación del ADN en las células A431 en comparación con EGCG con la muerte celular por ciento de 38.9. Además, DIM-D indujo una mayor expresión en las células A431 en comparación con EGCG de la caspasa 3 escindida (3,0 veces frente a los cambios 2,4 veces), Nurr1 (2,7 veces frente a los cambios 1,7 veces) y NFkB (1,3 veces vs . cambios 1,1 veces). DIM-D también exhibió actividad quimiopreventivo en células NHEK irradiados con UVB de forma significativa (p & lt; 0,05) la reducción de la formación de ROS inducida por UVB y la apoptosis en comparación con EGCG. Además, DIM-D inducida por la expresión de Nurr1 pero redujo la expresión de 8-OHdG significativamente en células NHEK irradiados con UVB comparado con EGCG y UV solamente.
Conclusión
Nuestros resultados sugieren que DIM-D exhibe la transactivación dependiente de Nurr1 en la inducción de la apoptosis en células A431 y que protege a las células NHEK contra ROS formación y daño en el DNA inducido por UVB
Visto:. Boakye CHA, Doddapaneni R, Shah PP, Patel AR, Godugu C , Caja de seguridad S, et al. (2013) quimioprevención del cáncer de piel con 1,1-bis (3'-indolil) -1- (aromático) metano Analog través de la inducción de la receptor nuclear huérfano, NR4A2 (Nurr1). PLoS ONE 8 (8): e69519. doi: 10.1371 /journal.pone.0069519
Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Mayo, 2013; Aceptado: June 11, 2013; Publicado: 7 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Boakye et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Salud para Minorías y disparidades de Salud subvención P20 MD 006738-01 y SC-1 beca 5SC1CA161676-03 de los Institutos nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
incidencia de cáncer de piel ha ido en aumento y más de 2 millones de nuevos casos se diagnostican cada año en los Estados Unidos [1]. Se ha estimado que uno de cada cinco estadounidenses de raza blanca desarrollará cáncer de piel por lo menos una vez en el curso de su /su vida [2]. El melanoma es la forma más grave de cáncer de piel y representa el 5% de todos los casos de cáncer de piel en los Estados Unidos, es responsable de la mayoría de las muertes por cáncer de piel [3], [4], con un impacto estimado en $ 2.36 mil millones en 2010 [5]. Se espera que el aumento de la incidencia de cáncer de piel para continuar con el envejecimiento de la población, mayores cantidades de radiación UV lleguen a la superficie de la tierra debido al agotamiento de la capa de ozono, y el uso continuo de los dispositivos de bronceado [6], [7], [ ,,,0],8].
los estudios han demostrado que la exposición persistente a la luz solar es un factor de riesgo importante para el desarrollo tanto de cáncer de piel no melanoma (CPNM) y melanoma debido a los efectos perjudiciales de la radiación UVB que viole la capa epidérmica de la piel [ ,,,0],9], [10]. El inicio y la progresión de la carcinogénesis de la piel implica una compleja cascada de eventos celulares y moleculares que se derivan de la producción inicial de especies reactivas de oxígeno (ROS) por la radiación UVB [11], [12], [13] y los resultados en el daño del ADN de los queratinocitos y la mutación incluyendo la formación de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD). Los estudios han demostrado que también hay daño sustancial causado a los lípidos de la piel y de las proteínas a la exposición UVB [14], [15].
Muchos fitoquímicos y análogos sintéticos tienen la capacidad de invertir y /o reducir la aparición y la progresión de la carcinogénesis de la piel y la angiogénesis [16], [17]. Estos fitoquímicos son principalmente polifenoles, que incluyen pero no se limitan a silimarina, epigalocatequina 3-galato (EGCG), la curcumina, miricetina, quercetina y hesperitina. EGCG es un polifenol abundante presente en el extracto de té verde y es un flavonoide antioxidante potente que tiene el potencial quimiopreventivo [18]. EGCG puede inducir la detención del ciclo celular y la apoptosis en células de hepatoma mediante la inducción de p53 y apoptosis vía Fas /FasL, respectivamente [19]. La citotoxicidad de EGCG in vitro requiere concentraciones relativamente altas [20] que no se consiguen fácilmente en el suero y en ambas formulaciones orales y tópicos de EGCG exhiben una protección mínima contra el fotoenvejecimiento y las respuestas inflamatorias inducidas por UV en la piel [21], [22] , [23].
3,3 'diindolilmetano (DIM) (Fig. S1) es un producto natural derivado de indol-3-carbinol (I3C) que está presente en las verduras crucíferas como las coles de bruselas, brócoli y coliflor. DIM ha generado mucho interés en la investigación del cáncer debido a su baja toxicidad y los efectos citotóxicos sobre las células cancerosas in vitro y la inhibición del crecimiento del tumor in vivo [24]. Por ejemplo, DIM expresión inducida de inhibidores del ciclo celular, tales como p21 y p27 y las proteínas downregulated-ciclina incluyendo ciclina D1 y también disminución de la expresión de la supervivencia y las proteínas antiapoptóticas incluyendo survivin, bcl-2, bax y poli inducida (ADP-ribosa) polimerasa ( PARP) de escisión, la liberación del citocromo c mitocondrial y la escisión procaspasa [25], [26], [27]. Una serie de nuevos 1,1-bis sintéticos (3'-indolil) -1- (p-fenil sustituido) análogos de metano (C-DIMs), también son potentes agentes contra el cáncer [25], [28], [29] y sus actividades son dependientes de la estructura. Los derivados de p-t-butilfenilo y p-bifenilo activan los receptores γ proliferador de peroxisoma activados (PPAR), mientras que los p-fenilo y p-metoxifenil análogos no sustituidos activan el receptor huérfano NR4A1 (Nurr77 /TR3) [30]. Los estudios realizados en nuestro laboratorio han informado de un efecto sinérgico entre el 1,1-bis (3'-indolil) -1- (p-bifenilo) metano (DIM-C-pPhC6H5) y docetaxel en no pequeñas células de cáncer de pulmón de células a través de la inducción mejorada de PARP escindido, bax y N-cadherina y la inhibición de la fosfo-Akt, ciclina D1, survivina, NF-kB, MCL-1 y fosfo JNK2 [29], [31].
Un miembro del nervio factor de crecimiento IB Nurr1 (NR4A2) es otro receptor NR4A, que ha sido implicado en diversos procesos hormonales, fisiológicos y fisiopatológicos incluyendo cardiovascular, enfermedades neurológicas y metabólicas, la inflamación y la oncogénesis. Nurr1 juega un papel en la función cerebral y, por tanto, se ha relacionado con la enfermedad de Alzheimer, la esquizofrenia y la enfermedad de Parkinson [32]. Nurr1 es altamente expresado en Panc1 y Pan28 pancreático y algunas líneas celulares de cáncer de vejiga humanos [28], [33]. En este estudio, se expone la importancia de Nurr1 en el potencial quimiopreventivo de 1,1-bis (3'-indolil) -1- (p-clorofenil metano) (DIM-D) en el cáncer de piel con una piel de UVB in vitro inducida modelo de cáncer. DIM-D ha demostrado que induce transactivación y los resultados de nuestro estudio Nurr1 dependientes de sugerir un posible papel de DIM-D /Nurr1 en la quimioprevención del cáncer de piel.
Materiales y Métodos
1. Materiales
p-Sustituido análogos C-DIM (DIM-C-pPhCl; DIM-D), (DIM-C-pPhCN; DIM-B) y (C-DIM-pPhBr; DIM-C) se sintetizado como se describe [36]. EGCG se adquirió de Selleck Químicos (Houston, TX, EE.UU.). línea celular de carcinoma epidermoide humano A431 y queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK) se adquirieron de Invitrogen (Grand Island, NY, EE.UU.). Salina tamponada con fosfato (PBS) se adquirió de Invitrogen. El (Nurr 1) anticuerpo NR4A2 se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos dirigidos contra 8-hidroxi deguanosine (8-OHdG), CCAAT /-enhancer- proteína de unión a proteínas homólogas (CHOP), el factor nuclear kappa-luz-cadena-potenciador de las células B activadas (NF-kB) y se escindió de la caspasa 3 eran también obtenido de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA).
2. Líneas celulares y cultivos celulares
Las células A431 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma Aldrich, St Louis, MO) mezcla de nutrientes suplementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) de Invitrogen (Grand Island, NY ) y antibiótico-antimicótico mezcla que comprende penicilina (5000 U /ml), estreptomicina (0,1 mg /ml) y neomicina (0,2 mg /ml) de Sigma Aldrich (St Louis, MO, EE.UU.) a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2 y 95% de humedad relativa. Las células NHEK se mantuvieron en medio Epilife (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.), y eran sostenidos por cualquiera de suplemento de crecimiento epidérmico (EDGS) o suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (HKGS) de Invitrogen (Grand Island, NY) y la mezcla de antibiótico-antimicótico que comprende penicilina (5000 U /ml), estreptomicina (0,1 mg /ml) y neomicina (0,2 mg /ml) de Sigma Aldrich (St Louis, MO) a 37 ° C. Ambas líneas de células se cultivaron sub cuando aproximadamente el 80-90% de confluencia con 0,25% de tripsina-EDTA (Invitrogen; Grand Island, NY). Las células fueron cultivadas en 1,12 cm
2 0.4 micras de poro de membrana de policarbonato insertos en 12 mm × 12-transwell placas de soporte permeables (Corning, NY).
3.
In vitro Cell
la citotoxicidad y la viabilidad Ensayos
citotoxicidad de la célula y ensayos de viabilidad celular se realizaron en A431 y células NHEK, respectivamente, utilizando el ensayo de tinción con violeta cristal convencional. Las células A431 y NHEK dos estaban sembradas en placas de 96 pocillos (10
4 células /pocillo) y se incubaron durante la noche en 5% de CO
2 a 37 ° C. Las células A431 se trataron con el control de disolvente (DMSO) y diversas concentraciones de DIM-B, DIM-C y DIM-D y EGCG, mientras que las células NHEK se expusieron a la radiación UVB (150 J /m
2) 2 hr después del tratamiento y después se incubaron durante 24 horas en medio de crecimiento. Las células A431 en mezcla de fármaco y los medios se incubaron durante 24, 48 y 72 hr. Las células viables se fijaron con glutaraldehído y se tiñeron con cristal violeta durante 15 min a temperatura ambiente. El cristal violeta se lavó; el residuo solubilizado con fosfato de hidrógeno de sodio y se midió la absorbancia con un espectrofotómetro a la longitud de onda de 462 nm. La viabilidad de las células NHEK tratados con C-atenúa o EGCG se expresaron como porcentajes de la absorbancia de células de control, que se considera como 100% los valores viables y de CI50 se determinaron por la siguiente fórmula, [(50- kill más bajo) /(la más alta Kill - matanza más baja) * (la más alta conc -. conc más bajo)] + conc más bajo
4... TUNEL ensayo
células A431 se trataron con 34,4 M DIM-D (50 por ciento del valor IC50) y se incubaron durante 24 hr. Las células fueron lavadas con tampón PBS y se fijaron en formaldehído al 10% en lados microscópicas. El ApoTag Red
In Situ
kit® detección de apoptosis (Millipore, Billerica, MA) fue utilizado para la detección de la apoptosis, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se incubaron las células fijadas en solución de proteinasa K 20 mg /ml durante 15 min a temperatura ambiente, seguido de incubación con tampón de equilibrado durante 10 s. Las células se lavaron en PBS y se incubaron con la enzima TdT a 37 ° C durante 1 hr en una cámara humidificada para la incorporación de nucleótidos conjugados en el 3'-OH extremos de ADN. Las células fijadas se lavaron en PBS y se incubaron con solución de conjugado anti-digoxigenina (Rodamina anticuerpo) y contratinción con DAPI. Las imágenes microscópicas de las células fijadas en los portaobjetos se visualizaron con un microscopio óptico Olympus BX40 equipado con una cámara digital controlada por ordenador (DP71, Olympus Center Valley, PA, EE.UU.). la fragmentación de ADN se indica por la tinción positiva rodamina (rojo). Las células no tratadas se mantuvieron como control.
5. naranja de acridina /bromuro de etidio tinción
Los cambios morfológicos en los núcleos de células NHEK después de la exposición a la radiación UVB se determinó para evaluar los efectos protectores de DIM-D y EGCG en las células expuestas. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (10
4 células /pocillo) y se trataron durante 2 horas con diferentes concentraciones de soluciones de DIM-D y EGCG en DMSO antes de la exposición a la radiación UVB en dosis de 150 mJ para 30 seg. Las células fueron incubadas en medio de crecimiento durante 24 horas y la tinción se llevó a cabo con naranja de acridina /bromuro de etidio (AO /EB) como se describe [34] y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Brevemente, se utilizó la absorción diferencial de los dos colorantes para determinar la viabilidad celular. Después de incubación durante 24 horas, las células se lavaron con PBS (2X) y se tiñeron con una mezcla de bromuro de etidio y naranja de acridina.
6. Determinación de especies reactivas del oxígeno (ROS intracelulares) guía
El tinte fluorescente, 2 ', se utilizó diacetato 7'-diclorofluoresceno (DCF-DA) para evaluar la acumulación de ROS en células NHEK después de la exposición UVB. Las células se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de 0,05 × 10
/pocillo, se trataron con diferentes concentraciones de DIM-D y EGCG en DMSO durante 2 horas, aspirado se añadió 6 células una fina película de PBS y las células a continuación, fueron expuestos a dosis de radiación UVB de 150 mJ para 30 seg. Las células se incubaron a continuación durante 24 horas en medio de crecimiento solamente. Se añadió solución de DCF-DA (10 M) a las células (0,05 × 10
6 /ml) y la mezcla se incubó a 37 ° C durante 1 hora en la oscuridad. Las células se lavaron con PBS (2 x) y la intensidad de fluorescencia de las células se determinó por microscopía de fluorescencia.
7. El análisis inmunocitoquímico
Tanto A431 y células NHEK se trataron con DIM-D y EGCG (34,4 micras y 210,0 M respectivamente) y se incubaron durante 24 hr. Las células fueron fijadas en 10% de formaldehído y cytospun en portaobjetos de microscopio. El análisis se llevó a cabo siguiendo el protocolo especificado en el SignalStain
TM kit IHC (Señalización Celular, Beverly, MA). Las células fijadas se hidrataron con diferentes concentraciones de alcohol y PBS (3X), se incubaron con los anticuerpos primarios contra caspasa 3 escindida, Nurr1 y 8-OHdG durante la noche a 4 ° C y se detectaron mediante el anticuerpo secundario conjugado con HRP. Las células se tiñeron con tinción de Nova Roja y de contraste con hematoxilina. El análisis microscópico de las células fijadas se llevó a cabo con un microscopio óptico Olympus BX40 equipado con cámara digital controlada por ordenador (DP71, Olympus Center Valley, PA, EE.UU.).
8. Análisis de transferencia Western
Las proteínas se recogieron a partir de células A431 y tanto NHEK como se describe [33]. En pocas palabras, después de 24 h de tratamiento con DIM-D (17,2 M) y EGCG (104,8 mM), las células se trataron con tampón RIPA (50 nM Tris-HCl, pH 8,0, con cloruro de sodio 150 mM, 1,0% de Igepal CA-630 ( NP-40), 0,5% deoxychlorate de sodio, y 0,1% de dodecil sulfato de sodio) con inhibidor de la proteasa (500 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo). Las concentraciones de proteínas se determinaron de acuerdo con el protocolo de reactivo de ensayo de proteína BCA (PIERCE, Rockford, IL) y la trama estándar se generó mediante el uso de albúmina de suero bovino, 50 g de proteína sobrenadante del grupo de control y todas las diferentes muestras de tratamiento se desnaturalizaron por ebullición a 100 ° C durante 5 min en tampón de muestra SDS y, posteriormente, se sometieron a electroforesis en 10% de gel de SDS-PAGE, se transfirió a membranas de nitrocelulosa, se bloquearon con 5% de leche desnatada en solución salina tamponada con Tris con tween 20 (Tris-HCl 10 mM (pH 7,6 ), NaCl 150 mM, y 0,5% de Tween), y se sondearon con anticuerpos contra Nurr1 (1:400), NFkB (1:500) y caspasa 3 escindida (1:1000) para las células A431. Las proteínas se detectaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP utilizando SuperSignal West Pico solución quimioluminiscente (Pierce, Rockford, IL). La cuantificación y el análisis de los resultados se llevaron a cabo con el software Image J (v1.33u, NIH, EE.UU.). Los resultados se expresaron como proporciones porcentuales de expresión de la proteína de ß-actina (ajustado a 100%).
9. El análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± S.D. durante al menos tres réplicas y la comparación entre varios grupos se estableció por un solo sentido el análisis de varianza (ANOVA) y entre los dos grupos mediante análisis de la prueba t de Student. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo un
Resultados
1.. actividad anticancerígena de los análogos de la DIM
1.1 Efecto de los análogos de la DIM en las células de cáncer de piel A431.
A431 células fueron tratadas con tres análogos DIM diferentes, que difieren estructuralmente en la posición p-fenil (fig. S1). las células A431 se trataron con DIM-B para 24, 48 y 72 hr y los valores de IC50 para la citotoxicidad fueron 56,8 ± 10,7, 30,8 ± 6,6 y 7,2 ± 1,2 mM, respectivamente (Fig. 1A). Los valores de IC50 para DIM-C después del tratamiento para 24, 48 y 72 horas fueron 78,3 ± 16, 50,2 ± 12,2 y 7,2 ± 1,5 mM, respectivamente, y los correspondientes valores de IC50 para DIM-D fue de 68,7 ± 27,3, 48,3 ± 11,5 ± 10.1and 3.1 M después del tratamiento durante 24, 48 y 72 h. En contraste, los valores de IC50 para EGCG después del tratamiento durante 24, 48 y 72 hr fueron 419,1 ± 8,3, 186,1 ± 5,2 y 56,7 ± 3,1 mM, respectivamente (Fig. 1B), que fue significativamente mayor que el observado para C-DIMs (Tabla 1) . Los tres derivados DIM mostraron más potencia que EGCG con pequeñas variaciones entre sus potencias. DIM-D fue sin embargo eligió para su estudio como un fármaco modelo, ya que exhibió mayor fotoestabilidad de DIM-B y DIM-C.
(A) el perfil de citotoxicidad (Parcela de muerte celular% frente a la concentración de fármaco a una ) 24 hr, B) y C 48 h) 72 h donde, DIM-B = DIM-C-pPhCN, DIM-C = C-DIM-pPhBr y DIM-D = DIM-C-pPhCl). Los datos representan la media ± SD. (B) perfil de citotoxicidad (Parcela de muerte celular% frente a la concentración de fármaco) en A) 24 hr, B) de 48 h, C) 72 horas de EGCG en células A431.
1.2 la actividad apoptótica de DIM-D frente a células A431
.
los efectos de la DIM-D sobre la apoptosis en las células A431 fueron examinados por el método TUNEL mediante citometría de flujo. Las células A431 tratadas con DIM-D (34,4 M) durante 24 horas la muerte celular inducida significativamente (38,9%) en comparación con el control de DMSO (Fig. 2A). También se investigaron los efectos de la DIM-D y EGCG sobre la fragmentación del ADN de las células A431 utilizando el método TUNEL mediante análisis microscópico (Fig. 2B). En las células de control tratadas con PBS, se observó la fragmentación del ADN mientras que el mínimo DIM-D aumentado significativamente la fragmentación de ADN como se evidencia por el aumento de la fluorescencia roja. Del mismo modo, EGCG (104,8 M) también aumentó la fragmentación del ADN pero comparativamente menor en comparación con DIM-D (Fig. 2B).
(A) Detección de células apoptóticas por el método de TUNEL utilizando el análisis de citometría de flujo. A431 células fueron teñidas con FITC con células apoptóticas por el método TUNEL antes y después del tratamiento de 24 horas. (I) gráfico de puntos que representa FSC frente a SSC perfil de las células después del tratamiento. (Ii) gráfico de puntos que representa el perfil de FITC fluorescencia frente a FSC para las células después del tratamiento. La mayoría de las células apoptóticas con tinción de TUNEL son ligeramente más pequeñas que las células vivas no teñidas. (Iii) El histograma que representa las células antes del tratamiento en la puerta R1. se detectan muy pocas células apoptóticas. (Iv) las células de histograma que representa después del tratamiento con DIM-D (DIM-C-pPhCl) en la puerta R1. Se detectaron células apoptóticas (brillantemente teñidas por TUNEL). (B) Detección de células apoptóticas por el método de TUNEL utilizando el análisis microscópico. células A431 se tiñeron para células apoptóticas con rodamina por el método TUNEL para el tratamiento de 24-hr. Las células fueron contrastados con colorante Hoechst (DAPI).
1.3 Efecto de la DIM-D en las proteínas apoptóticas y Nurr1.
Las células A431 se trataron con 34,4 M mu M DIM-D y 104,8 EGCG durante 24 hr y células enteras lisados se analizaron mediante transferencias Western (Fig. 3A). expresión DIM-D inducida significativamente de escindidas (activadas) las proteínas caspasa-3 y Nurr1 y resultados similares se observaron para el EGCG. La cuantificación de estos resultados (Fig. 3B) mostró que DIM-D era más potente que el EGCG como un inductor de la caspasa-3 escindido (3,0 veces frente a 2,4 veces) y Nurr1 (2,7 veces vs 1,7 veces) mientras que los efectos sobre NFkB (p65) eran mínimas (1,3 veces frente a 1,1 veces). La expresión de la caspasa-3 escindido y Nurr1 se indujo significativamente por DIM-D y EGCG (p & lt; 0,05). DIM-D (34,4 M) y EGCG (104,8 M) la expresión CHOP también indujo como se indica por la inmunotinción de las células A431 después del tratamiento durante 24 horas (Fig. 3C). La cuantificación de estos resultados mostró aumento significativo de CHOP células teñidas positivamente (79%) en las células tratadas DIM-D, en comparación con 67% de células teñidas positivamente después del tratamiento EGCG. Estos resultados sugieren que el anti-piel potencia carcinogénica de DIM-D es mayor que EGCG en condiciones idénticas.
(A) Expresión de la caspasa 3 escindida, Nurr1 y NFkB en comparación con el control de β-actina en Dim -D y EGCG trataron células A431 por Western blot. Las células no tratadas se mantuvieron como control. (B) Análisis de transferencia Western de la expresión de diferentes proteínas aumentó significativamente en las células tratadas DIM-D. (C) de la CPI tinción con peroxidasa de células A431 tratadas con DIM-D y EGCG, respectivamente, para la proteína pro-apoptótica, CHOP. tinción de color marrón se considera resultado positivo. Las células no tratadas se mantuvieron como control. Los datos se calculan a partir de experimentos por triplicado y se presentan como la media y las barras de error se refieren a SD, * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 en comparación con el control
2.. actividad quimiopreventivo del DIM-D en la normal de los queratinocitos epidérmicos humanos (NHEK) células
efecto
2.1 citotóxica de DIM-D en las células NHEK.
Con el fin de investigar los efectos de DIM-D contra la normalidad células de la piel, las células NHEK se trataron con varias concentraciones de DIM-D (15 a 140 mM) durante 24 horas y los resultados indicaron que el DIM-D era mínimamente tóxico para las células NHEK (Fig. 4A). A la concentración máxima de 140 mM, la muerte celular porcentaje fue 56,2 ± 1,3 mientras que en la concentración IC50 (68,7 ± 7,3 mM) observado en las células A431, la muerte celular NHEK se redujo a 48,7 ± 2,1%. Por lo tanto, se empleó la concentración de la DIM-D 68,7 ± 7,3 M durante todas las investigaciones posteriores. Por otro lado, la exposición de las células NHEK pretratados a la radiación UV, reduce la viabilidad celular más. Sin embargo, esto no fue significativa con el aumento de la muerte celular por ciento a 67,5 ± 2,6 y 65,9 ± 3,1 por 140 micras y 68,7 M, respectivamente (Fig. 4A)
.
(A) Gráfico de la línea del perfil de citotoxicidad (Parcela de% muerte de las células frente a la concentración de fármaco) de células NHEK tratados con DIM-D (DIM-C-pPhCl) a diversas concentraciones con y sin la radiación UVB. Los datos representan la media ± SD. (B) la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) con DIM-D y el tratamiento EGCG antes de la exposición UVB. Cada valor se expresa como la media ± desviación estándar. captación de radicales (C) hidroxilo en una celda libre de sistema de tratamiento in vitro por la DIM-D. Los datos se expresan en términos de porcentaje de control en el que el sistema libre de células no se trató con DIM-D. (D) la determinación de la apoptosis en las células tratadas con NHEK DIM-D (DIM-C-pPhCl) y EGCG a diferentes concentraciones.
2.2 Antioxidante actividad apoptótica potencial y de la DIM-D en las células NHEK .
La actividad antioxidante de la DIM-D y la protección contra ROS inducida por UV también se investigó en células NHEK tratados con 34,4 M DIM-D y 209,6 M EGCG durante 24 horas. Los niveles de UVB inducida por ROS en células NHEK pretratados con DIM-D se redujeron significativamente en comparación con EGCG; Esto demuestra que DIM-D tiene una actividad anti-oxidante más potente que el EGCG (Fig. 4B). Además, la capacidad de DIM-D para secuestrar hidroxilo (-OH) radicales en un sistema in vitro libre de células se utilizó para confirmar el potencial antioxidante mejorada de DIM-D en comparación con EGCG. Los resultados en la Figura 4C revelaron que a concentraciones de 34,4 mM a 280 mM, DIM-D fue capaz de apagar aproximadamente 30% a 90% de los radicales hidroxilo.
A continuación, la actividad apoptótica se analizó en las células NHEK, que fueron pretratados con EGCG (17,2 mM y 68,7 mM) y DIM-D (8,6 y 34,4 mM) antes de la exposición UVB. Para la comparación eficiente entre EGCG y DIM-D con respecto a la protección contra la apoptosis, la IC50 y una cuarta se emplearon las concentraciones de IC50 de DIM-D para EGCG pretratamiento de las células, mientras que la mitad de las concentraciones respectivas se emplea para la DIM-D pretratamiento. El naranja de acridina /bromuro de etidio doble tinción se utilizó para el ensayo de apoptosis debido a que el tinte naranja de acridina tiene capacidad para teñir los núcleos de las células viables verdes, mientras que el colorante de etidio, un agente intercalante impregnado células apoptóticas o necróticas para teñir su naranja núcleos. Hemos demostrado que en las células, que se trataron con DIM-D, hubo una muerte celular apoptótica reducción significativa (tinción roja) en comparación con las células tratadas con EGCG (Fig. 4D). No muerte celular por apoptosis se observó en las células de control, que fueron tratados con PBS o vehículo solamente. tratamiento DIM-D causó disminución significativa en la inducción de apoptosis por la irradiación UVB en células NHEK. EGCG, sin embargo, mostró una protección mínima de las células contra la apoptosis. Las células pretratadas con EGCG antes de la irradiación UVB fueron marcadamente tiñeron de rojo por bromuro de etidio. En general, estos resultados sugieren que, aunque hubo una reducción en la viabilidad celular en las células tratadas UV DIM-D + en comparación con DIM-D células sólo tratadas (como se muestra en la figura 4A.); DIM-D tratamiento relativamente previene la inducción de la apoptosis por la radiación UVB y por lo tanto mejora la viabilidad celular en mayor medida que el EGCG.
2.3 Efecto de la DIM-D sobre el estrés inducido por UVB-oxidativa.
Para investigar más a fondo si DIM-D inhibe la radiación UV-inducida por el estrés oxidativo y la inflamación mediante la mejora de Nurr1 en células de la piel expuestas a UV, se analizó la expresión de Nurr1 y 8-OHdG en células NHEK (Fig. 5). Después de la irradiación UVB, las células se trataron con DIM-D (34,4 M) y EGCG (209,6 mM) durante 24 horas y la formación de 8-OHdG se determinó por inmunotinción (Fig. 5A). UVB aumentó significativamente 8-OHdG pero ambos DIM-D y EGCG disminuye significativamente la respuesta inducida por UVB confirmando así la actividad antioxidante de ambos compuestos. Su potencia relativa fue evidente por inmunotinción. Sólo 3,6% de las células se tiñeron positivamente en el tratamiento DIM-D en comparación con células EGCG tratados (20% de células).
(A) tinción inmunocitoquímica con peroxidasa de Nurr1 y 8-OHdG en células NHEK tratados con DIM- D y EGCG. Presencia de mancha marrón indica la tinción positiva para el anticuerpo primario. (B) & amp; (C) análisis de transferencia de Western de la expresión de Nurr1 en comparación con el control de β-actina en Dim-D y EGCG tratada células NHEK. Las células no tratadas se mantuvieron como control. Los datos se calculan a partir de experimentos por triplicado y se presentan como media ± desviación estándar, * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 en comparación con el control
Inmuno análisis reveló que, la expresión de Nurr1 fue significativamente más fuerte en comparación con. EGCG y UV solamente (Fig. 5A). La cuantificación de estos resultados mostraron que aproximadamente el 83% de las células se tiñeron positivamente para Nurr1 en las células tratadas DIM-D en comparación con células EGCG tratados (66%). Estos resultados demostraron claramente que DIM-D era más potente que el EGCG como inductor de Nurr1. Además, estos resultados fueron confirmados por análisis de transferencia Western. Para este propósito, las células se trataron con NHEK DIM-D (34,4 M) y EGCG (209,6 mM) durante 24 horas y los lisados de células enteras fueron analizados (Fig. 5B). células NHEK tratados con DIM-D mostraron expresión Nurr1, fue significativamente más en las células tratadas DIM-D (1,8 veces) en comparación con EGCG (1,4 veces) (Fig. 5C).
Discusión
la mala evolución clínica de las vías actuales de tratamiento ha llevado a la necesidad de que el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de cáncer de piel. Hay una necesidad urgente de identificar dianas moleculares usando compuestos de la dieta, que tienen tanto el tratamiento terapéutico así como la actividad quimiopreventivo. Nurr1 es un receptor nuclear huérfano y informes preliminares sugieren un papel de Nurr1 en la artritis reumatoide y el cáncer a través de la modulación de la apoptosis. Además también se ha demostrado que los análogos de DIM activa el receptor nuclear huérfano Nurr1 e inhibe el crecimiento del cáncer de vejiga [28]. Sin embargo, no hay informes sobre el potencial quimiopreventivo del DIM-D activan Nurr1 en el cáncer de piel. Por lo tanto, en la primera parte del presente estudio nos centramos en el cáncer o la actividad terapéutica de DIM-D utilizando células de cáncer de piel A431. En la segunda parte de nuestro estudio se investigó la actividad quimiopreventivo del DIM-D a través de la señalización mediada por el uso de Nurr1 NHEK.
En la primera parte de nuestro estudio, se evaluó el efecto citotóxico de la DIM-D en células de la piel A431. Es importante señalar que DIM-D mostró un efecto citotóxico sobre estas células y su efecto citotóxico fue mayor que EGCG. Similar a EGCG, estudios previos han demostrado que el DIM inhibe el crecimiento de células de cáncer derivadas de tumores de la próstata, mama, colon, cuello del útero y el páncreas [34]. El papel de la apoptosis se investigó adicionalmente por determinación de la expresión de la proteína de apoptosis tales como caspasa-3 escindido en las células A431. El análisis de transferencia Western mostró un aumento significativo en la expresión de la caspasa-3 después del tratamiento DIM-D en las células A431. También se estudió la fragmentación del ADN en las células A431 después del tratamiento DIM-D porque la fragmentación del ADN es una característica de apoptosis, que compromete a las células a morir. la fragmentación del ADN fue altamente inducida por DIM-D en comparación con EGCG, lo que confirma que la apoptosis es una vía importante asociado a la actividad contra el cáncer de estos compuestos. Esto se correlaciona bien con nuestro estudio previo de mejora de la actividad contra el cáncer por un compuesto DIM en no pequeñas células de cáncer de pulmón de células humanas [29]. Estudios anteriores han demostrado que el DIM-D activa el estrés del retículo endoplásmico en células de páncreas y cáncer de ovario [35], [36]. DIM-D inducida por la expresión de las proteínas de estrés endoplasmático retículo GRP78 a través de una mayor expresión de CHOP y esto fue acompañado por la inhibición del crecimiento del tumor [37]. Del mismo modo, nuestros estudios inmunocitoquímicos demostraron que DIM-D aumentó la expresión de CHOP en células A431 después del tratamiento durante 24 horas. Estos resultados demuestran que DIM-D ejerce sus efectos contra el cáncer a través de la orientación múltiples dianas moleculares asociadas con la supervivencia celular y la apoptosis.
La sobreexpresión de Nurr1 disminuye mediadores de la inflamación, la expresión del receptor scavenger y reduce la acumulación de LDL en macrófagos [38] , [39]. En nuestro estudio, la expresión de la caspasa-3 escinde se incrementó en las células A431 después del tratamiento DIM-D.