Extracto
Muchos cánceres de próstata recaída debido a la generación de la quimio-resistencia representación medicamentos para el tratamiento de primera línea como el paclitaxel (PTX) ineficaces. El presente estudio tiene como objetivo determinar el papel de los miRNAs y vía Hedgehog (Hh) en el cáncer de próstata quimioresistente y para evaluar la terapia de combinación usando Hh ciclopamina inhibidor (CYA). Se realizaron estudios sobre líneas de células y tejidos de la próstata clínicos PTX resistente DU145-TXR y PC3-TXR. sensibilidad a los fármacos y los ensayos de apoptosis se observó una mejoría significativa citotoxicidad con la combinación de PTX y CYA. Para distinguir la presencia de cáncer de células madre como las poblaciones laterales (SP), se utilizó Hoechst 33342 método de citometría de flujo. DU145 PTX resistente y células PC3, así como el tejido de cáncer de próstata humano poseen una fracción SP distinta. Casi 75% de las células SP están en la fase G0 /G1 en comparación con 62% para las células no SP y tienen una mayor expresión de marcadores de células madre también. fracción de células SP se incrementó después de la monoterapia y el tratamiento con PTX CYA o CYA más PTX reduce con eficacia sus números que indican la eficacia de la terapia de combinación. Se dejó que las células de la fracción SP para diferenciar y volvieron a analizar por la tinción de Hoechst y el análisis de la expresión génica. Publicación de la diferenciación, las células SP constituyen el 15,8% del total de células viables que disminuye a 0,6% en el tratamiento con CYA. Los niveles de expresión de proteína de eflujo de P-gp también se redujo significativamente en el tratamiento con PTX y la combinación de CYA. Perfiles de microARN de DU145 y PC3-TXR-TXR células y el tejido de cáncer de próstata de los pacientes mostraron una disminución de la expresión de miRNAs supresores de tumores tales como miR34a y miR200c. El tratamiento con PTX y la combinación de CYA restauró la expresión de miR200c y 34a, lo que confirma su papel en la modulación de la quimio-resistencia. Hemos demostrado que la suplementación de fármacos estabilizadores de la mitosis como PTX con CYA Hh-inhibidor puede revertir PTX quimio-resistencia y eliminar la fracción SP, en líneas independientes de andrógenos celulares de cáncer de próstata metastásico
Visto:. Singh S, Chitkara D, R Mehrazin , Behrman SW, RW despertador, Mahato RI (2012) quimiorresistencia en células de cáncer de próstata está regulada por miRNAs y erizo Camino. PLoS ONE 7 (6): e40021. doi: 10.1371 /journal.pone.0040021
Editor: Ala-Kin Syn, Instituto de Hepatología Londres, Reino Unido
Recibido: 26 Enero, 2012; Aceptado: 30-may de 2012; Publicado: 29 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Singh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de un Premio de la Idea (W81XWH-10-1-0969) del Departamento de Defensa Programa de Investigación del cáncer de próstata. El apoyo financiero de la Fundación Kosten (www.kostenfoundation.com) también se agradece. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en hombres en los Estados Unidos [1]. Mientras que la terapia anti-andrógeno es actualmente la primera línea de tratamiento para los pacientes diagnosticados con cáncer de próstata, la mayoría de los pacientes finalmente desarrollan la forma independiente de los andrógenos de los cánceres de próstata que es altamente metastásico y tiene mal pronóstico [2]. estabilizadores de microtúbulos tales como PTX son eficaces en el tratamiento de pacientes con diagnóstico de cáncer de próstata independiente de andrógenos [3]. Mientras que los ensayos clínicos han demostrado la eficacia inicial de taxanos en la supervivencia cada vez mayor en los pacientes con cáncer de próstata [4], en la actualidad hay pocos métodos eficaces para el tratamiento de los cánceres de próstata chemoresistant.
La mayoría de los tumores son heterogéneos y están compuestos por mayor y el tumor las células que inician (TIC) con la última formación de una subpoblación distinta en muchos tipos de cáncer. Los tics se refieren a menudo como las células madre del cáncer (CSC) y son responsables de la iniciación del tumor, la auto-renovación, y la quimio-resistencia [5], [6]. Muchos cánceres de próstata recaída debido a la presencia de células madre tumorales de iniciación /cáncer altamente quimiorresistentes [7], [8]. La quimiorresistencia a los fármacos contra el cáncer, incluyendo PTX, por estas células puede ser aportado por las bombas de eflujo de fármacos que pueden eliminar de manera eficiente moléculas lipófilas, incluyendo medicamentos contra el cáncer hidrófobos. Esta propiedad inherente de las células quimiorresistentes se utiliza para la identificación y aislamiento de una población lateral (SP), que son un tipo de células madre de cáncer. La fracción SP, inicialmente identificado por Goodell, es una pequeña subpoblación de células con actividad de células madre enriquecido y son conocidos para demostrar niveles distintivamente bajos de Hoechst 33342 tinción de colorante [9]. las células de la fracción SP han demostrado ser insensible a diversos fármacos quimioterapéuticos [10] debido a su capacidad en effluxing medicamentos de quimioterapia (y colorantes lipófilos tales como Hoechst 33342), debido a la alta expresión de unión a ATP de la familia de casete, tal como MDR1 (P -glicoproteína) y ABCG2 [11]. células SP chemoresistant sobrevivirán y sostener su clonogenicidad durante la exposición inicial a los fármacos citostáticos, permitiendo de esta manera recurrencia de la enfermedad cuando se retira la terapia. Estos subconjuntos de células madre cancerosas son por lo tanto considerados un objetivo viable para la mejora de la intervención terapéutica y la prevención de la quimiorresistencia y la recaída del cáncer
.
El desarrollo de quimiorresistencia a través de un aumento en el número de vástago de cáncer, tales como células, incluyendo las fracciones de SP se ha atribuido a alteraciones en el nivel de los microARN (miARN) en varios tipos de cáncer. Estas moléculas de ARN no codificantes pueden actuar como oncogenes, así como supresor de tumores [12], [13], [14]. La desregulación de miRNAs se ha implicado en la tumorigénesis y resistencia a los medicamentos también. Un trabajo reciente de Cochrane et al. ha identificado miRNAs implicados en la modulación de la quimio-resistencia en varios tipos de cáncer [15].
En nuestro estudio, la hipótesis de que la quimio-resistencia a la PTX en las células de cáncer de próstata metastásico podría ser debido a la expresión de los genes miARN alterado en estas células y que el combinación de fármaco antimitótico con otra molécula pequeña que inhibe la CSC es probable que sea eficaz en la reversión no sólo quimiorresistencia por la supresión de células madre cancerosas, sino también orientar miRNAs implicados en la quimiorresistencia. Por lo tanto, mientras que el fracaso de la quimioterapia tradicional es debido a un fallo para destruir CSC fracciones /SP, un enfoque combinatorio es probable que el rendimiento mejores resultados ya que la CSC-inhibidor será eliminar las células cancerosas pluripotentes y permitirá que el fármaco antimitótico (en este caso PTX) para atacar las células tumorales a granel. Con este fin, hemos combinado PTX con ciclopamina (CYA), un alcaloide esteroide natural que inhibe la vía Hedgehog (Hh), resultando en disminución de la proliferación y el aumento de la apoptosis [16]. En los últimos años, la vía de señalización Hh ha sido implicado en el desarrollo y propagación del cáncer de próstata [17], [18]. La evidencia también ha indicado que la señalización de Hh soporta la señalización de andrógenos y el crecimiento independiente de andrógenos en células de cáncer de próstata en un entorno de andrógenos bajo [19]. La inhibición de la Hh-vía de regulación a la baja de los genes implicados en células madre de auto-renovación, así como la regresión de tumor de próstata sin recaída [20]. La combinación de docetaxel con gefitinib receptor CYA y factor de crecimiento epidérmico (EGFR) inhibidor indujo mayor antiproliferativa y efectos apoptóticos en fracciones de células SP aisladas a partir de células de cáncer de próstata metastásico que los fármacos individuales [21]. Recientemente hemos demostrado que la adición de lapatinib EGFR-inhibidor puede mejorar la eficacia de PTX en la inducción de la apoptosis en una, de próstata metastásico células de cáncer de línea independiente de andrógenos paclitaxel resistente DU145-TXR, tanto
in vitro
así como en xenoinjertos de tumores [22].
Para entender el fenómeno de la quimio-resistencia, en el presente estudio hemos utilizado independientes de andrógenos (AI) líneas celulares de cáncer de próstata metastásico DU145 y PC3 y sus versiones PTX-resistentes, DU145-TXR y PC3-TXR, respectivamente. Hemos demostrado que la resistencia PTX de células de cáncer de próstata se puede modular a nivel de miRNAs. Además, demuestran que la terapia de combinación con CYA y PTX puede reducir eficazmente la viabilidad celular, disminuir la fracción de células SP a dosis mucho más bajas que el utilizado para CYA de monoterapia y de impacto miRNAs supuestamente implicados en la modulación de la quimiorresistencia. Nuestros datos indican que la terapia de combinación implica la administración de suplementos de PTX con HH-inhibidores pueden dirigirse a miRNAs específicos y el cáncer de células madre como las poblaciones de células SP a dosis que son eficaces en combinación, pero no en monoterapia. Este enfoque puede representar un mejor enfoque en la prevención de la metástasis y la recaída en el cáncer de próstata refractario ya que es menos probable que sea tóxico y presentará con muchos menos efectos secundarios para el paciente, asegurando un mejor cumplimiento y la reducción de las posibilidades de una recurrencia.
Materiales y Métodos
Materiales
PTX y CYA se adquirieron de los laboratorios LC (Woburn, MA). SYBR Green PCR en tiempo real mezcla maestra y revertir los reactivos de transcripción se compraron de Applied Biosystems (Foster City, CA). Cabra P-gp de anticuerpos y anticuerpo secundario anti-conejo correspondiente se adquirió de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Todos los demás productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y se utilizaron tal como se recibieron, a menos que se indique lo contrario.
Las líneas celulares
La líneas celulares de cáncer de próstata metastásico humano DU145 y PC3 y sus versiones resistentes PTX-DU145 y PC3 TXR-TXR eran una especie de regalo del Prof. Evan T. Keller (Universidad de Michigan). Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio de cultivo RPMI suplementado con 1% de penicilina /estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS) (Gibco) en un incubador humidificado que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C como se describió anteriormente [22] .
próstata tejido humano
tejido prostático humano (cancerosos y benignos) se obtuvieron de los Asuntos de Veteranos (VA) del hospital, Memphis, TN siguiendo los protocolos establecidos y de acuerdo con la exención prevista consentimiento informado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de UTHSC y en el hospital de Veteranos. tejido de la próstata fue tomada usando una pistola de biopsia con aguja gruesa de calibre 18 y una parte de este tejido se enjuagó y, o bien congelaron en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C o colocado en medio RPMI libre de suero frío que contiene antibióticos para la preparación de un solo suspensiones de células. Los tejidos se clasifican como malignos o benignos en base al diagnóstico realizado por un patólogo.
Ensayos
Drogas sensibilidad y la apoptosis en DU145-TXRCells
Para determinar la extensión de la apoptosis celular después de los tratamientos con fármacos, DU145- TXR células se sembraron en placas de 6 pocillos (7,5 x 10
5 células /pocillo). Después de 24 h, se retiró el medio y se añadieron medios frescos que contienen concentraciones variables de PTX CYA o sus combinaciones. Las células fueron teñidas con anexina-V y yoduro de propidio (PI) usando el kit de ensayo Vybrant Apoptosis según el protocolo del fabricante (Molecular Probes). Brevemente, las células se tripsinizaron, se lavaron dos veces con PBS frío y se sedimentaron por centrifugación a 800 rpm durante 5 min. Los sedimentos se resuspendieron en 100 l de tampón de unión 1X anexina y 5 l isotiocianato de fluoresceína (FITC) -Annexin-V. Se añadió yoduro de propidio (100 mg /ml) a cada 100 l de suspensión celular. Las células teñidas se analizaron inmediatamente por citometría de flujo.
También se utilizaron células
DU145-TXR para determinar la capacidad de inhibición del crecimiento celular de PTX y CYA. Las células (5 × 10
3 /pocillo) se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h para permitir la unión celular. entonces Se reemplazó el medio con medio fresco que contenía PTX (0,5 /1 M) o CYA (10/25 M) o una combinación (PTX 0,5 M y CYA 10μM) y se incubaron adicionalmente durante 48 horas a 37 ° C /5% de CO
2. a continuación, la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. Para esto, se retiró el medio y las células se lavaron con PBS y 200 l de medio fresco que contiene 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2, 5-difenil bromuro de tetrazolio (MTT) (0,5 mg /ml se añadió) seguido de incubación a 37 ° C /5% de CO
2 de 4 h. Después de 4 h, se retiró el medio y cristales de formazano formados se disolvieron en 200 l de DMSO y la absorbancia se midió a 560 nm. La viabilidad celular se calcula utilizando la siguiente fórmula:
Se usó DMSO para solubilizar PTX y CYA y controles de DMSO se incluyeron en todos los experimentos
Análisis Side Población y clasificación de células por FACS
análisis de la población en Side-DU14 TXR y líneas de células PC3-TXR se realizó mediante citometría de flujo Hoechst 33342 método. En resumen, las células adherentes se trataron con tripsina y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células (1 × 10
6 células /ml) se suspendieron en medio RPMI suplementado con 2% de FBS y tampón HEPES 1 mM con o sin soluciones de fármacos (verapamilo, PTX o PTX + CYA). Hoechst 33342 (5 l; /ml 1 mg) de colorante Después se añadió seguido de incubación durante 90 min a 37 ° C. Las células se recuperaron por centrifugación y se lavaron varias veces con PBS para eliminar el colorante no unido y finalmente se suspendieron en PBS enfriado en hielo que contiene 2% de FBS. fracción SP en muestras clínicas se analizó como se ha descrito anteriormente con pasos adicionales. Brevemente, se lavó el tejido de próstata recién resecado, mecánicamente picada y se digirió durante 4 horas a 37 ° C con 100 U /ml de colagenasa IV (Worthington Biologicals) en medio RPMI libre de suero. El tejido se pipeteó con frecuencia con una pipeta serológica de 5 ml y al final de la incubación, la digestión se pasó a través de una aguja de calibre 18.5-, se centrifugó brevemente y el sobrenadante se tamiza a través de un filtro de células de 100 micras para obtener una suspensión de células individuales. Las suspensiones de células individuales diluidas se pasaron una vez a través del filtro de malla de 40 micras, su viabilidad evaluó mediante tinción con azul de tripano y se mantuvo en hielo hasta que se analizaron.
Las células cultivadas en placas de 6 pocillos fueron tratados con A) 0,3% de DMSO, B) 0,5 M PTX C) CYA 10 M, D) 25 M CYA, e) 0,5 M PTX 10 CYA M durante 48 horas y F) en las células DU145-TXR después de diferentes tratamientos farmacológicos. Posteriormente, las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS y se tiñeron con Anexina V-FITC y PI antes del análisis de apoptosis por citometría de flujo. A-E son gráficos representativos de tres experimentos individuales. Los datos en el panel F es la cuantificación de la muerte celular y% representa la media ± SD (n = 3). *
p Hotel & lt; 0,05 frente al control. Para el ensayo MTT (Fig. 1G), las células cultivadas en placa de 96 pocillos se trataron con la concentración indicada de fármacos para 48 h. Posteriormente, se añadió reactivo MTT en PBS y la incubación se llevó a cabo durante otras 4 h. El producto de formazán resultante se solubilizó en DMSO y la intensidad del color se determinó usando un lector de placas. se observó cuando combinación de PTX 0,5 M y 10 M CYA se utilizó; una diferencia estadísticamente significativa (0,05 *
& lt valor p
). La viabilidad celular = A
prueba /A
controlX100. Los datos son la media ± SD (n = 4). PTX, Paclitaxel; CYA, ciclopamina.
Análisis del ciclo celular
La citometría de flujo se utilizó para determinar el porcentaje de células en diferentes ciclos de crecimiento. Las células (5 x 10
5) obtenidos después de la clasificación se lavaron con PBS y se fijaron con etanol (70%) a 4 ° C durante la noche seguido por tratamiento con RNasa (1 mg /ml) y se tiñeron con PI (10 mg /ml ). a continuación, se determinó el porcentaje de células en diferentes fases del ciclo celular.
A) células DU145, B) las células DU145-TXR, las células C) DU145-TXR tratados con verapamil (10 M, 90 min), D) DU145 células -TXR tratadas con PTX (1 M, 12 h), e) de las células DU145-TXR tratados con CYA (20 M, 12 h), las células F) DU145-TXR tratados con CYA y PTX (20 micras y 0.5μM, respectivamente , 12 h). El verapamilo fue utilizado para puerta de la fracción SP en todos los paneles y se muestra como el porcentaje de la población total de células viables. Los valores numéricos indicados son la media ± desviación estándar de tres experimentos individuales. *
p
& lt; 0,05 vs células DU145 de control en (A). PTX, Paclitaxel; CYA, ciclopamina.
A) las células PC3-TXR, B) Las células tratadas con verapamilo (10 M, 90 min), las células C) PC3-TXR tratados con CYA (20 M, 12 h) o A, C) CYA y PTX (20 M y 0.5μM, respectivamente, 12 h). La fracción SP, que fue eliminado por tratamiento con verapamilo, estaba cerrado (P8) en todos los paneles y se muestra como el porcentaje de la población total de células viables. Los valores numéricos indicados son la media ± desviación estándar de tres experimentos individuales. *
p Hotel & lt; 0,05 frente al control DU 145 células (A). PTX, Paclitaxel; CYA, ciclopamina.
Después de la clasificación de flujo, se sembraron y se dejaron diferenciar durante 2 semanas células SP puros. fotomicrografías representativas de SP (A) y las células de NSP (B) se muestran con más células SP que posee un fibroblástica, fenotipo alargado en comparación con NSP. tiempo real RT-PCR se utilizó para confirmar una mayor expresión de marcadores de células madre OCT 4 y NANOG y marcadores de células madre del cáncer CD133 y ALDH1 (C). método similar se utiliza para lograr una mayor expresión de la pluripotencia y ABCG2 marcador de flujo de salida y una menor expresión de las transcripciones Mcm7 en células SP iniciales (SP), en comparación con poblaciones mixtas después de la diferenciación (DIF) en el que disminuyó ABCG2 y se observaron mayores niveles Mcm7 (D) . Un conjunto de células también fue tratado con 25 mM CYA durante 48 h. Posteriormente, las células se tripsinizaron y re-teñidas con colorante Hoechst y se analizaron por citometría de flujo. Después de la diferenciación, las células derivadas de células SP flujo ordenado tuvieron mayor porcentaje de fracciones de células SP que la obtenida previamente a partir de células no ordenados DU145-TXR. tratamiento CYA redujo significativamente (
p
& lt; 0,001 frente a control) el porcentaje de células de la fracción SP de 15,8 (± 2,1)% (Panel E) a 0,6 ± (0,09)% (Panel F). Se proporcionan gráficos de puntos representativos de tres experimentos individuales. Los datos representan la media ± SD (n = 3).
Estudio in vitro de diferenciación
La capacidad de las células para diferenciar SP se determinó mediante el cultivo de las células fracciones puras en un 6 así placa durante 14 días después de la clasificación. las células SP-fracción de DU145-TXR y PC-TXR (1 × 10
5 /pocillo) se sembraron en placa de 6 pocillos y se dejaron crecer en medio de cultivo RPMI suplementado con 10% FBS. Después de 14 días, la tinción y análisis SP Hoechst se hizo en las poblaciones de células tratadas o no tratadas como se describe anteriormente. La expresión de genes también se llevó a cabo en células SP y no SP tanto antes como después de la diferenciación.
Después del tratamiento, con varios medicamentos como se describe, la proteína total se extrajo y se separó por SDS-PAGE antes de sondeo con P anticuerpo -gp. Actina se utilizó como control de carga. Una combinación de 0,5 PTX mu M y 10 CYA mu M fue más eficaz en la regulación negativa de la expresión de P-gp en células de cáncer de próstata resistente a los medicamentos que la monoterapia con cualquiera de CYA o PTX a una concentración de 10 y 0,5 mM. regulación a la baja de P-gp con 25 mM CYA era casi similar a la obtenida por terapia de combinación. (B) Expresión de la vía Hh y tallo genes marcadores de células en células DU145-TXR. El ARN total se extrajo de las células y transcripción inversa en ADNc. en tiempo real RT-PCR se realizó utilizando SYBR química verde y los valores de Ct obtenidos de este modo se utilizaron para calcular el factor de cambio. células DU145-TXR resistentes a los fármacos tienen una mayor expresión de los tres genes probados. células DU145 sensibles PTX se utilizaron como control de genes y los valores de expresión para las células DU145-TXR se normalizaron con respecto a los valores de control. *
p
. & Lt; 0,05 frente a control
Western blot
Después del tratamiento, las células DU145 TXR se lisaron usando tampón RIPA y se determinó la concentración de proteínas totales utilizando Bio-Rad RC DC kit de ensayo de proteínas (Hercules, CA). a continuación, SDS-PAGE se realizó para resolver las proteínas que después se transfieren a Immobilon membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando iBlot sistema de transferencia en seco (Invitrogen, Carlsbad, CA). El bloqueo se realizó con 5% de leche seca no grasa en 1X PBST (PBS que contiene 0,05% de Tween-20) durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas fueron incubadas con el anticuerpo primario durante 16 horas a 4 ° C. Actina se utilizó como control de carga de proteínas diana y se detectó mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL) kit de detección (GE Healthcare Life Sciences, PA).
El ARN total incluyendo miRNAs se aisló a partir de células DU145 DU145-TXR y (A ) o células PC3-TXR PC3 y (B) utilizando el kit de aislamiento de ARN miRNEasy. SYBR Green matriz miScript miRNA PCR centrado vía de base (Qiagen, MD) se usó para estudios de perfiles de miARN. Las placas se realizaron en un instrumento Light Cycler Roche 480® y la expresión de miRNAs individuales fueron analizados utilizando los C
p valores obtenidos y el método ΔΔCt. Tabla en el inserto (C) confirma la validación de datos de perfiles de miARN por el ensayo de imprimación miScript. Validación de datos de perfiles de miARN fue hecho por un tiempo real basado SYBR Green RT-PCR ensayo de miRNAs seleccionados. Como normalizador, SNORD6 fue utilizado como un servicio de limpieza miARN. (D) La eficacia de la terapia de combinación en la restauración del MIR 200 cy 34a se determinó mediante el tratamiento de las células DU145-TXR con PTX (0,5 M) y CYA (10 M) combinación durante 48 horas después de lo cual se extrajo el ARN total, se convirtió al cDNA y utilizar como plantilla para ensayo de imprimación miScript para la determinación de la expresión de miRNAs 200c y 34a. Se utilizaron células DU145-TXR sin tratar como control para calcular el cambio veces después de un ensayo de SYBR Green tiempo real RT-PCR. Los datos representan la media ± SD (n = 3). *
p
. & Lt; 0,05 frente al control sin tratar
tiempo real RT-PCR
El ARN total fue extraído de células de cáncer de próstata ordenados y no ordenados utilizando ARN RNeasy kit de aislamiento (Qiagen, MD), seguido de la determinación de su calidad por Nanodrop instrumento 2000. Fue entonces a transcripción inversa en cDNA plantilla como se ha descrito antes [23]. ADNc (100 ng) entonces fue amplificado por PCR en tiempo real utilizando SYBR Green mezcla maestra universal de colorante en un Light Cycler 480 instrumento (Roche, Indianapolis, IN) usando los cebadores para los genes de interés por cuarenta ciclos cantidad relativa de ARNm en comparación con S19 (gen de mantenimiento) nivel se calculó utilizando los valores de punto de cruce (PC) y con respecto a escala para las muestras de control establecidos en un valor de 1. los resultados de la expresión génica en muestras experimentales se representaron en comparación con el control.
Varios genes implicados en los procesos biológicos relacionados con el cáncer y objetivos conocidos de miRNAs expresados diferencialmente en nuestro estudio son alterados en las células DU145 TXR resistentes PTX. Después de la extracción de RNA y en tiempo real basado SYBR Green RT-PCR utilizando cebadores específicos de genes, los valores Cp se calcularon y se utilizaron células DU145 resistentes para normalizar la expresión de genes individuales. Los datos representan la media ± SD (n = 3).
microARN (miARN) de perfiles y datos de validación
El ARN total que incluye pequeños no codificantes de los genes miARN se aisló de tratar y drogas tratado con DU145-TXR y las células DU145 o las células PC3 y PC3-TXR utilizando kit de aislamiento de ARN miRNEasy (Qiagen MD) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los mismos reactivos se utilizaron para aislar el ARN total a partir de tejido de próstata humana. En pocas palabras, los tejidos se congelaron rápidamente se suspendió en tampón de extracción y se somete a la desintegración cuidado usando un homogeneizador eléctrico manual durante 30 segundos en un entorno de baja a media velocidad. El homogeneizado se centrifugó durante 3 minutos a 4 ° C y el sobrenadante se utilizó para extraer el ARN total. Post-aislamiento, se determinó la calidad del ARN usando un instrumento Nanodrop 2000.
(A) de tejido de cáncer de próstata humano se convirtió en suspensiones de células individuales como se describe en "Métodos". Las células se tiñeron con colorante Hoechst y se analizaron como se ha descrito previamente. Casi el 1% de la población total de células viables fue cerrada como la fracción SP. (B) El ARN total se aisló de otra serie de tejidos de próstata humanos (cancerosas y benignas) utilizando el kit de aislamiento de ARN miRNEasy. SYBR Green matriz miScript miRNA PCR centrado vía de base (Qiagen, MD) se usó para estudios de perfiles de miARN. Las placas se realizaron en un instrumento Light Cycler Roche 480® y la expresión de miRNAs individuales se analizaron mediante los obtenidos C
valores de t y el método ΔΔCt. Los cambios veces en los tejidos tumorales se normalizaron con respecto al tejido de la próstata benigna. (C) Tabla en el inserto confirma la validación de datos de perfiles de miARN por el ensayo de imprimación miScript. Validación de los genes miARN de datos de perfiles de hecho por la estimación de RT-PCR de seleccionado miRNAs200c, 34a y 29b. SNORD6 fue utilizado como un servicio de limpieza miARN para la normalización de datos.
Para los estudios de perfiles de miARN, se utilizó SYBR verde basada centrado vía miScript-miARN PCR Array (Qiagen, MD). La matriz de vía de cáncer (número de catálogo 102ZF) permite la detección simultánea de 84miRNAs previamente identificada en los cánceres humanos, así como ensayos de limpieza apropiados y controles de calidad de ARN. El ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Trescientos nanogramos (ng) de ARN total se convirtieron en cDNA utilizando el kit miScript II RT. cDNA diluido se mezcló con cebador universal y el tinte SYBR Green y se añade a los pocillos de placas de 96 pocillos que contenían cebador liofilizado. Las placas se ejecutan en un 480®instrument Roche Light Cycler y la expresión de miRNAs individuales fueron analizados utilizando los C
t valores obtenidos. El factor de cambio para cada miARN se calculó mediante la conexión de los C
p valores en el software basado en la web del fabricante. células DU145 o las células PC3, así como muestras benignas de la próstata se consideraron como 'controles' con el fin de calcular el factor de cambio en las células y tejido de la próstata cancerosa DU145-TXR y PC3-TXR, respectivamente. existe controles endógenos, controles negativos y positivos RT, y los controles de contaminación de ADN genómico también se ensayaron para cada matriz.
interrelación significativa entre la quimiorresistencia, transición epitelial a mesenquimal y la metástasis, que negativamente en los resultados del tratamiento impactos. Quimio-resistencia, una característica clave de células madre cancerosas y las células sometidas a la EMT, está regulado por la desregulación de miRNAs. Nuestra terapia de combinación propuesta con PTX y CYA blancos simultáneamente células madre cancerosas y las células cancerosas a granel, se invierte la EMT y restaura la expresión de miRNAs alterados durante la generación de la quimio-resistencia y es una estrategia viable para tratar el cáncer de próstata resistente a los medicamentos.
validación de datos de perfiles de miARN hecho por la estimación en tiempo real PCR de miRNAs seleccionados. Para cada uno de los genes miARN seleccionado, un cebador de PCR miScript se adquirió de Qiagen. Este ensayo sólo se maduran objetivos miRNAs, no sus precursores. Como normalizador, SNORD6 fue utilizado como un servicio de limpieza miARN. Brevemente, el ADNc diluidos utilizados para miARN perfiles se utilizó como plantilla en presencia de colorante SYBR Green, cebador universal y el cebador miScript. La placa se llevó a cabo como se describe más arriba y doblar los cambios en la expresión de los genes miARN se calcularon utilizando el C
valor t del control normalizador. Un enfoque similar se utilizó para medir la expresión de miR200c y miR 34a en DU 145-TXR células tratadas con 0,5 M PTX + 10 M CYA. Después del tratamiento, se aisló el ARN total, se transcribió inversamente en ADNc y se utiliza para medir la expresión de los genes miARN como se ha descrito anteriormente.
Análisis estadístico
Todos los valores de las figuras y el texto se expresaron como la media ± SD . Los resultados se analizaron y los medios individuales del grupo se compararon con de Student para datos independientes
t-test
. Un
p
valor de al menos 0,05 fue considerado significativo y se indica con un asterisco (*).
Resultados
Combinación de CYA y PTX reduce la viabilidad celular y potencia la apoptosis en células de cáncer de próstata resistente a los medicamentos
la capacidad de la quimioterapia de combinación para inhibir el crecimiento de la línea celular de cáncer de próstata resistente a la PTX se evaluó mediante el ensayo de viabilidad celular y la apoptosis. Se observó que la combinación de PTX y CYA significativamente (
valor p & lt
; 0,05) disminuye la viabilidad celular a 40%, en comparación con cualquiera de PTX o CYA solo (Fig 1, los paneles A-F.). Se obtuvieron resultados similares en el ensayo de muerte de las células con anexina V en la que los resultados de la terapia de combinación en una muerte celular significativamente mayor en comparación con un solo agente de quimioterapia (Fig. 1, G). Si bien una combinación de PTX y CYA resultó en casi el 70% de las células que mueren, la muerte celular por ciento observado con PTX o monoterapia CYA fue 15% y 25%, respectivamente. Sin embargo, el tratamiento con CYA 25 M fue significativamente más efectivo que el control y dio lugar a casi el 40% de muerte celular.
existir fracciones lateral de población en las células de cáncer de próstata -resistant PTX y tienen expresión génica única
las figuras 2 y 3 muestran el análisis de SP de líneas celulares de cáncer de próstata DU145-TXR y PC3-TXR, respectivamente, así como el efecto del tratamiento con PTX y CYA. Control de las células DU145 tienen pequeñas cantidades de SP (0,2%, Fig. 2A), mientras que la línea celular resistente a la PTX-DU145 TXR tiene ~3.2% de células SP (Fig. 2B), como se indica por la tinción de Hoechst (
p & lt
; 0,05 en comparación con DU 145 células). En el caso de las células PC3-TXR, casi el 2% de las células viables fueron cerrada como SP (Fig. 3A). Verapamilo, se utilizó un supresor conocida de bombas de eflujo en estos estudios como un control para configurar las puertas en los gráficos de puntos de FACS. Como se ve en las figuras. 2C y 3B, tratamiento con verapamilo redujo significativamente fracciones SP en células DU145-TXR al 0,89% y al 0,6% en las células PC3-TXR. Este dato está de acuerdo con el uso de verapamilo como fármaco de control para la identificación y células gating Hoechst-luz en varias células cancerosas, incluyendo el cáncer de próstata. Mientras que el tratamiento con 1 mM PTX durante 12 h aumentó la fracción SP a 7,8%, el tratamiento con 20 mM CYA, una combinación de CYA y PTX 24 h después de la eliminación de PTX para un tiempo similar disminución de la fracción SP a ~ 2% (Fig. 2 , los paneles D, e y F, respectivamente) (
p
& lt; 0,05 en todas las muestras). En las células PC3-TXR, la fracción SP se redujo notablemente después del tratamiento con CYA (Fig. 3C) o CYA y la combinación de PTX (Fig. 3D). Análisis en tiempo real RT-PCR indica una mayor expresión de marcadores de pluripotencia Oct4 y NANOG, y marcadores de células madre del cáncer CD133 y ALDH1 en fracciones de SP en comparación con los no-SP fracciones (NSP) en tanto DU145-TXR y células PC3-TXR. Posterior a la diferenciación de destino de las células SP fue estudiado por el tiempo real de RT-PCR y tinción Hoechst después de su aislamiento y la revisión de su cultura. Estas células diferenciadas en una población mezcla que comprende SP y fracciones de NSP que diferían en su fenotipo (Fig. 4, paneles A y B, respectivamente). Análisis de la expresión de la post-diferenciación de las poblaciones mezcladas indica transcripciones reducidas de la ABC-transportador y stemness cáncer ABCG2 marcador y una mayor expresión de la proliferación celular mantenimiento marcador minichromosome 7 (MCM7) en comparación con SP-fracciones no diferenciadas (Fig. 4D). El tratamiento posterior de las poblaciones SP después de la diferenciación con 25 CYA M durante 48 h dio lugar a la disminución de la fracción SP significativamente de 15,8% (panel E) a 0,6% (panel F,
p Hotel & lt; 0,05). La Tabla 1 muestra el análisis del ciclo celular de la SP ordenados de flujo y células NSP. Se observó que, 62% de células de NSP estaban en el G0-G1 y 30% en la fase S en contraste con 71,5% y 21% para células SP, respectivamente (
p
& lt; 0,05).
genes y expresión de proteínas en células DU-145 TXR
La expresión de P-glicoproteína (P-gp) se evaluó mediante Western Blot. Higo.