Extracto
específicos de tumores vectores adenovirales comprenden un área de investigación fructífera basada en los genes de imágenes de diagnóstico y terapia para la etapa avanzada de cáncer, incluyendo enfermedad metastásica. Sin embargo, la traducción clínica de vectores virales se ha encontrado con obstáculos considerables, debido en gran parte a respuestas inmunes del huésped contra el virus. Aquí, hemos explorado la utilización de un inmunosupresor, rapamicina, para eludir la inmunidad anti-adenovirus en modelos murinos de cáncer de próstata inmunocompetentes. La rapamicina disminuida respuesta inmune aguda-adenoviral inducida por la inhibición de la activación de NF-kappa B; sino que también reduce la escala y el retraso en el inicio de la secreción de citoquinas inflamatorias. Además, encontramos que la rapamicina abrogó la producción de anticuerpos anti-adenovirus y retardó la función de las células mieloides y los linfocitos que se activan tras la administración viral en huéspedes pre-inmunizado. Por lo tanto, la co-administración de rapamicina prolonga y mejora la expresión transgénica de adenovirus-entregado
in vivo
, y con ello aumentada la capacidad de imagen de vectores adenovirales en ambos bioluminiscentes y positrones modalidades de tomografía por emisión. Por otra parte, hemos demostrado que a pesar de una excelente respuesta de las células cancerosas a un vector de terapia génica citotóxica
in vitro
, sólo se observaron efectos terapéuticos mínimos
in vivo en ratones
pre-inmunizado. Sin embargo, cuando se combinaron la terapia génica con la inmunosupresión transitoria, se logró la detención del crecimiento tumoral completa. En general, la inmunosupresión transitoria por la rapamicina era capaz de aumentar la utilidad de diagnóstico y terapéuticos potenciales de vectores adenovirales
Visto:. Jiang ZK, Johnson M, Moughon DL, J Kuo, Sato M, L Wu (2013) Mejora rapamicina mediada por adenovirus cáncer de imagen y terapia de pre-inmunizados anfitriones murinos. PLoS ONE 8 (9): e73650. doi: 10.1371 /journal.pone.0073650
Editor: Maria G Castro, Universidad de la Escuela de Medicina de Michigan, Estados Unidos de América
Recibido: 31 de mayo de 2013; Aceptado: July 19, 2013; Publicado: 2 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Jiang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de Instituto Nacional del cáncer otorga a RO1CA101904 LW. ZKJ es apoyado por la Universidad de California en Los Ángeles beca predoctoral (UCLA) CMCA y comunión UCLA Disertación año. DLM fue apoyada por el Programa de Investigación del Cáncer del Departamento de Defensa de ovario; MJ y DLM fueron apoyados por becas de formación de Biología de Células Tumorales (T32-CA009056). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los vectores adenovirales (ADS) son ampliamente utilizados como
in vivo
agentes de liberación de genes en los entornos en preclínicos y clínicos, tanto en el cáncer de diagnóstico y fines terapéuticos [1,2]. Recientemente, nuestro grupo ha demostrado la capacidad de Anuncios para detectar específicamente la metástasis del cáncer después de la administración viral-linfática dirigida o sistémica [2,3]. A pesar de estos resultados alentadores en modelos animales, varios obstáculos deben superarse antes de la implementación de anuncios en aplicaciones clínicas, siendo las respuestas inmunes del huésped contra Ad el obstáculo más formidable (por [4]). Estudios anteriores con roedores y primates no humanos han demostrado que el Ad sistémicamente inyectado (serotipo 5) predominantemente localizada en el hígado e infectado células de Kupffer, células endoteliales y hepatocitos [5-7]. la infección con Ad de estas células y las células dendríticas (DC) esplénicas inicia una avalancha de citocinas y quimiocinas inflamatorias caracterizadas por la inducción temprana de la interleucina (IL) -1 y el factor de necrosis tumoral (TNF) -α [8,9] seguido de IL-2 , IL-6, proteína inflamatoria de macrófagos-2 (IL-8), regulado y células T normales expresadas y secretadas (RANTES), IL-12 e interferón (IFN-γ) [10-15]. Estos factores a su vez podrían reclutar y activar células efectoras incluyendo neutrófilos, monocitos, células polimorfonucleares y V
α14 invariante asesinas naturales (NK), lo que podría conducir a los tejidos (principalmente hepático) daños y descarga aséptica e incluso la muerte [16-18 ].
Mientras Ad incurre insultos inflamatorios sobre los hosts mediante la activación de las reacciones inmunes innatas [5,7,19], el sistema inmune adaptativo, también puede anular el virus y las células transducidas de forma viral que afecte a la eficacia de los basados en Ad imágenes y enfoques terapéuticos [18,20,21]. Además, la mayoría de la población humana posee anticuerpos anti-Ad debido a la exposición a este patógeno ubicuo; En consecuencia, la administración repetida de vectores de Ad haría cebar la expansión de las células de plasma-Ad específico, lo que lleva a la secreción vigorosa secundaria de anticuerpos y el aclaramiento viral posterior, la reducción de la biodisponibilidad del vector y la potenciación de toxicidad para el huésped [12,20]. Además, las células que expresan transgenes se encontrarán con aclaramiento inmune mediada por células [22 a 24]. En particular, dicha eliminación no se limita a Ad dirigida inmunidad, pero puede ser también asociado con el transgén extraño introducido si el producto génico es inmunogénica [19]. Como la mayoría de los genes de imágenes y terapéuticos son exógenos al sistema principal, este problema inmunogenicidad constituye un reto importante para el logro de resultados positivos de diagnóstico basado en Ad y la terapia génica.
En este estudio, se adoptó un inmunosupresor aprobado por la FDA, rapamicina (RAPA), para evaluar el valor de la inmunosupresión transitoria para conciliar estos conflictos entre el anuncio y el sistema inmune del huésped. RAPA se une a FKBP12 (FK proteína 12 de unión) e inhibe la actividad de la mTOR quinasa complejo 1, una enzima complejo vital para una amplia gama de funciones celulares requeridas para células que proliferan rápidamente [25,26]. RAPA dificulta la progresión del ciclo celular (G1 /S), la proliferación, activación y diferenciación de linfocitos T y B provocado en respuesta a una variedad de estimulantes, así como la respuesta de las DC y otras células inmunitarias innatas a las señales inflamatorias [27-30]. Además, RAPA exhibe apreciable anti-angiogénesis y anti-cáncer [20,31]. En este estudio, mostramos que la rapamicina disminuyó con éxito la respuesta inmune innata y adaptativa Ad-asociado en huéspedes inmunocompetentes usando dos cepas de ratones inmunizados previamente. La estrategia tomada aquí podría servir como una plataforma para mejorar el perfil de seguridad y eficacia de la expresión del transgen para Ad mediada por imágenes moleculares y terapias.
Materiales y Métodos
Cultivo celular, adenovirus y drogas
líneas celulares de cáncer de próstata murinos RM-9 (una especie de regalo del Dr. Timothy C. Thompson, Baylor College of Medicine [32]) y MycCaP (una especie de regalo del Dr. Charles Sawyers [33]) se cultivaron en DMEM medio que contiene 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina /estreptomicina. Intraperitoneal (i.p.) dosis de rapamicina (LC Laboratories, Woburn, MA) se disolvió en DMSO estéril y se utilizó a las concentraciones indicadas. aplica por vía oral Rapamune se adquirió de Wyeth Pharmaceuticals Inc, Philadelphia, PA. Ganciclovir (GCV) (Cytovene-IV; Genentech, Roche grupo, South San Franscisco, CA) fue reconstituido con agua estéril, se diluye con solución salina estéril y se utiliza a 50 mg /kg /día para
in vivo
experimentos o dosis indicada por
in vitro
experimentos
serotipo Ad 5 vectores se construyeron sobre la base de un sistema AdEasy modificado -. el sistema AdNUEZ, en el que los transgenes se pueden colocar en la región E3 de múltiples sitios de clonación . La recombinación homóloga de pAdEZ y pShuttle se realizó en
E. Coli BJ5183
células competentes. clones virales se tamizan, se propagan, se purificó y se titularon como se describe anteriormente [3]. Todos los anuncios utilizados en este estudio son de replicación deficiente. El vacío del anuncio contiene E1 y E3-eliminan columna vertebral viral, sin transgenes. El título de todos los vectores de anuncios se determinó mediante ensayos de placa, por lo tanto, la unidad formadora de placa (UFP)
.
Para GCV
in vitro
ensayo de la susceptibilidad in, RM-9 y MycCap células fueron infectadas por el anuncio en multiplicidad de infección (MOI) de 100 y se trató con GCV desde el día 2 hasta el día 7 después de la infección (pi). La viabilidad celular se midió utilizando el Kit-8 Recuento celular (CCK-8) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Laboratorios Dojindo, Japón).
experimentos de respuesta inmune innata
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con el Comité Institucional Animal UCLA Cuidado y uso, conocido como Comité del Canciller de Investigación de Animales (ARC), directrices (ARC#2002-049-33; aprobado a través de 20.3.2014). ratones BALB /c de 4-5 semanas de edad (Taconic Farms, Germantown, NY) se les dio tratamiento oral diario de Rapamune (30 mg /kg; Wyeth, Madison, NJ) 3 días antes de la inyección intravenosa (i.v.) viral. Se recogieron muestras de suero de ratones y de citoquinas ELISA se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (de citoquinas de ratón ELISA kit, BD Biosciences). los tejidos del hígado de los ratones se lisaron y se sometieron a transferencia de Western. Conejo anti-I? B-α (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), actina anti-β (Sigma, St. Louis, MO), se utilizaron rábano picante anti-conejo y anti-ratón anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Santa Cruz) .
SCID y experimento comparativo animales inmunocompetentes
5-6 semanas de edad SCID macho y /C129 ratones BALB (Taconic Farms) fueron tratados con Rapamune al día por vía oral durante 3 días y luego se inyectaron intraprostatically con 2 × 10
8 PFU de luciferasa de luciérnaga (FL) anuncio expresando. La expresión de luciferasa se controló usando una cámara CCD enfriada IVIS (Xenogen, Alameda, CA). Las imágenes se analizaron con el software LivingImage IGOR-PRO (Xenogen).
experimento de imágenes PET
subcutánea
células RM-9 fueron implantados en el hombro derecho de ratones C57BL /6 macho (Taconic Farms), que, los 7 días más tarde, recibió solución salina oral o tratamiento Rapamune durante 4 días. 5 × 10
8 PFU anuncio sr39tk expresan a continuación, se inyecta por vía intratumoral y 6 días después, los ratones fueron sometidos a imágenes PET con
18 F-FHBG como se describe anteriormente [3]. Una sesión de imágenes CAT 10 minutos seguido de proporcionar información estructural.
imágenes de los experimentos en modelos pre-inmunizado
de 4 a 5 semanas de edad /6 y ratones C57BL FVB (Taconic Farms) se implantaron con RM-9 o MycCaP tumores, respectivamente. En ambos modelos, los animales fueron pre-expuestas a Ad mediante inyección i.p. inyección de 1 × 10
8 PFU del virus vacía. Tres semanas después de la exposición viral primaria, 2.5 × 10
5 células RM-9 o 3 × 10
6 células MycCaP entonces fueron implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de los animales en matrigel (1: 1 v /v; BD Biosciences). dosis indicada (por C57BL /6) o 5 mg /kg (por FVB) i.p. RAPA o diluyentes tratamiento comenzó cuando el tumor eran palpables (~ (5 mm)
3) y 3 días más tarde, los animales recibieron la inyección intratumoral de 1 × 10
8 PFU (por C57BL /6) o 5.42 × 10
8 PFU (por FVB) Anuncios FL-expresión. Los animales recibieron continuaron RAPA diaria o tratamiento diluyentes hasta el final del estudio. bioluminiscente de imágenes se llevó a cabo en los puntos de tiempo indicados como se describe anteriormente.
tinción inmunofluorescente
tumores subcutáneos fueron disecados y fijados en casete histología en 3% de paraformaldehído al 4
° C durante la noche. secciones de tumores incluidas en parafina (5 micras) se realizaron en el laboratorio de patología en la UCLA. Anti-F4 /80 (1: 500; Serotec, Raleigh, NC) y anti-CD31 (1: 300; BD Biosciences, Bedford, MA) anticuerpos fueron utilizados para teñir las secciones del tumor. Imágenes fueron tomadas con el microscopio Eclipse 90i de Nikon
La citometría de flujo de los tumores
tumores subcutáneos se disecaron y se disociaron por picar y físicamente tratamiento con colagenasa (Invitrogen, Carlsbad, CA;. 80 unidades /ml en medios DMEM que contenía 10% de FBS) a 37
° C durante 1,5 horas. células mieloides se definen por CD11b y CSF1R tinción mientras que los linfocitos se definen como CD11b- CD4 + o CD8 + CD11b-. Para hacer que la "estimulación" medio utilizado en el experimento de la reactividad de células T, 7,6 × 10
6 células MycCaP se infectaron con 3,8 × 10
7 PFU Ad FL-expresión; 36 horas más tarde, se recogieron las células en 200 l de tampón de lisis pasiva (Promega, Madison, WI), sometidos a tres ciclos de congelación-y-descongelación y se centrifugó. El medio de estimulación contenía 120 mg /ml de lisado celular y 3 × 10
7 UFP /ml de virus vacía. Las suspensiones celulares de tumores disociados fueron incubadas con simple o este medio de estimulación a 37
° C durante 3,5 horas. Todo citometría de flujo anticuerpos se compraron de BD Biosciences.
estudios terapéuticos
de 4 a 5 semanas de edad, los ratones FVB macho (Taconic Farms) fueron previamente expuestos a un anuncio por vía intraperitoneal inyección de 1 × 10
8 PFU del virus vacía. 3 semanas más tarde, 3 × 10
6 células MycCap se implantaron subcutáneamente en el flanco derecho de los animales en un 1: /v de la mezcla de PBS estéril y matrigel (BD Biosciences) 1 v. Los tumores se hicieron palpables (~ (5 mm)
3) cinco días más tarde y i.p. RAPA o diluyente se inició tratamiento durante cuatro días consecutivos. Los animales recibieron después de la inyección intratumoral de 6 × 10
8 PFU de control (FL) que expresan o terapéuticos anuncio. RAPA o tratamiento diluyente a continuación se continuó durante 7 días. 50 mg /kg /día GCV se administró a las cohortes terapéuticos a partir de día 1 después de la inyección viral. Los tumores se midieron por un calibre dos veces a la semana hasta el final del estudio. Los animales fueron sacrificados 30 días después de la implantación del tumor.
Anti-adenovirus valoración de anticuerpos
suero de ratón se obtuvo antes de la administración viral y en el punto final del estudio por sangrado retro-orbital, seguido de centrifugación en una centrífuga de sobremesa a 8000 revoluciones por minuto durante 10 minutos. Placas de 96 pocillos se recubrieron con 1,5 × 10
7 PFU /pocillo adenovirus en 100 l de tampón de carbonato de sodio (0,1 mol /L, pH 8,8) y se incubaron a 4
° C durante la noche. En el momento del ensayo, la solución viral se retiró y la placa se incubó con reactivo de bloqueo 6% (Roche, Indianapolis, IN) en 0,05% PBS-Tween a 37
° C durante 1 hora. diluciones seriadas de suero de ratón se realizó por duplicado y se incubaron a 37
° C durante 2 horas, seguido de 5 veces de lavado con 0,5% de Tween-PBS. biotina de cabra anti-ratón IgM y IgG (Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA) anticuerpos se utilizaron para incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora seguido de 5 tiempos de lavado. Estreptavidina-HRP (PerkinElmer, Boston, MA) y luego se utilizó para incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de lavados y el desarrollo con el sustrato TMB (Thermo Scientific, Rockford, IL). La densidad óptica de la placa se leyó entonces en 450 de longitud de onda nm. El título de anticuerpos anti-adenovirus se determinó como la dilución más alta a la que el suero post-viral tiene una lectura de 0,05 mayor que el suero pre-viral correspondiente.
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realiza utilizando desapareado o emparejado
t
prueba de dos colas. Para todos los análisis, P & lt;. 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
rapamicina disminución de la respuesta inmune innata Ad-suscitó
En función del tipo de célula diana y el mecanismo de entrada en la célula, la infección con Ad puede desencadenar un repertorio diverso de moléculas de señalización, incluyendo lípidos PI3K quinasa, la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), quinasa de adhesión focal-ERK1 /2, y las vías de JAK-STAT [4,5,8,11]. el factor nuclear (NF) -κB es un efector aguas abajo común para la activación de múltiples vías de señalización [8]. Nos preguntamos en primer lugar, al interrogar a la degradación de su inhibidor I? B, si RAPA podría disminuir la activación de NF-kB Ad-inducida. Se les inyectó solución salina o 1 × 10
9 UFP de ad vía intravenosa (i.v.) en el control de diluyente o ratones tratados con RAPA BALB /c, tejido hepático cosechado en los puntos de tiempo indicados y los sometieron a western blot. Como se muestra en la Figura 1A, Ad causó la degradación de I? B pronunciado (y por lo tanto la activación de NF-KB) a las 6 y 12 horas después de la inyección (p.i.); RAPA abrogó este efecto.
Diario
recibieron ratones BALB /c (A) rapamicina oral (30 mg /kg) o tratamiento con solución salina 3 días antes de la administración i.v. inyección de 1 × 10
9 PFU Ad-CMV-FL o solución salina. los tejidos del hígado de estos ratones se cosecharon a los puntos de tiempo indicados, se lisaron y se sometieron a western blot para examinar la degradación de I? B. β-actina se utilizó como control de carga. m1, m2 y m3: ratón 1, 2 y 3 en cada grupo en cada punto de tiempo. (B) Los sueros de estos ratones se recogieron a 1, 6 o 12 horas y los niveles de citoquinas se ensayaron por ELISA. Las barras de error: la media ± SEM (n = 3). ns: no significativo; *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001 por dos colas
t
prueba en comparación con Ad único grupo
Dado que la actividad de NF-kappa B está ligado a la transcripción de muchos factores inflamatorios, la. resultados en la Figura 1A sugirieron que RAPA podría mitigar eficazmente la tormenta de citocinas Ad-suscitó en los animales. Para seguir esta cuestión, se examinaron los niveles séricos de un panel de citocinas y quimiocinas de estos ratones. IL-1 y TNF-α se encuentran entre las primeras citoquinas que se activan por Ad; que conducen a la expresión de otros factores de aguas abajo y también transmiten señales al sistema inmunitario adaptativo [24]. IL-6 e IL-8 juegan un papel esencial en el reclutamiento de células efectoras, tales como neutrófilos, a hígado y están vinculados directamente a las lesiones hepáticas relacionadas con el anuncio; IL-10 es un regulador clave en el desarrollo de la inmunidad humoral [10,11,13,34]. Como se muestra en la Figura 1B, Ad aumentó notablemente TNF-α, IL-6, MKC (ratón de queratinocitos derivados de citoquinas, análoga a IL-8 humana), IL-10 e IL-12p70 secreción en 1 y 6 horas y IL -1β nivel 6 horas pi; RAPA significativamente bloqueado la inducción de estas citoquinas. Además, el inicio de la producción de IFN-γ se retrasó por RAPA de 6 a 12 horas pi. Por lo tanto, estos resultados sugieren que el tratamiento RAPA puede reducir la magnitud o retrasar la aparición de componentes de la tormenta de citocinas Ad-inducida.
La rapamicina potenciado la expresión del transgen Ad-entregado
expresión transgénica resistente y persistente es crucial para asegurar la eficacia diagnóstica y terapéutica de Anuncios. Por lo tanto, nos dispusimos a determinar el impacto del sistema inmune del huésped en la expresión del transgen Ad-mediada. Hemos inyectado luciferasa de luciérnaga (FL) expresando su anuncio en la próstata de inmunocompetentes BALBc /129 o ratones inmunodeficiencia combinada severa (SCID) y utilizamos imágenes
in vivo
bioluminiscente para controlar la expresión FL largo de 5 semanas. Como se muestra en la Figura 2A, tanto la duración y la magnitud de la expresión del transgen se redujeron en gran medida en BALBc /129 ratones que poseían funciones inmunes intactos en comparación con los ratones SCID. A continuación, pregunta si RAPA podría mitigar tales efectos inhibitorios presentados por el sistema inmune adaptativo anfitrión. Como el objetivo final de este estudio es facilitar la traducción clínica de Anuncios, examinamos si RAPA podría aumentar la imagen del cáncer Ad-mediada por el uso de la tomografía por emisión de positrones (PET), una técnica de imagen clínicamente relevante. El gen informador de formación de imágenes usado en este experimento es el HSV1-sr39tk, una forma variante mejorada de herpes simplex gen de la timidina quinasa del virus, y la sonda para este gen es su sustrato
18F-FHBG [35]. RM-9 tumores de próstata se implantaron en singénico, inmunocompetentes C57BL /6 ratones y los ratones portadores de tumores se trataron con vehículo o RAPA antes de la inyección de Ad-CMV-sr39tk intratumoral. El análisis de PET seis días después de la inyección viral reveló claramente aumentada-sr39tk específica
señal tumoral 18F-FHBG en los cuatro ratones en la cohorte tratada con RAPA; por el contrario, sólo un ratón en el grupo de control mostró señal débil (Figura 2B). Estos resultados indicaron que RAPA puede potenciar la expresión del transgen Ad-mediada en huéspedes inmunocompetentes, un buen presagio para la utilidad de la combinación de esta forma de inmunosupresión transitoria con diagnóstico por imagen Ad enfoques en contexto clínico
.
(A) 2 × 10
8 PFU prostático específico FL-expresando anuncio se inyectó de forma ortotópica en la próstata de inmunocompetentes BALBc /129 o ratones SCID inmunodeficientes. FL imágenes se realizó en los puntos de tiempo indicados después de la administración viral. barra de colores: los fotones /segundo /cm
2 /sr. (B) Hombre C57BL /6 ratones portadores de tumores subcutáneos RM9 se les dio solución salina o tratamiento rapamicina durante 4 días a partir de 7 días la implantación del tumor posterior. A continuación, 5 × 10
8 PFU anuncio sr39tk que expresan se inyectó por vía intratumoral. La PET se realizó 6 días después con
18 F-FHBG. tumores subcutáneos se indican con flechas rojas.
A fin de evaluar este fármaco combinado y el enfoque de la imagen molecular en escenarios clínicos relevantes, nos preguntamos si el efecto potenciador de RAPA se puede extender a los animales con preexistente contra -Ad inmunidad. Empleamos dos cepas de ratones inmunocompetentes, C57BL /6 y FVB, y los inmunizados con una dosis intraperitoneal (i.p.) de 1 × 10
8 PFU Ad vacío (línea de tiempo experimental se muestra en la Figura 3A). Este esquema de inmunización viral condujo al desarrollo de anticuerpos anti-Ad respuesta inmune humoral fuerte en estos ratones (Figura S1 en File S1). los tumores de próstata singénicas (RM-9 o MycCaP [36]) se establecen a continuación, por vía subcutánea 3 semanas después de la inmunización primaria viral. El modelo subcutáneo fue elegido sobre la ortotópico para este estudio inicial de prueba de director debido a la viabilidad práctica de la administración viral intratumoral, la evaluación del tamaño del tumor, así como la atenuación de las señales bioluminiscentes de los tumores más profundos prostáticos. Cuando los tumores se hicieron palpables (4-5 días para RM9; 5-7 días para MycCaP), i.p. diaria Se administró la inyección de RAPA o diluyente. 3 días más tarde, los animales recibieron la inyección intratumoral secundaria de FL-expresión de Ad (1 × 10
8 PFU para RM9; 5 × 10
8 PFU para MycCaP). bioluminiscente de imágenes se realizó para supervisar FL expresión. En el modelo de RM-9 tumor, alta (5 mg /kg), medio (1,5 mg /kg) y baja (0,5 mg /kg) se ensayaron dosis de RAPA; todas las dosis mayor expresión FL, el día 4 con relación a los ratones que recibieron el diluyente (control). La expresión del transgen desapareció el día 7 en los ratones de control, pero todavía era detectable en RAPA tratada cohortes (Figura 3B). En el modelo de tumor MycCaP compatible FVB, solamente 5 mg /kg RAPA fue probado; los ratones fueron seguidos por imagen durante 21 días. Como se muestra en la Figura 3C-D, RAPA aumentó el nivel de expresión FL, el día 4, y se extendió significativamente la persistencia del transgén durante al menos 21 días, que era el último punto de la prueba del tiempo. Tomados en conjunto, nuestros resultados demuestran que, incluso en el desafío de la inmunidad preexistente, RAPA puede aumentar la expresión del gen reportero de imágenes entregado-Ad y prolongar la ventana de diagnóstico. Estos datos también apoyan que los efectos facilitadores de la RAPA no son tumoral modelo- o específicos de la cepa de ratón.
(A) El plazo para los modelos pre-inmunidad. Los animales fueron cebados con una dosis intraperitoneal de 1 x 10
8 PFU Ad vacía y, 3 semanas más tarde, los tumores subcutáneos fueron inoculados. RM9 tumores se hicieron palpables 4-5 días después de la implantación; MycCaP tumores se hicieron palpables 5-7 días después de la implantación. En este punto, la rapamicina o el control del tratamiento iniciado y vectores de visualización de anuncios intratumoral se administró 4 días más tarde. rapamycin tratamiento diario se continuó hasta el final del estudio. FL bioluminiscente de imágenes se llevó a cabo en los puntos de tiempo indicados en B y C. (B) FL bioluminiscente de imágenes de ratones C57BL /6 RM-9 que lleva en el día 4 y 7. Alta: 5 mg /kg /día rapamicina; Medio: 1.5 mg /kg /día; Baja: 0,5 mg /kg /día. n = 3. (C) FL bioluminiscente de imágenes de MycCaP teniendo ratones FVB (n = 3 o 4) en los puntos de tiempo indicados. (D) La cuantificación de la señal de la imagen de la barra de C. El color de bioluminiscente de imágenes: recuento de fotones. Las barras de error: media ± SEM (n = 4 por sólo Ad; n = 3 para Ad + RAPA). * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0,01 por dos colas
t
prueba
La rapamicina suprime anti-Ad respuestas inmunitarias adaptativas
Para investigar más a fondo el mecanismo que subyace a efectos promotores de la expresión del transgen en RAPA anuncio en huéspedes inmunizados previamente, se examinó en primer lugar el título de anticuerpos anti-Ad en el suero de los ratones al final de los estudios previos. En el modelo de RM-9, tanto altas dosis RAPA medio y, pero no la dosis baja RAPA, impidió la producción secundaria de anti-Ad IgG en ratones C57BL /6 ratones pre-inmunizados (Figura S2 en File S1). Un ensayo con un tamaño mayor cohorte reveló que altas dosis de RAPA reduce los títulos de IgG de 1,36 ± 0,33 × 10
5 a la 9.88 ± 2.02 × 10
3 (P = 0,0021, dos colas
t
prueba ; n = 8) (Figura 4A). Del mismo modo, RAPA redujo punto final título de IgG en casi 3 veces mayor en los ratones inmunizados previamente FVB (P = 0,0368, dos colas pareada
t
prueba; n = 3 a 4) (Figura 4A). Estos datos son consistentes con estudios previos que muestran la inhibición de RAPA en la activación de células B provocada-Ad y la producción de IgG [20]. Es de destacar que nos hemos centrado en los títulos de IgG más IgM debido a la secreción de IgM precedió a la de IgG y fue de una magnitud menor en estos animales pre-inmunizado. Además, la exposición viral secundaria podría inducir el cambio de isotipo de IgG [37]. Sin embargo, Xu et al. informó recientemente los efectos inhibidores de anticuerpos IgM naturales en Ad transducción [38]; a la luz de estos resultados, se demostró que RAPA también exhibió efecto supresor sobre el nivel de IgM que podrían unirse al anuncio (Figura S3 en S1 Archivo).
(A) FVB y C57BL /6 ratones fueron tratados de acuerdo con el protocolo mostrado en la Figura 3A. muestras de suero de ratón se recogieron en el final del estudio y se sometieron a ELISA para la titulación de anticuerpos anti-Ad (FVB: medios de 3 ensayos independientes; *, P = 0,0368 por dos colas pareada
t
prueba C57BL /. 6: los datos representativos de 2 ensayos independientes (n = 10); **, P = 0,0021 por dos colas
t
prueba). Las barras de error: media + SEM. (B) tinción de inmunofluorescencia Representante de las secciones delgadas del RM-9 tumores con tratamiento indicado. Rosa, macrófagos marcador F4 /80; verde, los vasos sanguíneos marcador CD31; azul: DAPI. Barra de escala = 200 micras. (C) RM-9 tumoral de los grupos de tratamiento indicados se disocia y se sometió a análisis de citometría de flujo para las poblaciones de células mieloides y T. linaje de células mieloides se definió por la tinción de CD11b. Las barras de error: media ± SEM (n = 5). ns: no significativo; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001 en comparación con Ad único grupo de dos colas no apareada
t
prueba. (D) los tumores MycCaP de control o los animales de rapamicina tratados (n = 3) se recogieron a 1,5 cm de diámetro, disociado, y después se incubaron con los medios de fricción o medios que contienen adenovirus e infectado-Ad lisado celular MycCaP durante 3,5 horas a 37 ° C , teñidas con anticuerpos IFN-gamma intracelulares y se sometieron a citometría de flujo. la expresión de IFN-γ con la estimulación se normalizó a las correspondientes de control no estimulado (establecido como 100%). subconjuntos de células T se delinearon por CD4 y CD8 tinción. Las barras de error: la media ± SEM (n = 3). *, P = 0,0431 por no apareado
t
prueba de dos colas.
A continuación, hemos explorado el papel de RAPA en la modulación basada en células de inmunidad anti-Ad [26,28]. En concreto, se evaluó tanto la infiltración y la activación de las células inmunes en los tumores inyectados con Ad. En el modelo de RM-9, la tinción de inmunofluorescencia descubrió una mayor infiltración de macrófagos F4 80 /positivos provocados por la inyección de Ad. Sin embargo, la infiltración de macrófagos fue notablemente suprimida por RAPA (Figura 4B). A continuación, utiliza la citometría de flujo para lograr una mejor cuantificación de las poblaciones de células mieloides intratumorales (CD11b + /+) CSF1R. Consistente con los resultados de la tinción de inmunofluorescencia, el tratamiento RAPA disminuyó significativamente la infiltración mieloide en los tumores (Figura 4C, primero panel). En particular, las células que expresan factor estimulante de colonias-1 receptor (CSF1R), una molécula crucial para la diferenciación de los macrófagos, DC y otras monocitos mieloides derivados de [39], se han eliminado casi por completo por RAPA (Figura 4C, segundo panel) en estos tumor infiltración de células mieloides. Además, tanto maduro (CD69 +) y inmaduro (CD62L +) fenotipos de las células T CD4 + (CD11b- /CD4 +) se redujeron por RAPA (Figura 4C, tercera panel), lo que implica que tanto el reclutamiento y la activación de las células T CD4 + fueron impedidos. células CD8 + T citotóxicos (CD11b- /CD8 +) también parece ser reducida por RAPA (Figura 4C, el último panel) aunque el contenido de CD8 + de RM-9 tumores era muy baja, y por lo tanto difícil de medir con precisión. Curiosamente, en consonancia con otros informes [20], RAPA disminuyó la angiogénesis del tumor, como se refleja por tinción reducida del marcador de la vasculatura CD31 (Figura 4B), que ofrece otro posible mecanismo subyacente a la inhibición de la infiltración de células inmunes y la activación observada en este modelo de RAPA.
a continuación, hemos tratado de determinar si RAPA podría afectar la reactividad del tumor infiltrante células inmunes hacia Ad y Ad-infectadas, las células cancerosas que expresan transgenes. IFN-γ, una citoquina reguladora clave para el desarrollo de células T y la activación, se eligió como una lectura para la funcionalidad de las células inmunes. MycCaP tumores, establecidos en ratones con inmunidad previa al anuncio, como se indica en la figura 3A y C, se recogieron a 1,5 cm de diámetro y se disociaron de células individuales. Las células disociadas fueron incubadas con medio o con un cóctel "estimulación" compuesto de partículas adenovirales y lisado celular a partir de células infectadas con virus MycCaP FL-expresión. la producción de IFN-γ de células T tras la estimulación fue entonces evaluada por tinción intracelular y citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 4D, en la cohorte sin tratamiento RAPA (-, control), la estimulación mediada por Ad-resultó en un aumento del 35% de la expresión de IFN-γ en las células T CD4 + sobre la línea de base no estimulado (media normal); sin embargo, las células T de RAPA tratan los tumores no eran sensibles a estos estímulos. La reactividad de las células T CD8 + en los tumores raros MycCaP parecía ser inalterada por RAPA. En conjunto, la adición de RAPA con el protocolo de transferencia de genes tumor Ad-mediada por disminución de la infiltración de células mieloides y T inmunes en el ambiente del tumor; también embota la reactividad de células T hacia los estímulos relacionados con virus.
La rapamicina potenciada Ad-sr39tk /GCV terapia genética en ratones inmunizados previamente
A continuación se probó la capacidad de la rapamicina para aumentar Ad-mediada terapia génica suicida a través de la mayor herpes timidina quinasa del virus simplex (HSV-tk) de genes, sr39tk, y su profármaco ganciclovir (GCV) [40]. Para elegir un modelo adecuado para estudiar la terapia sr39tk /a base de GCV, se evaluó la susceptibilidad de las células RM9 y MycCap. Ambas líneas celulares se infectaron por los anuncios sr39tk que expresan a una multiplicidad de infección (MOI) de 100 y tratados por dosis indicadas de GCV del día 2 al día 7 pi. La viabilidad de las células RM9 no fue alterada por la expresión de sr39tk o la presencia de GCV, mientras que las células MycCap fueron sensibles a este tratamiento (Figura 5A). Por lo tanto, se selecciona el modelo MycCap; Por otra parte, el PSES-TSTA [3] promotor específico de la próstata exhibió robusta actividad transcripcional en células MycCap (Figura 5A y S4 en S1 de archivos) y por lo tanto, se va a utilizar en los siguientes experimentos terapéuticos.
(A ) las células MycCap y RM9 fueron infectadas por Ad-PSES-TSTA-sr39tk, Ad-CMV-sr39tk o no virus a una MOI = 100 y tratados por concentraciones indicadas de GCV del día 2 al día 7 pi. La viabilidad celular se midió por CCK 8 ensayo en días 7 y normalizado a la no-virus, condición GCV cero (la línea discontinua).