Extracto
El 2 proteínas (MDM2) minuto murino doble es un regulador clave de la proliferación celular y la apoptosis que actúa principalmente mediante la inhibición de la supresor de tumores p53. Del mismo modo, la PI3-quinasa (PI3K) /Akt es crítico para la supervivencia celular mediada por factor de crecimiento. Además, se ha informado de que AKT puede fosforilar y activar directamente MDM2. En este estudio, mostramos que el IGF-1 hasta regula los niveles de proteína MDM2 de una manera PI3K /AKT-dependiente. La inhibición de la mTOR por rapamicina o expresión de un negativo factor de iniciación eucariota dominante 4E proteína de unión 1 (4EBP1) proteína mutante, así como la ablación de eucariótica factor de iniciación 4E (eIF4E), suprime eficazmente IGF-1 mediada por la regulación de MDM2. Además, se muestra que la rapamicina inhibe la expresión efectiva MDM2 y sensibiliza las células cancerosas a la quimioterapia. Tomados en conjunto, este estudio revela un nuevo mecanismo por el que IGF-1 activa MDM2 a través de la vía de mTOR, y que la inhibición farmacológica de la mTOR en combinación con quimioterapia puede ser más eficaz en el tratamiento de un subconjunto de cánceres que albergan aumento de la activación MDM2.
Visto: Du W, Y Yi, Zhang H, J Bergholz, Wu J, Ying H, et al. (2013) La rapamicina inhibe la IGF-1 mediada por la regulación de MDM2 y sensibiliza a las células del cáncer a la quimioterapia. PLoS ONE 8 (4): e63179. doi: 10.1371 /journal.pone.0063179
Editor: Zhi-Min Yuan, Universidad de Texas, Centro de Ciencias de la Salud en San Antonio /Greehey CCRI, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de noviembre 2012; Aceptado: March 29, 2013; Publicado: 30 de abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Du et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH) subvenciones (CA79804) y por el Programa de Investigación básica National Key (973 programas) de China (2012CB910700) para ZX, y Estados subvención del Departamento de Defensa por el Congreso dirigido programas de investigación médica Unidos (W81XWH-10 -1 a 0161) para JB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la activación anormal de murino Minuto doble 2 (MDM2) se ha establecido como un importante factor causal en el desarrollo del cáncer humano. funciones de MDM2 como una ubiquitina ligasa E3 para facilitar la degradación de p53, un regulador clave para la proliferación celular, la apoptosis y senescencia en respuesta a las tensiones celulares, tales como daño del ADN y el estrés oncogénico [1]. La amplificación de la
MDM2
gen se ha observado en una variedad de tumores y cánceres humanos, incluyendo tumores de tejidos blandos, osteosarcoma, carcinoma de esófago y [2]. Notablemente, MDM2 se ha demostrado que poseen funciones oncogénicas independiente de p53 [3], [4]. El trabajo de nosotros y otros han demostrado que MDM2 puede dirigirse e inhibir la proteína retinoblastoma (Rb) a través del proteasoma mediada por la degradación [5], [6], [7], [8], [9]. MDM2 también se ha demostrado para formar complejos con y regular la estabilidad de proteínas y /o la actividad de un subconjunto de las proteínas implicadas en la proliferación celular y la muerte celular, incluyendo p73 [10], [11], E2F1 [12], p21 inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina [13], beta-arrestina, y acoplado a la proteína G del receptor de quinasa 2 (GRK2) [14], [15].
se ha demostrado que la proteína MDM2 y localización subcelular funciones son modulados por la PI3 -Kinase (PI3K) /Akt. AKT puede fosforilar directamente MDM2 en Ser166 y Ser188, facilitando así la translocación nuclear [16] y la degradación de p53, así como la interacción p300 [17], [18]. Además, la sobreexpresión de AKT se ha demostrado que MDM2 estabilizar la proteína [19]. Recientemente, AKT ha surgido como un regulador crítico de la diana mamífera de rapamicina complejo 1 (mTORC1). AKT inhibe el complejo TSC2 /TSC1, lo que lleva a la activación de mTORC1 [20]. Es importante destacar que la evidencia emergente sugiere que la actividad mTORC1 es fundamental para la función oncogénica AKT. De hecho, el crecimiento tumoral acelerado tras la activación constitutiva de AKT se invierte por la inhibición de mTOR [21]. De manera similar, los ratones que expresan AKT1 humana en la próstata desarrollan un fenotipo neoplásico, que está completamente abolida por la inhibición de mTOR [22]. Además, la inactivación de AKT conduce a la inhibición de la proliferación celular, que es dependiente de mTORC1 [23]. Estos estudios sugieren que la vía AKT-mTOR es crucial para el crecimiento de células tumorales
.
En este estudio, mostramos que el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) hasta regula la expresión de MDM2 a través de la AKT-mTOR camino. La inhibición de mTOR por la rapamicina, la expresión de una negativa del factor de iniciación eucariota 4E dominante proteína de unión 1 (4EBP1) mutante o el silenciamiento de 4E factor de iniciación eucariota (eIF4E) derogar de manera eficiente IGF-1 mediada por la regulación de MDM2. Además, se muestra que la rapamicina inhibe eficazmente la expresión de MDM2 y sensibiliza a las células cancerosas a la apoptosis inducida por fármacos quimioterapéuticos.
Resultados
IGF-1 induce la expresión de MDM2 de Manera dependiente de PI3K y no lo hace Alter MDM2 estabilidad de las proteínas o los niveles de mRNA en el estado estacionario
Hemos demostrado previamente que el IGF-1 modula la p21 inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina un impacto en la supervivencia celular a estrés genotóxico [24]. Dado que el IGF-1 es conocida por activar la vía PI3K /AKT, estábamos interesados en descifrar el papel de PI3K /AKT en la supervivencia celular de IGF-1 mediada. Como se muestra en la Figura 1A, IGF-1 el tratamiento de células U2-OS de osteosarcoma humano privadas de suero (p53 de tipo salvaje) llevó claramente a la activación de AKT, como se muestra por un aumento en la fosforilación de AKT. Notablemente, IGF-1 induce la expresión de proteína MDM2, como se muestra por un aumento de dos bandas de proteína MDM2 detectado por un anticuerpo específico-MDM2, SMP14, consistente con informes anteriores [6], [9], [25]. Este efecto de la IGF-1 en MDM2 fue bloqueada eficazmente por el tratamiento con LY294002, un inhibidor de PI3K selectiva [26], pero no por PD98059, un inhibidor de la MAP quinasa quinasa (MEK), o por SB203580, un inhibidor específico de estrés p38 proteína quinasa activada por [27]. Estos datos sugieren que el IGF-1 hasta regula la expresión de la proteína MDM2 a través de la cascada de señalización de PI3K-AKT.
(A) U2-OS células se privaron de suero durante 24 horas y luego pre-tratados con cualquiera PI3- quinasa (PI3K) inhibidor LY294002 (20 mM), MAP quinasa quinasa (MEK) inhibidor PD98059 (25 mM), o p38 proteína SB202190 inhibidor de la quinasa activada por estrés (10 M) durante cuatro horas, seguido de tratamiento con IGF-1 (50 ng /ml) durante seis horas. Las células se lisaron y se sometieron a análisis de transferencia Western. (B) células H1299 fueron suero de hambre mediante la incubación en ausencia de FBS durante 24 horas y se trataron con IGF-1 durante seis horas como se indica. Los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western. S: la exposición a corto; L:. La exposición a largo
Dado que ya hemos demostrado que el IGF-1 puede activar p53 y MDM2 p53 es una diana directa de aguas abajo [24], nos preguntamos si el efecto de IGF-1 en el expresión de MDM2 es dependiente de p53. Se han tratado las células H1299 no microcítico de pulmón de células de carcinoma humano p53 nula con IGF-1. IGF-1 todavía era capaz de inducir la expresión de la proteína MDM2 en H1299 células de una manera dependiente de la dosis (Figura 1B), lo que indica que el IGF-1 mediada por la regulación de MDM2 es independiente de p53.
A continuación, se investigó si el IGF-1 hasta regula los niveles de proteína MDM2, aumentando su estabilidad de la proteína. Como era de esperar, IGF-1 aumentó la expresión de proteína MDM2 (Figura 2A). Sin embargo, el IGF-1 de tratamiento no alteró significativamente la proteína MDM2 vida media, como se determina por el tratamiento con el inhibidor de la biosíntesis de proteínas cicloheximida (Figura 2A y 2B) y por los experimentos de pulso-caza (Figura 2C y 2D). A continuación, examinó si el IGF-1 induce MDM2 mediante el aumento de sus niveles de mRNA. Sin embargo, el análisis de PCR cuantitativa (Q-PCR) mostró que los niveles de ARNm de MDM2 no se vieron afectados significativamente por la IGF-1 tratamiento (Figura 2E), lo que indica que el IGF-1 no afecta a los niveles de mRNA en estado estacionario.
( a) células U2-OS fueron suero de hambre durante 24 horas antes del tratamiento con IGF-1 (50 ng /ml) durante seis horas. Las células se trataron a continuación con 50 g /ml de cicloheximida (CHX), en presencia o ausencia de IGF-1 y se recogieron en los tiempos indicados. Los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia de Western de MDM2 y actina. análisis (B) cuantitativa de los niveles de proteína MDM2 de las células tratadas con CHX se realizaron mediante densitometría de barrido para cada banda de proteína MDM2 individuo y la correspondiente banda de proteína actina. La relación de MDM2 sobre la actina en el punto de tiempo cero se estableció arbitrariamente como 100 por ciento. Tres experimentos independientes se realizaron con resultados similares. las células (C) U2-OS fueron tratados con IGF-1 (50 ng /ml) durante seis horas y metabólicamente marcadas con
35S-metionina durante cuarenta minutos, y luego persiguieron con metionina fría. Los lisados celulares con la misma cantidad de radiactividad se inmunoprecipitaron con el anticuerpo contra SMP14 MDM2. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y se visualizaron por autorradiografía. (D) Análisis cuantitativo se realizó por densitometría de barrido usando el software ImageQuant. células de hambre de suero (E) U2-OS fueron tratados con IGF-1 (50 ng /ml) durante seis horas. MDM2 niveles de expresión génica se determinó por PCR cuantitativa en (Q-PCR) y se normalizó a la expresión de GAPDH. Los datos presentados como medias y SE de dos experimentos independientes realizados por duplicado.
La inhibición de mTOR de rapamycin bloques de IGF-1 y heregulina-mediada sobre regulación de MDM2
AKT tiene ha demostrado que es un importante regulador de la actividad mTORC1. Por lo tanto, se investigó si la vía mTOR desempeña un papel en el IGF-1 mediada por la regulación de MDM2. Para este fin, se privaron de suero y luego pretratados células U2-OS con rapamicina, un inhibidor selectivo de mTOR [28], antes del tratamiento con IGF-1. Como era de esperar, la rapamicina bloquea la fosforilación de la proteína ribosomal S6 (Figura 3A). En particular, la rapamicina también bloqueó MDM2 inducida por IGF-1 sobre regulación (Figura 3A). Se observaron resultados similares en células H1299, en el que la rapamicina abrogó MDM2 inducida por IGF-1 de la regulación y la fosforilación de 4EBP1 (Figura 3B). Además, la expresión de AKT constitutivamente activa (mirístico-AKT) condujo a un aumento de los niveles de proteína MDM2, que fue completamente bloqueada en presencia de rapamicina (Figura 3C). Tomados en conjunto, estos datos apoyan firmemente la idea de que una vía sensible a rapamicina es fundamental para la regulación de MDM2 a través de señalización de IGF-1 /PI3K /AKT.
U2-OS (A) o H1299 (B) células se privaron de suero y pre-tratados con rapamicina (50 nM) durante cuatro horas, y luego tratados con IGF-1 (50 ng /ml) durante seis horas. Las células se lisaron y se sometieron a análisis de transferencia Western. El análisis cuantitativo de los niveles de proteína MDM2 se realizaron mediante densitometría de barrido para cada banda de proteína MDM2 individuo y la correspondiente banda de proteína actina. La relación de MDM2 sobre la actina en la muestra de control se estableció arbitrariamente como 1,0. células (C) U2-OS se infectaron con adenovirus recombinante GFP codificación o mirístico-AKT durante 24 horas antes del tratamiento con rapamicina (100 nM) durante cuatro horas. Los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western.
Desde heregulina puede activar AKT, nos preguntamos si esto podría ligando un máximo de regular MDM2 de una manera dependiente de la mTOR. Células MCF-7 o células H1299 fueron privadas de suero antes del tratamiento con rapamicina, y después se trató con heregulina-beta (HRG). Como se muestra en la figura 4A, la activación de la señalización de AKT por HRG indujo eficazmente la expresión de proteína MDM2, que fue completamente bloqueado por la rapamicina en ambos MCF-7 y las células H1299 (Figura 4A y 4B). Además, el inhibidor de PI3K LY294002 inhibió eficazmente el efecto de HRG en la regulación de MDM2 (Figura 4B), indicando que heregulina mediada por la regulación de MDM2 es dependiente de PI3K. En conjunto, estos datos indican que se requiere una vía de rapamicina-sensible para la regulación de MDM2 por las vías de señalización de IGF-1 o heregulina.
células MCF-7 (A) fueron tratados pre-suero de hambre y con rapamicina (50 nM) durante cuatro horas, y después se trató con heregulina-beta (HRG; 25 ng /ml) durante 24 horas. Las células se lisaron y se sometieron a análisis de transferencia Western. (B) células H1299 privadas de suero se pre-tratados con rapamicina (50 nM) o LY294002 (20 M) durante cuatro horas, y luego tratados con heregulina-beta (25 ng /ml) durante 24 horas. Los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western.
La expresión de un mutante defectuoso en 4EBP1 mTOR fosforilación Atenúa IGF-1 mediada Sobre regulación de MDM2
A continuación se determinó si eIF4E, un importante objetivo abajo de la mTOR, está involucrado en el IGF-1 mediada por la regulación de MDM2. Desde mTOR fosforila 4EBP1, lo que resulta en su disociación de eIF4E y conduce a la formación del complejo de iniciación de la traducción [29], se utilizó 4EBP1-5A mutante, que carece de los cinco sitios de fosforilación Ser /Thr dirigidos por mTOR y por lo tanto actúa como un dominante inhibidor negativo mediante la unión elF4E para prevenir iniciación de la traducción [30]. Con este fin, las células H1299 se transfectaron transitoriamente con ya sea de tipo salvaje o 4EBP1 4EBP1-5A, seguido de privación de suero y el tratamiento con IGF-1. Como se muestra en la Figura 5A, IGF-1 tratamiento dio lugar a un fuerte aumento de la fosforilación de AKT, S6 y 4EBP1, en correlación con un marcado incremento en la expresión de MDM2. En particular, la expresión de tipo salvaje 4EBP1 no alteró significativamente el efecto de IGF-1 sobre la expresión de MDM2, probablemente debido a la fosforilación eficaz de 4EBP1 en células H1299. Sin embargo, el IGF-1 mediada por MDM2 regulación fue significativamente inhibido por la expresión ectópica de 4EBP1-5A. A continuación, con el fin de investigar el papel de eIF4E directamente, ablated eIF4E endógeno utilizando pequeños ARN de interferencia (siRNA) en las células U2-OS. Mientras silenciar eIF4E no afectó significativamente la expresión de MDM2 basal (Figura 5B), desmontables de eIF4E abrogó completamente el efecto de IGF-1 en el aumento de los niveles de MDM2, a pesar evidente 4EBP1 fosforilación (Figura 5C).
(A) H1299 las células fueron transfectadas transitoriamente con el tipo salvaje 4EBP1, 4EBP1-5A, o plásmido vector. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se dividieron y se mantuvieron durante 24 horas adicionales antes de la privación de suero durante 24 horas. Las células se trataron entonces con o sin IGF-1 (50 ng /ml) durante seis horas. Las células se lisaron y se sometieron a transferencia de Western. El análisis cuantitativo de los niveles de proteína MDM2 se realizaron mediante densitometría de barrido para cada banda de proteína MDM2 individuo y la correspondiente banda de proteína actina. La relación de MDM2 sobre la actina en la muestra de control (carril 1) se fijó arbitrariamente como 1,0. (B) Las células U2-OS fueron transfectadas transitoriamente con siRNA contra eIF4E (si4E) o un control mezclado (siScr). Los lisados celulares se sometieron a transferencia Western, como se muestra. (C) células U2-OS transfectadas con si4E o siScr eran privaron de suero durante 24 horas antes del tratamiento con o sin 5 ng /ml de IGF-1 durante seis horas. Los lisados celulares se sometieron a transferencia Western, como se muestra. células (D) U2-OS fueron transfectadas transitoriamente con siRNA contra S6K (siS6K) o un siRNA revueltos (siScr). Los lisados celulares se sometieron a transferencia Western, como se muestra. (E) células U2-OS transfectadas con siS6K o siScr eran privaron de suero durante 24 horas antes del tratamiento con o sin 5 ng /ml de IGF-1 durante seis horas. Los lisados celulares se sometieron a transferencia Western, como se muestra.
Además de fosforilación y la inhibición de 4EBP1, mTOR fosforila y activa a la proteína ribosomal S6 quinasa (S6K), que a su vez fosforila y activa a la proteína ribosomal S6 en a fin de mejorar la traducción de proteínas. Por lo tanto, ablated S6K de siRNA en las células U2-OS. Como se muestra en la Figura 5D y 5E, se observó efectos similares a los de eIF4E desmontables, lo que indica mediada por IGF-1 MDM2 regulación requiere la señalización de mTOR, que implica tanto las vías de eIF4E y S6K.
Tratamiento La rapamicina reduce la expresión de MDM2 y sensibiliza a las células del cáncer a la apoptosis inducida por doxorrubicina
Desde MDM2 es un regulador negativo clave de p53, que es esencial para el ADN de la apoptosis inducida por el daño, se investigó el efecto de la rapamicina sobre la apoptosis inducida por doxorrubicina en p53-positivos Células cancerígenas. Elegimos células MCF-7 de cáncer de mama, ya que albergan una mutación somática en el gen PIK3CA que confiere una vía de AKT-mTOR constitutivamente activa [31]. MCF-7 células fueron pretratadas con la rapamicina, seguido de tratamiento con una dosis baja de la doxorrubicina. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de azul de tripano de exclusión y el análisis de transferencia de Western para la escisión de poli polimerasa ADP-ribosa (PARP), un marcador bioquímico de la apoptosis. En estas condiciones, ni la rapamicina ni doxorrubicina sola significativamente inducida apoptosis. la muerte celular Sin embargo, en presencia de rapamicina, doxorrubicina induce eficazmente (Figura 6A). En particular, la rapamicina completamente bloqueada sobre regulación de MDM2, pero no de p53 (Figura 6B). Fenómenos similares se observaron en células de osteosarcoma humano SJSA-1, que albergan amplificación MDM2 [25] (Figura 6C y 6D). En conjunto, estos datos sugieren que la rapamicina inhibe la expresión de proteína MDM2, lo que resulta en la sensibilización de las células cancerosas a la doxorrubicina inducida por la muerte celular.
(A-B) células MCF-7 se mantuvieron en medio de cultivo normal, tratados previamente con rapamicina (100 nM) durante 48 horas, y luego tratados con doxorrubicina (0,6 mg /ml) durante 24 horas. Se recogieron tanto las células flotantes y adherentes, y se sometieron a ensayo de tripán azul de exclusión (A) y Western blot (B). La viabilidad celular se presenta como un porcentaje de células vivas sobre el total de células contadas. Los datos presentados como medias y SE de tres experimentos independientes realizados por triplicado. (C) SJSA-1 células se mantuvieron en medio de cultivo normal, pretratado con rapamicina (100 nM) durante 48 horas y después se trataron con doxorubicina (1 mg /ml) durante 36 horas. Se recogieron tanto las células flotantes y adherentes, y se sometieron a análisis de transferencia Western. (D) Morfología de las células SJSA-1 fue grabado por microscopía de contraste de fase (100 ×).
A continuación se investigó si la baja regulación de MDM2 juega un papel causal en la sensibilización de las células a la doxorrubicina por rapamicina tratamiento. Se han tratado las células U2-OS con rapamicina y doxorrubicina ya sea en presencia o ausencia de la expresión ectópica de MDM2. Como se muestra en la Figura 7A, la expresión de MDM2 revirtió drásticamente los niveles de PARP escindida, en comparación con las células que expresan un control de vector. En particular, la expresión de MDM2 reduce los niveles de proteína p53, así como la fosforilación de Ser15 en p53. Además, la expresión de MDM2 rescatado eficazmente la muerte celular inducida por la rapamicina más el tratamiento con la combinación de doxorrubicina (Figura 7B y 7C). Estos datos indican que la inhibición de MDM2 sobre regulación de la rapamicina es en gran parte responsable de la sensibilización de las células para el tratamiento quimioterapéutico.
(A-B) células U2-OS fueron transfectadas transitoriamente con MDM2 o un control vectorial. Veinticuatro horas después de las transfecciones, las células se pretrataron con rapamicina (100 nM) durante 48 horas y después se trataron con doxorubicina (1 mg /ml) durante 36 horas. Se recogieron tanto las células flotantes y adherentes, y se sometieron a transferencia de Western (A) o citometría de flujo análisis (B). (C) Morfología de las células U2-OS fue grabado por microscopía de contraste de fase (100 ×).
Discusión
En este estudio, hemos demostrado que el IGF-1 hasta regula MDM2 los niveles de proteína a través de la vía de mTOR, añadiendo así otra capa de regulación fina a la vía de MDM2-p53 por la cascada de señalización /AKT IGF-1. AKT se ha demostrado previamente para interactuar físicamente con y fosforilar MDM2, lo que facilita MDM2 translocación nuclear [16]. La fosforilación de MDM2 mejora la interacción de MDM2 con p300, lo que aumenta la actividad de ubiquitina ligasa E3 hacia p53 y facilitar la ubiquitinación y la degradación de p53 [17]. Además, la fosforilación de MDM2 en Ser166 y Ser188 por AKT se ha demostrado para estabilizar la proteína MDM2 mediante la inhibición de su auto-ubiquitinación [19]. Sin embargo, también se informó de que no parece fosforilación de Akt mediada por MDM2 a afectar dramáticamente MDM2 localización subcelular [18]. Por lo tanto, aunque está claro que AKT regula positivamente MDM2, los mecanismos moleculares precisos parecen ser las células de tipo y dependiente del contexto.
Estudios previos sugieren que MDM2 puede regularse a nivel de traducción. traducción mejorada de MDM2 se ha observado en líneas de células de coriocarcinoma humanos [32]. El ARNm de MDM2 contiene un 5 'región no traducida distinta (UTR) que juega un papel en la eficiencia de traducción [33]. Además, el aumento de expresión de MDM2 inducida por BCR /ABL expresión se asocia con la traducción MDM2 mejorada debido a la regulación en el 5 'UTR de MDM2 ARNm [34]. Por otra parte, la inhibición de IGF-1 de señalización, ya sea por knockout de IGF-1 receptor (IGF-1R) o por un inhibidor de cinasa de IGF-1R, se ha demostrado que disminuye la traducción MDM2 mediada a través de su 5 'UTR [35]. En particular, se ha informado de que el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) facilita la traducción MDM2 a través de mTOR en hepatocitos embrionarias [36]
.
En este estudio, mostramos que tanto la señalización de IGF-1 y herregulina activar MDM2 a través de la AKT -mTOR vía. Este estudio tiene dos implicaciones importantes. En primer lugar, las respuestas celulares a una variedad de tensiones convergen en la ruta de p53-MDM2, que sirve como el sensor central para el estrés. En segundo lugar, hay dos principales mecanismos de regulación para modular los niveles de proteína MDM2: regulación de la transcripción dependiente de p53 y control de la traducción dependiente de mTOR. señales de estrés, incluyendo el daño del ADN, la hipoxia, la privación de nutrientes y el estrés oxidativo, activan p53, que a su vez transcriptionally hasta regula la expresión de MDM2. señalización del factor de crecimiento, por el contrario, activa la vía de AKT-mTOR para mejorar la traducción de proteínas MDM2. Esta delicada regulación de MDM2 asegura que p53 está bajo estricto control. Además, nuestros datos muestran que eIF4E o ablación S6K no afectan significativamente a los niveles basales de MDM2. Sin embargo, el silenciamiento de cualquiera de eIF4E o S6K completamente abolido inducida por IGF-1 MDM2 regulación. Estos resultados indican que se requiere la vía de mTOR para el factor de crecimiento mediada por MDM2 regulación.
La inhibición de mTOR usando inhibidores farmacológicos específicos resultados en G1 /S detención del ciclo celular, la atenuación del crecimiento celular, y la apoptosis [37 ]. Los estudios preclínicos indican que la rapamicina y sus derivados inhiben el crecimiento del cáncer celular y la proliferación, que se ha demostrado tanto
in vitro
y en una variedad de cánceres humanos utilizando modelos animales [38]. Además, se informó de que la inhibición de mTOR promueve la apoptosis a través de control de la traducción de MCL-1, una bcl-2 como miembro de la familia [39]. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la inhibición de mTOR por sí sola no induce la apoptosis de manera efectiva; Más bien, se sensibiliza a las células a los estímulos de apoptosis. Por ejemplo, la rapamicina aumenta la capacidad de cisplatino para inducir la apoptosis en líneas celulares de leucemia promielocítica humana y líneas celulares de cáncer de ovario [40]. RAD001, un derivado de rapamicina, se ha demostrado que sensibilizar a un número de células de cáncer de p53 positiva a la apoptosis inducida por cisplatino mediante la inhibición de la expresión de proteína p21 a través de la represión de la traducción general [41]. Por otra parte, la rapamicina sensibilizados varias líneas celulares de mieloma a la apoptosis inducida por dexametasona, asociados con la disminución de la expresión de la ciclina D2 y survivina [42]. También se ha informado de que la expresión de mutantes constitutivamente activos imita 4E-BP1 el efecto de la rapamicina en el aumento de la apoptosis en células de mieloma múltiple, lo que sugiere que los inhibidores de mTOR sensibilizar a las células mediante la inhibición de la tapa que dependen la traducción [43]. En consonancia con esta idea, pequeñas moléculas que se dirigen iniciación de la traducción dependiente de la cubierta por la inhibición de eIF4A puede restaurar la sensibilidad a los fármacos en un modelo de linfoma de ratón [44].
En este estudio, se observó que el tratamiento con rapamicina y doxorrubicina combinación llevado a la expresión de MDM2 reducida, lo que resultó en un aumento de la apoptosis, lo que implica que p53 puede estar implicada en este proceso. Nuestros datos muestran que la doxorrubicina p53 hasta reguladas, como se esperaba. Sin embargo, mientras que el tratamiento de combinación de rapamicina /doxorrubicina no afectó significativamente los niveles de proteína p53, la fosforilación en la serina 15 de p53 se incrementaron, lo que sugiere que se indujo la actividad de p53. Es importante destacar que la expresión ectópica de MDM2 invierte apoptosis, concomitante con los niveles de proteína p53 reducidos y serina 15 fosforilación. No obstante, MDM2 también puede tener funciones independiente de p53 para inhibir la apoptosis en presencia de tratamiento de combinación de doxorrubicina /rapamicina.
En resumen, nuestro estudio demuestra que la rapamicina sensibiliza a las células cancerosas a la apoptosis inducida por fármacos quimioterapéuticos y sugiere que mTOR -targeted contra el cáncer con terapia combinada con quimioterapia puede ser más eficaz en el tratamiento de los cánceres de p53-positivos.
Materiales y Métodos
cultivo celular, tratamientos farmacológicos y plásmidos
materna humana carcinoma MCF-7 células, osteosarcoma células U2-OS y células H1299 de carcinoma de pulmón de células no pequeñas se mantuvieron en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 4,5 g /l de glucosa complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; certificado, GIBCO) , 100 unidades /ml de penicilina (GIBCO), 100 mg /ml de estreptomicina (GIBCO), y 2 mM L-glutamina (Gibco). Todas las líneas celulares se pasaron usando solución de tripsina-EDTA al 0,05% (GIBCO). Las células se mantuvieron en un humidificado 37 ° C bajo una incubadora CO 5%
2 atmósfera. Las células se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). MCF-7, U2-OS o células H1299 a 60-70% de confluencia se mueren de inanición de suero durante 24 horas en DMEM libre de suero antes de tratamiento con IGF-1. IGF-1 (Sigma) se preparó como un /ml de solución madre 100 g en agua. Los inhibidores químicos LY294002, PD98059, SB202190 (Calbiochem), y rapamicina (Sigma) se prepararon como soluciones madre 1.000 ×. La doxorubicina (Sigma) se preparó como una solución de 2 mg /mL. Heregulina-beta (Upstate) se preparó como una solución de 20 mg /ml en PBS. Para el tratamiento UV, los medios se retiraron y las células irradiadas quitando las tapas en un Spectrolinker XL-1000 UV Crosslinker (Spectronics Corporation). Después de la irradiación, se añadieron medios de comunicación para los platos y las células se cultivaron como se indica para cada experimento antes de la recogida de tanto las células flotantes y adherentes.
la infección adenoviral, transfección transitoria y la interferencia de ARN
Las células en 60% de confluencia fueron infectadas con adenovirus que codifica AKT o un control de vector, y se incubó durante dos horas a 37 ° C con agitación suave a intervalos de veinte minutos, seguido de la adición de medios de cultivo y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2 durante 24 horas. células H1299 en 80% de células confluencia o U2-OS en 50% de confluencia fueron transfectadas usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los medios se reemplazaron ocho (H1299) o seis horas (U2-OS) después de la transfección. Sirna contra eIF4E (AAGCAAACCUGCGGCUGAUCU), S6K (GGACATGGCAGGAGTGTTT) y revueltos siRNA controles específicos para cada oligonucleótido siRNA fueron adquiridos de Shanghai GenePharma Co., Ltd. y transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Análisis de Western Blot se recogieron
Las células, se lavaron con PBS, y se resuspendieron en EBC
250 tampón de lisis (NaCl 250 mM, 50 mM Tris pH 8,0, 0,5% Nonidet P-40, mM NaF 50, 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo , 2 mg /ml de aprotinina, y 2 mg /ml de leupeptina). La concentración de proteína se determinó utilizando el Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad). Igual cantidad de proteína se cargaron, separados por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore), y se hibridaron a un anticuerpo primario apropiado y anticuerpo secundario conjugado con HRP para la detección posterior por un aumento de quimioluminiscencia. El anticuerpo monoclonal específico para SMP14 MDM2 (Santa Cruz) se usó a diluciones 1:200. El anticuerpo monoclonal DO-1 específico para p53 (Santa Cruz) se utilizó a una dilución de 1:250. anticuerpo policlonal C-11 específico para actina (Santa Cruz) se utilizó a una dilución de 1:1000. Los anticuerpos específicos para PARP (# 9542), fosfo-AKT (Ser473;#9271), AKT total de (# 9272), proteína fosfo-S6 ribosomal (serina 235/236;#2211), proteína ribosomal S6 (# 2217), S6 quinasa (# 9202), eIF4E, fosfo-4EBP1 (Ser65;#9456) o 4EBP1 (# 9452) fueron adquiridos de Señalización celular Tecnología y utilizado en 1:1000 diluciones
Análisis de citometría de flujo
Las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS frío, y se fijaron en etanol al 70% a 4 ° C durante la noche. Las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI) suplementado con 80 mg /ml de RNasa A a 37 ° C en la oscuridad durante una hora. Las células fueron sometidas a análisis por citometría de flujo FACScan citómetro de flujo (Becton Dickson), y los datos fueron analizados utilizando el software Cell Quest (Becton Dickson).
PCR cuantitativa
El ARN total fue extraído a partir células usando Tryzol de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Gibco). El ARN se transcribe de forma inversa usando iScript síntesis de cDNA Kit (BioRad). La reacción también se llevó a cabo en ausencia de la transcriptasa inversa para servir como un control negativo. Q-PCR se llevó a cabo en volúmenes de reacción de 25 mu l (8 ADNc ng, 12,5 l Taqman PCR Universal Master Mix, 1,25 l de reactivo de expresión de genes de la demanda; Applied Biosystems), tanto para MDM2 y GAPDH. La reacción Q-PCR se realizó en un sistema de detección de secuencia ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). Las condiciones de Q-PCR fueron las siguientes: 10 minutos a 95 ° C seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 segundos y recocido /que se extienden a 60 ° C durante un minuto. los valores de cuantificación relativa se calcularon utilizando el método ΔΔCt.
Ensayo de viabilidad celular
Tanto flotante y se recogieron y se resuspendieron en PBS células adherentes. Volúmenes iguales de solución de azul de tripano mancha (0,4%; Gibco) y la suspensión de células se mezclaron y se tiñeron durante cinco minutos a temperatura ambiente. El número de células teñidas y no teñidas se contaron con un hemocitómetro. Se contaron al menos 500 células por muestra. El porcentaje de viabilidad representa la proporción de células no teñidas a las células totales. Estudiante de
t-
prueba se utilizó para determinar la significación estadística de las diferencias entre los grupos.
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. J Lawrence (Universidad de Virginia, Charlottesville, Virginia) para pCMV4-4EBP1 y pCMV4-4EBP1-5A plásmidos.