Extracto
El cáncer de colon comprende una pequeña población de células madre de cáncer de iniciación (CIC), que es responsable del mantenimiento del tumor y la resistencia a los anti terapias: cáncer, posiblemente permitiendo una recapitulación del tumor una vez que se suspende el tratamiento. Las combinaciones de terapias inmunológicas con la quimioterapia y otros agentes antitumorales pueden ser de beneficio clínico significativo en el tratamiento de cáncer de colon. Sin embargo, las terapias basadas en inmunes celulares no se han experimentado todavía en la población de CICs colon. Aquí, nos demuestran que el tratamiento con bajas concentraciones de los agentes quimioterapéuticos utilizados frecuentemente, 5-fluorouracilo, doxorrubicina y sensibilizar a los CIC de colon a la citotoxicidad de células T Vγ9Vδ2. citotoxicidad de las células T Vγ9Vδ2 fue mediada en gran parte por la interacción con TRAIL DR5, tras el reconocimiento NKG2D dependiente de los dos puntos blancos CIC. Llegamos a la conclusión de que
in vivo
activación de las células T o la administración Vγ9Vδ2 adoptiva de
ex-vivo
células T expandidas Vγ9Vδ2 a intervalos apropiados después de la quimioterapia puede aumentar sustancialmente las actividades antitumorales y representar una nueva estrategia para la inmunoterapia del cáncer de colon
Visto:. Todaro M, Orlando V, G Cicero, Caccamo N, S Meraviglia, Stassi G, et al. (2013) La quimioterapia del cáncer de colon sensibiliza células iniciadoras de Vγ9Vδ2 T citotoxicidad mediada por células. PLoS ONE 8 (6): e65145. doi: 10.1371 /journal.pone.0065145
Editor: Jacques Zimmer, Centro de Investigación Pública de la Santé (CRP-Santé), Luxemburgo
Recibido: 5 de Marzo, 2013; Aceptado: April 23, 2013; Publicado: 6 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Todaro et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha sido apoyado por subvenciones del Ministerio italiano de Instrucción, Universidad e Investigación (contrato Nº 2008L57JXW de FD.), el Ministerio de Sanidad italiano (Progetto Ricerca Finalizzata 2007 "las células madre en diferentes condiciones patológicas: Enfoques terapéuticos innovadores" a FD), Istituto Superiore di Sanità oncoproteómica Proyecto 2007-527 /B /3A /3 (a GS y FD) y la Universidad de Palermo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores declaran no tener conflicto financiera o comercial de interés. El autor correspondiente, Francesco Dieli, es un editor académico de PLOS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
En los últimos años, nuevos conocimientos en la investigación del cáncer han sugerido que la capacidad para iniciar y sostener el crecimiento del tumor es una característica única de un pequeño subconjunto de las células cancerosas con propiedades stemness dentro de la masa tumoral, denominado "células madre del cáncer" (CSC) o "células iniciadoras del cáncer" (AIC) [1]. La quimioterapia sigue siendo el tratamiento de elección primaria para muchos cánceres avanzados y tiene actividad antitumoral citotóxica a través de una serie de mecanismos. Sin embargo, la mayoría de los cánceres son resistentes a las terapias actuales debido a los CIC de la bicicleta lenta, la localización de estas células dentro de nichos de hipoxia [2], [3], y porque las células malignas tienen la capacidad de desarrollar mecanismos para resistir o escapar de la citotóxico efectos de la quimioterapia [4], que incluyen la regulación de varios transportadores de casete de unión a ATP, la capacidad de reparación del ADN activa y la sobre expresión de las moléculas anti-apoptóticas que causan cambios en las vías de señalización que controlan la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [5] .
Varios estudios han demostrado que el tratamiento de células tumorales con fármacos quimioterapéuticos induce o aumenta su sensibilidad a la citotoxicidad por los linfocitos NK o T; por lo tanto, las combinaciones de terapias inmunológicas celulares con quimioterapia y otros agentes antitumorales pueden ser de beneficio clínico significativo en el tratamiento de muchos tipos de cáncer [6].
γδ células T son de particular interés para su uso en tales terapias combinadas debido a su citotoxicidad antitumoral potente y la relativa facilidad de generación
in vitro
[7]. células γδ T humanas se pueden dividir en dos poblaciones principales sobre la base de expresión de la cadena δ [8]: γδ células T que expresan la cadena Vδ1 se encuentran más frecuentemente en los tejidos de las mucosas, en los que están implicados en el mantenimiento de la integridad del tejido epitelial en la cara de los daños, infección o transformación del tumor, mientras que las células T delta gamma que expresan la cadena Vδ2 emparejado a la cadena Vγ9 (aquí y a partir de entonces llamadas células Vγ9Vδ2 t) predominan en la sangre periférica y órganos linfoides secundarios [9]. Mientras que el ligando (s) reconocido por las células Vδ1 siguen siendo desconocidos, las células T reconocen antígenos Vγ9Vδ2 no peptídicos por un mecanismo de MHC-sin restricciones, una característica importante que las distingue de las células T αβ [9]. En concreto, las células T reconocen Vγ9Vδ2 phosphoantigens que se producen a través de las vías de biosíntesis de isoprenoides [10] - [12]. Phosphoantigens no son estimuladoras a niveles fisiológicos, pero transformadas y células infectadas, producen aumento de los niveles de intermediarios metabólicos que son capaces de activar las células T Vγ9Vδ2 [13] - [15]. En consecuencia, las células Vγ9Vδ2 T también se pueden activar, a través de un mecanismo indirecto, por aminobifosfonatos, una clase de medicamentos utilizados para tratar ciertas enfermedades de los huesos, que inhiben la farnesil pirofosfato sintetasa, y causa la acumulación de metabolitos aguas arriba endógenos como isopentenylpyrophosphate (IPP) [16 ]. células Vγ9Vδ2 T pueden contribuir indirectamente a la defensa inmune contra las células cancerosas, mediante la producción de citoquinas típicas de las células Th1, Th2 o Th17 [17] - [19], o-parlantes cruzadas con las células dendríticas [20], los macrófagos [21] y B las células [22] - [24]. Además, las células T Vγ9Vδ2 realizan potente actividad citotóxica directa hacia las células cancerosas, que está mediada en gran parte la misma manera que para las células CD8 T y células NK, a través de perforina /granzima, Fas /FasL, TNF /TNF-R y TRAIL-TRAIL R vías [10].
En este estudio, hemos evaluado la sinergia potencial de combinar la quimioterapia y Vγ9Vδ2 T citotoxicidad mediada por células para la terapia antitumoral. En concreto, como los CIC de colon son resistentes a ambos fármacos quimioterapéuticos y para Vγ9Vδ2 T citotoxicidad mediada por células, se ha determinado si la quimioterapia puede utilizarse para sensibilizar a los dos puntos blancos CIC a la citotoxicidad celular Vγ9Vδ2 T, basado en tres líneas de evidencia: (1) pioneros obra de Mattarollo y colegas [25] ha demostrado altos niveles de citotoxicidad contra las líneas celulares derivadas de tumores sólidos con el tratamiento de combinación que utiliza células T y Vγ9Vδ2 agentes quimioterapéuticos; (2) la IL-17 de producción de γδ células T juegan un papel decisivo en la respuesta inmune contra el cáncer inducidos por la quimioterapia en el ratón [26]; (3) el tratamiento de los CIC de colon con el zoledronato bisfosfonato aumenta su sensibilidad a la muerte celular Vγ9Vδ2 T [27].
Hemos demostrado que los fármacos quimioterapéuticos utilizados actualmente para el tratamiento de pacientes con cáncer de colon, 5-fluorouracilo y doxorrubicina, somos capaces de sensibilizar a los CIC de colon a Vγ9Vδ2 T destrucción mediada por células y se demuestra que los mecanismos subyacentes implican NKG2D y TRAIL.
Resultados
Resistencia de los CIC de colon con la quimioterapia
Hemos informado anteriormente de que el cáncer de colon comprende una gran mayoría de las células diferenciadas y una pequeña población de CICs que son responsables de la iniciación del tumor y mantenimiento [28]. Para estos fines de estudio, nos purifica y se propagan las esferas de cáncer de colon a partir de fragmentos quirúrgicos de 5 pacientes con carcinoma de colon. Estas líneas esfera de cáncer se identificaron mediante la expresión de CD133 y la ESA antígeno específico epitelial, se muestra la adhesión a las placas de cultivo en presencia de suero y posteriormente se diferenciaron en células del colon grandes, poligonales que expresan marcadores epiteliales de colon, tales como vellosidades, lo que sugiere que el colon esferas de cáncer mantienen la capacidad de
In vitro
diferenciar en células similares a los enterocitos. Lo más importante, cuando se inyecta por vía subcutánea en ratones NOD /SCID, un bajo número de esferas de cáncer de colon, pero no la esfera, derivados de células diferenciadas, retenido la capacidad para formar un tumor que se parecía mucho a la tumor original humana (Apoyando Figura S1).
los AIC se caracterizan por una alta resistencia a los fármacos y toxinas generales que se dirigen a células que proliferan rápidamente y piezas de las células que se dividen lentamente, debido a una sobre regulación de varios transportadores de casete de unión a ATP, activa la capacidad de reparación del ADN, la sobre expresión de las moléculas anti-apoptóticas que causan cambios en las vías de señalización que controlan la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [5]. De acuerdo con ello, la exposición de 5 diferente de colon líneas CIC (CIC#1 a#5 CIC) a 5-FU (2,5 y 25 mg /ml) (Figura 1A) o DXR (0,025 y 0,25 M) (Figura 1B) para 24 a 72 hrs tenían prácticamente ningún efecto citotóxico significativo, tal como se determina mediante tinción con PI. Las dosis más altas de 5-FU (250 mg /ml) y DXR (2,5 M) causaron baja, pero detectable la citotoxicidad de las líneas de la CIC que van desde 15 ± 5% a 23 ± 6% (media ± DE). A la inversa, 5-FU y DXR eran totalmente capaz de matar a 3 líneas celulares de cáncer de colon diferenciadas DLD-1, SW620 y SW403, y 2 líneas de células diferenciadas (CDC#3 y CDC#4) obtenidos a partir de dos pacientes (P#3 y P#4) donde se forman los CIC también se obtuvieron líneas, con un aumento dependiente de la dosis en la citotoxicidad hasta un 85%. La viabilidad de las células no tratadas era más del 90% (Figuras 1A y B).
CIC de colon, cáncer de colon líneas celulares diferenciadas DLD-1, SW620, SW403, CDC#3 y#4 CDC fueron tratados con diferentes concentraciones de 5-FU o DXR durante 48 hrs. La citotoxicidad (% ± SD) se determinó por el grado de reducción de células viables con la capacidad de retener CFSE y excluir PI (CFSE
alta PI
-). Se muestra un experimento representativo de tres.
La quimioterapia sensibiliza a los AIC Colon Vγ9Vδ2 citotoxicidad de células T
En analogía a su resistencia a la quimioterapia, las cinco líneas probadas de colon CIC, fueron también resistente a Vγ9Vδ2 T citotoxicidad mediada por células, incluso cuando un E: se utilizó relación T de 50:1 (Figura 2A). La actividad citotóxica pobres contra los CIC de colon no era una característica intrínseca de las células Vγ9Vδ2 T, debido a que las líneas celulares de cáncer de colon diferenciadas DLD-1, SW620, SW403, CDC#3 y CDC#4 fueron asesinados de manera eficiente por dos líneas celulares Vγ9Vδ2 T COLD2 -1 y COLD2-2 obtiene a partir de dos pacientes de cáncer de colon diferentes (P#3 y P#4) (Figura 2A), así como líneas celulares de Vγ9Vδ2 T obtenidos a partir de sujetos sanos (datos no mostrados). Como control, todas las líneas de células T Vγ9Vδ2 examinado no logró matar a la línea de células de colon normal CCL-241 (Figura 2A).
(A) porcentaje de citotoxicidad de 2 a diferentes líneas celulares T Vγ9Vδ2, COLD2-1 y COLD2-2 obtiene a partir de 2 pacientes afectados por cáncer de colon, contra las células del cáncer de colon esfera de 5 pacientes diferentes (CIC#1 a#5 CIC), líneas celulares de cáncer de colon DLD-1 diferenciadas, SW620, SW403, CDC#3 y CDC#4, y la línea celular normal del colon CCL-241, a una relación e: T de 50:1. (B) Tres CICs de colon diana diferentes (CIC#2, CIC#4 y CIC 5 #) tratada con o sin cualquiera de 5-FU (2,5 a 250 mg /ml) o DXR (0,025 a 2,5 M) durante 48 horas se ensayaron por su sensibilidad a 2 diferente de líneas de células T, Vγ9Vδ2 COLD2-1 y COLD2-2 obtenidos a partir de 2 pacientes afectados por cáncer de colon y usados en una proporción e: T de 20:01. Los resultados indican la citotoxicidad de dianas tumorales siguientes 6 horas de co-cultivo con líneas de células T Vγ9Vδ2. Los datos son la media ± SD porcentaje de 5 experimentos diferentes, cada uno llevaba a cabo por triplicado.
En estudios anteriores, hemos demostrado que el zoledronato sensibiliza a los CIC de cáncer de colon a Vγ9Vδ2 citotoxicidad de las células T [27]. Posteriormente, se evaluó la capacidad de las células T Vγ9Vδ2 para matar a los CIC de cáncer de colon después del tratamiento de las dianas con la quimioterapia. Los resultados representativos obtenidos con tres líneas diferentes de la CIC (CIC#2,#4 y CIC CIC#5) se muestran en la Figura 2B. citotoxicidad de las células T Vγ9Vδ2 se mejoró en todos los casos por el pre-tratamiento de los CIC diana con quimioterapia. En detalle, la lisis casi completa de las líneas de la CIC el resultado de la combinación de las dosis más altas de 5-FU (250 mg /ml) o DXR (2,5 M) y las células Vγ9Vδ2 T, con porcentajes de muerte celular más de 90% a una E: T relación de 20:01. Tratamiento de objetivos con dosis más bajas de quimioterapia (2,5 y 25 mg /ml 5-FU y 0,025 y 0,25 M DXR) resultó en mayor eliminación de líneas de CIC por células Vγ9Vδ2 T, lo que indica que las células de quimioterapia y Vγ9Vδ2 T tienen aditivo actividad incluso cuando se utiliza a dosis subóptimas.
la quimioterapia favorece la expresión de DR5 (TRAIL-R2) expresión del receptor de muerte en los CIC
Para descifrar los mecanismos moleculares detrás de la quimioterapia de sensibilización mediada por la AIC a Vγ9Vδ2 células T citotoxicidad, nos hemos centrado en la expresión de ARNm que codifica para las moléculas conocidas por ser ligandos para receptores activadores clave sobre las células Vγ9Vδ2 T y receptores de muerte, antes y después de la exposición de los CIC para los agentes de quimioterapia. Como se muestra en la Figura 3, todas estas moléculas se expresaron constitutivamente en CICs, aunque la expresión varió constantemente entre diferentes líneas de la CIC; Sin embargo, no se observaron diferencias importantes en todas las líneas de la CIC probados para HLA de clase I, ICAM-1, CD155, CD112, MICA /B y la expresión ULPBP1-4 antes y después de la exposición a los agentes de quimioterapia.
RT- PCR de la expresión de mRNA de codificación para diferentes moléculas de la superficie en CICs de colon tratados con o sin cualquiera de 5-FU (25 mg /ml) o DXR (0,25 M) durante 48 hrs. Los datos representan los valores medios ± SD de 4 experimentos independientes, cada uno realizado con esferas de cáncer de colon de 5 pacientes diferentes (CIC#1 a#5 CIC).
La expresión de Fas (CD95), TNF R1, DR4 (TRAIL-R1) y DR5 (TRAIL-R2) receptores de muerte se incrementó en la mayoría de las líneas de la CIC tras la exposición a agentes quimioterapéuticos (Figura 3), pero aumentó la expresión de Fas, TNF-R1 y DR4 no alcanzaron estadística significado. El aumento más grande y significativa sólo se observó para la expresión de DR5 después de la exposición de CICs a 5-FU y, aunque en menor medida, DXR (Figura 3). Upregulation de DR5 siguiente 48 horas la exposición de CICs de colon a la quimioterapia se confirmó mediante citometría de flujo tras tinción con mAb específico (Figura 4).
CICs de colon fueron tratadas con medio, 5-FU (25 mg /ml) o DXR (0,25 M) durante 48 horas, se lavaron extensamente y teñidas con anti-DR5 mAb. La citometría de flujo histogramas muestran DR5. La media de intensidad de fluorescencia (MFI) para la tinción DR5 se indica en la esquina superior derecha de cada panel. Las líneas de puntos representan mAb de control de isotipo, mientras histograma lleno de grises representan anti-DR5 mAb.
La matanza de los AIC tratados con quimioterapia por Vγ9Vδ2 células T está mediada por TRAIL NKG2D y
T Vγ9Vδ2 células explotan diferentes vías para la destrucción de células tumorales que dependen de la secreción de citoquinas proinflamatorias y moléculas pro-apoptóticos o en la lisis celular dependiente del contacto a través de interacciones NK-similares o TCR-dependientes [9]. Se evaluaron los mecanismos responsables de la muerte de CICs quimioterapia sensibilizados por las células Vγ9Vδ2 T, mediante el bloqueo de forma individual TCR o receptores NKG2D. Citotoxicidad de de colon líneas CIC quimioterapia pretratados por dos líneas de células Vγ9Vδ2 T diferentes fue significativamente inhibida por los anticuerpos anti NKG2D mAb, mientras que el Vγ9Vδ2 TCR parece jugar un papel menor como se indica por la falta de anti-CD3 y γδ anti-pan TCR mAbs para inhibir la citotoxicidad (Figura 5). Además, la eliminación de células T Vγ9Vδ2 de objetivos de quimioterapia sensibilizados se evaluó en presencia de mevastatina, que inhibe la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA y evita la acumulación de zoledronato mediada de phosphoantigens endógenos como IPP. Mevastatina no inhibir matanza de todos los de colon líneas CIC quimioterapia pretratados probados por dos líneas de células Vγ9Vδ2 T alogénicas diferentes (Figura 5), lo que indica que la sensibilización inducida por la quimioterapia de CICs a la citotoxicidad de células Vγ9Vδ2 T no se basa en la producción de metabolitos de mevalonato.
la línea de células T Vγ9Vδ2 COLD2-1 se cultivó con dos CICs tratados con quimioterapia de colon (CIC#3 y CIC 5 #) en una relación e: T de 20:01, en presencia de anticuerpos bloqueantes a el TCR γδ, CD3, NKG2D, o en presencia de mevastatina. los niveles de citotoxicidad específicos logrados por la línea de células T Vγ9Vδ2 COLD2-1 fueron 65 ± 11 para CIC#3 y 71 ± 9 para CIC#5. Los datos son la media ± DE de dos experimentos realizados por triplicado. El porcentaje de inhibición con anticuerpos anti-NKG2D mAb fue significativamente diferente de los valores en todos los demás grupos (* p & lt; 0,001).
A fin de dilucidar los mecanismos de la matanza de los CIC de colon quimioterapia sensibilizados por las células T Vγ9Vδ2, inhibimos individualmente la exocitosis de gránulos, TNF-α-, TRAIL, y las vías de FasL mediada. experimentos matar-inhibición revelaron que Vγ9Vδ2 T citotoxicidad de las células de cáncer de colon quimioterapia pretratadas con los objetivos de la CIC se inhibió significativamente por anti-DR5 mAb, mientras que los mAb contra DR4, TNF-α, y FasL, o el tratamiento con CMA para bloquear la vía gránulo exocitosis, todos fallaron para inhibir. La figura 6 muestra datos representativos con dos líneas de células T y Vγ9Vδ2 las líneas CIC dos colon, CIC CIC#2 y#4.
La línea de células T Vγ9Vδ2 COLD2-1 se cultivó con dos CICs de colon tratados con quimioterapia ( CIC#3 y#5 CIC) a una relación e: T de 20:01, en presencia de anticuerpos bloqueantes a TNF-α, FasL (CD95L), TRAIL receptores R1 (DR4) o R2 (DR5), o concanamycin a (CMA). los niveles de citotoxicidad específicos logrados por la línea de células T Vγ9Vδ2 COLD2-1 fueron de 61 ± 7 para CIC#3 y 65 ± 12 para CIC#5. Los datos son la media ± SD de los experimentos llevados a cabo por triplicado. El porcentaje de inhibición con anticuerpos anti-DR5 y anti-TRAIL mAbs fueron significativamente diferentes de los valores en todos los demás grupos (* p & lt; 0,001).
Discusión
Se emergiendo que el cáncer es generada por una población de células que muestran características stemness, células madre de cáncer con nombre o iniciadoras del cáncer células (AIC) [1], [2]. Estas células, que contribuyen únicamente a una pequeña fracción de la masa total del tumor, se someten a expansión a largo plazo con la retención de su capacidad para reproducir el fenotipo tumoral original, proporcionando así pruebas de auto-renovación y la capacidad iniciadoras del tumor [1], [ ,,,0],2]. La población CIC es más resistente que diferenciarse células primarias a la quimioterapia convencional y radioterapia y terapias innovadoras putativo tales como los basados en el uso de TRAIL. Este refractariedad se ha atribuido al hecho de que los AIC expresan genes de resistencia a múltiples fármacos, incluyendo altos niveles de proteínas anti-apoptóticas y ABC (ATP Binding Cassette) transportadores que bombean los fármacos, sino también al hecho de que los objetivos de quimioterapia división de las células y por lo tanto no puede matar al lento ciclismo CIC [3] - [5].
los datos de estudios clínicos recientes han sugerido que la combinación de quimioterapia con la inmunoterapia tiene beneficios de supervivencia que la quimioterapia sola [6], [29], como se describe, por ejemplo, por la combinación de quimioterapia y anticuerpos monoclonales [30] - [32]. Por otra parte, se sabe que los fármacos quimioterapéuticos pueden sensibilizar células tumorales a la citotoxicidad mediada por CD8, NKT o células Vγ9Vδ2 T [33] thorugh varios mecanismos diferentes [34]. Sin embargo, recientemente hemos encontrado que los CIC de colon son resistentes a la citotoxicidad celular Vγ9Vδ2 T, a menos que se sensibilizan con zoledronato [35]: Del mismo modo, hemos probado la posibilidad de que los fármacos quimioterapéuticos utilizados actualmente en el tratamiento de cáncer de colon también puede sensibilizar a los CIC de colon para la eliminación de células T Vγ9Vδ2.
las pruebas iniciales de citotoxicidad reveló que en analogía con los resultados previamente reportados [27], muchos de colon líneas CIC fueron resistentes a la actividad citotóxica de las células T Vγ9Vδ2, pero el tratamiento previo con baja, subletal concentraciones de fármacos quimioterapéuticos 5-FU y DXR sensibiliza objetivos de la CIC a la eliminación de células T Vγ9Vδ2, resultando en efectos aditivos citotoxicidad.
Vγ9Vδ2 células T interactuar con y matar a dianas tumorales thorugh de varios mecanismos diferentes, incluyendo exocitosis de gránulos, receptor de muerte /ligandos interacciones con el TNF, TRAIL y FasL, y TCR o el reconocimiento de phosphoantigens o moléculas de estrés inducible mediada por NKG2D, respectivamente. Todos los de colon probado líneas CIC expresadas constitutivamente ARNm que codifica para HLA de clase I, ICAM-1, CD155, CD112, MICA /B, ULPBP1-4, Fas (CD95), TNF-R1, DR4 (TRAIL-R1) y DR5 (TRAIL -R2) moléculas en su superficie, pero la expresión de todas estas moléculas no rinda CICs sensibles a la muerte celular Vγ9Vδ2 T. Sin embargo, la exposición de los CIC de colon a 5-FU y, aunque en menor medida DXR, aumentó significativamente la expresión de DR5.
Varios informes publicados previamente en la literatura han demostrado que muchos fármacos quimioterapéuticos, incluyendo 5-FU y DXR , regular positivamente la expresión de DR5 en líneas celulares tumorales de origen distinto del tejido [36] - [42]. Sin embargo, este efecto se ha informado sobre las células cancerosas diferenciadas, mientras que, a nuestro conocimiento, no existe evidencia de similares upregulation DR5 en CICs. Ya sea o no inducida por quimioterapia DR5 upregulation se limita a CICs colon o es un fenómeno general observada en otro CICs es en realidad en estudio.
Sin embargo, encontramos que las células T Vγ9Vδ2 explotados diferentes mecanismos para matar a los objetivos de la CIC, que eran estrictamente dependiente de la forma de la meta CIC sensibilización. Independientemente de si los fármacos quimioterapéuticos o zoledronato se utilizaron para sensibilizar a los AIC, las células T Vγ9Vδ2 matanza de estos objetivos fue TCR o NKG2D mediada: consistente con nuestro informe anterior [27] CIC de colon quimioterapia sensibilizados murieron tras el reconocimiento mediada por TRAIL y NKG2D /DR5 interacción, mientras que los dos mecanismos son prescindibles para la citotoxicidad de los CIC de colon zoledronate sensibilizadas, que murieron casi exclusivamente por la interacción mediada por el TCR y la vía perforina /granzima.
los estudios anteriores han puesto de relieve la importancia de NKG2D -MICA interacciones /B para el reconocimiento de células tumorales y la actividad citotóxica efectiva de células T Vγ9Vδ2 [35] - [44]. La diferencia entre el reconocimiento mediada por NKG2D de CICs de colon de quimioterapia sensibilizados y reconocimiento mediada por TCR de los objetivos de la CIC zoledronato sensibilizadas no se puede explicar la expresión diferencial de MICA /B o ULBPs ya que ni 5-FU ni DXR cambiaron constitutivos niveles de expresión de estas moléculas. Es probable que phosphoantigens producción /expresión de los CIC de colon es muy baja, por debajo del umbral requerido para el reconocimiento eficiente por parte del reactivo Vγ9Vδ2 TCR, por lo tanto, orientar el reconocimiento sólo se produce a través de NKG2D: El hallazgo de que los CIC de colon se vuelven sensibles a la citotoxicidad celular Vγ9Vδ2 T en el momento de la exposición a zoledronato [27], lo que aumenta la acumulación phosphoantigen y la producción, apoya esta posibilidad.
Llegamos a la conclusión de que
in vivo
activación de las células T o Vγ9Vδ2 transferencia adoptiva de
ex vivo
Vγ9Vδ2 células T activadas con, junto con o poco después de la administración de ciertos fármacos quimioterapéuticos puede aumentar considerablemente sus efectos anti-tumorales. por tanto, se necesitan estudios clínicos adicionales para valorar la eficacia de esta terapia combinatoria, posiblemente incluyendo el enfoque inmunoterapéutico basado en células novela γδ T que
ex-vivo
expansión de las células T delta gamma policlonales seguido de la introducción de un-CD19 específica receptor de antígeno quimérico hacerlos biespecífico y más eficiente en homicidio de CD19
+ líneas de células tumorales
in vitro Opiniones y en xenoinjertos [45].
Materiales y Métodos
muestras de sangre periférica y el cáncer de colon se obtuvieron
las células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMC) y tejidos de cáncer de colon, de acuerdo con las normas éticas del comité institucional de la experimentación humana de los pacientes sometidos a una resección de colon para el adenocarcinoma de colon. El diagnóstico histológico se basa en las características microscópicas de células de carcinoma que determinan el tipo histológico y grado. PBMC se aislaron de pacientes con cáncer de colon por centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y se crioconservaron en 80% RPMI 1640 (Life Technologies, Monza, Italia), 10% de DMSO (Sigma, St. Louis, MO) y el 10% inactivado por calor suero de ternera fetal (FCS, Life Technologies).
de acuerdo con las normas italianas (artículo 13 del Decreto Legislativo n. 196/03), este estudio no requieren autorización del local, comité de ética. El estudio se realizó de acuerdo a los principios de la Declaración de Helsinki y todos los individuos dieron por escrito el consentimiento informado para participar.
Purificación y Cultura de los CIC
cáncer de los tejidos se lavaron extensamente en tampón salina que contiene antibióticos y se incubaron durante la noche en DMEM /F12 (Life Technologies) que contenía penicilina (500 UI /ml), estreptomicina (500 mg /ml) y anfotericina B (1,25 g /ml) (Life Technologies). La digestión enzimática se realizó utilizando colagenasa (Life Technologies, 1,5 mg /ml) e hialuronidasa (Sigma, 20 mg /ml) en DMEM que contenía antibióticos /antimicóticos durante 1 hora. células recuperadas fueron cultivadas en medio libre de suero (DMEM /F12) suplementado con 6 mg /ml de glucosa, 1 mg /ml de NaHCO3, mM HEPES 5, 2 mM L-glutamina, 4 mg /ml de heparina, 4 mg /ml de BSA , 10 ng /ml βFGF, 20 ng /ml de EGF, 100 mg /ml apotrasferrin, 25 mg /ml de insulina, 9,6 mg /ml putrescina, 30 nM anhidro selenito de sodio y 20 nM de progesterona (Sigma) a una concentración final de 3 × 10
5 células /ml. Estas condiciones de cultivo seleccionar las células tumorales inmaduras que proliferan lentamente, dando lugar, dentro de los 2-3 meses, a los agregados de células tumorales, llamadas "esferas". células formadoras de esfera se pueden propagar por la disociación enzimática de las esferas (EDTA 3 mM, 50 nM de DTT en PBS), seguida por la re-recubrimiento de las células individuales y pequeños agregados de células residuales en medio libre de suero reciente [28], [46] , [47].
tumorigenicidad se evaluó por implantación subcutánea de células de cáncer de colon esfera desglosados o células diferenciadas derivadas de esfera [27]. células de cáncer de colon líneas diferenciadas DLD-1, SW620 y SW403 (American Type Culture Collection) se obtuvieron del Dr. Ruggero De Maria ( "Regina Elena" Instituto Nacional del Cáncer, Roma, Italia) y se mantuvieron en DMEM que contienen antibióticos y 10% de FCS . Todos los cultivos celulares se realizaron a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora humidificada.
Agentes
antitumorales, anticuerpos y reactivos
El agentes quimioterapéuticos 5-fluorourcil (5 -FU) y doxorrubicina (DXR) se obtuvieron de Sigma, a través de la farmacia del hospital Universitario. Los fármacos se diluyeron en DMSO y se diluyeron a las concentraciones requeridas en PBS antes de su uso
Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con FITC,, PE-, PE-Cy5 o APC-conjugados (mAbs):. Contra -TCR Vδ2 (B6, BD Biosciences, San José, CA), anti-NKG2D (1D11, eBioscience, San Diego, CA), anti-CD95L (2C101, Biochem Vinci, Florencia, Italia), anti-MICA /B (6D4 , BD Biosciences)
además, también se utilizaron los siguientes mAbs purificados:. anti-CD3 (bloqueo, MEM-57), anti-HLA clase I monomórfica (MEM-147) a partir de Prof. Vaclav Horejsi (Instituto de Genética Molecular, Praga, República Checa), anti-TCR γδ sartén (IMMU510, un regalo del Dr. Marc Bonneville, Instituto de Biología, Nantes, Francia), anti-TNF-α (infliximab, un regalo del profesor Giovanni Triolo , Dipartimento Bio-Medico di Medicina Interna e Specialistica, Università di Palermo, Palermo, Italia), los receptores de anti-TRAIL TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), TRAIL-R3 (LIT, DcR1) y TRAIL-R4 (TRUNDD , DcR2) todo ello proporcionado por el Dr. Henning Walczak (Unidad de Inmunología tumoral, División de Medicina del Imperial College de Londres, Reino Unido).
concanamycin A (CMA) y mevastatina fueron adquiridos de Sigma, mientras que el zoledronato fue de Novartis Pharma, Basilea, Suiza.
líneas celulares Generación de anticuerpos policlonales Vγ9Vδ2 T
líneas de células T policlonales Vγ9Vδ2 se generaron por primera enriquecimiento de PBMC utilizando un kit de aislamiento de células T γδ (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), seguido por clasificación de células T Vγ9Vδ2 individuales a través de un FACSAria (BD Biosciences) con mAbs específicos. Las células (2 × 10
3) fueron cultivadas en cada pocillo de fondo redondo, placas de 96 pocillos que contiene 2 × 10
4 irradiadas (40 Gy) alogénico de PBMC, 2 × 10
3 irradiado ( 70 Gy) células B alogénicas transformadas con EBV, 0,5 mg /ml de PHA (Sigma), y 200 U /ml de interleucina 2 recombinante (Proleukin, Novartis Pharma). líneas de crecimiento se ampliaron en 200 U /ml de IL-2 y se volvieron a estimular cada 2 semanas. Por lo general, se recogieron las células después de 4-6 semanas de cultivo que se utilizará para los ensayos funcionales
in vitro
.
Ensayo citotóxico
Objetivo de colon CIC (10
5 cellsml) fueron pre-tratados con 5-FU (2,5 a 250 mg /ml), DXR (0,025 a 2,5 M) o zoledronato (0,5 M) durante 24, 48 o 72 horas. Las células se lavaron extensamente en PBS y se tiñeron con CFSE (Merck, Milano, Italia) como sigue: se añadieron 50 l de CFSE a 1 ml de suspensión de células esfera objetivo (5 x 10
5 células /ml) en PBS para obtener la concentración final de 2,5 M CFSE. Las células se incubaron durante 10 minutos a 37 ° C y se mezclaron suavemente cada 5 min. Al final de la incubación, se añadió 1 ml de FBS a la suspensión celular para detener la reacción de tinción y las células se centrifugaron a 600 g durante 5 min a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con PBS frío y se resuspendieron en medio libre de suero.
líneas celulares Vγ9Vδ2 T se volvieron a suspender a las concentraciones finales de 10
6 y 2,5 × 10
6 células /ml, se añadieron a los CIC de colon objetivo marcadas con CFSE (1 × 10
5 ) y co-cultivos se mantuvieron durante 6 horas a la 37 ° C en presencia de 5% de CO
2. Al final del periodo de incubación, las células se lavaron con PBS y se tiñeron con 20 l de yoduro de propidio (PI, Sigma, 1 mg /ml) durante 10-15 min en hielo. Finalmente se añadieron 100 l de PBS frío antes de la adquisición en un citómetro FACSCalibur (BD Biosciences). El cálculo de la actividad citolítica se basó en el grado de reducción de las células diana viables con la capacidad de retener CFSE y excluir PI (CFSE
alta PI
-), de acuerdo con la referencia [27]
los agentes de bloqueo se utilizaron para evaluar los mecanismos de Vγ9Vδ2 T citotoxicidad mediada por células de CICs colon. Para evaluar la contribución de mevalonato metabolitos células diana tumorales fueron tratadas con mevastatina (25 M durante 2 h) un inhibidor de aguas arriba selectiva de la vía del mevalonato. Después de este período de incubación, se lavaron las células diana, y las células T Vγ9Vδ2 añaden en presencia de 25 mevastatina mu M, para mantener una concentración constante de este fármaco durante la incubación debido a que su efecto es rápidamente reversible [27]. Para inhibir la citotoxicidad mediada por perforina, las células Vγ9Vδ2 T se incubaron con concanamicina A (CMA, 15 nM) durante 30 min a 37 ° C antes de co-cultivo con CICs objetivo, sin lavado adicional [27]. Para bloquear las vías citotóxicos relevantes, se utilizaron mAbs específicos o de control de isotipo a una concentración final 10 mg /ml justo antes de ensayo de co-incubación [27].
cuantitativa en tiempo real RT-PCR