Extracto
conexinas (Cx), que constituyen brecha de la salida canales intercelulares en los vertebrados, se han mostrado para suprimir el crecimiento de células transformadas y la tumorigénesis, pero el mecanismo (s) todavía permanecen en gran parte especulativa. Aquí, definimos las bases moleculares por los cuales Cx26, Cx43 pero con menos frecuencia o Cx32, confieren selectivamente la supresión del crecimiento de las células cancerosas. se muestra el acoplamiento intercelular funcional que se requiera, la producción de bloques parciales del ciclo celular debido a la activación prolongada de varias quinasas mitogénicas. PKA es a la vez necesaria y suficiente para la inhibición del crecimiento inducida Cx26 en el suero bajo y la ausencia de anclaje. La activación de PKA no se asoció con los niveles de AMPc elevados, pero parecía ser el resultado de una redistribución de cAMP a través de la población de células, la eliminación de las oscilaciones del ciclo celular en cAMP necesarios para la progresión del ciclo celular eficiente. Cx43 y Cx32 fallan en mediar esta redistribución como, a diferencia de Cx26, estos canales se cierran durante la fase G2 /M del ciclo celular cuando cAMP niveles pico. Las comparaciones de las líneas de células tumorales indican que este es un patrón general, con la supresión del crecimiento por conexinas que se producen cada vez cAMP oscila con el ciclo celular, y la brecha de la salida permanecen abiertas durante todo el ciclo celular. De este modo, el acoplamiento brecha ocasiones, en ausencia de señales externas, proporciona un medio general para limitar el índice mitótico de las poblaciones de células
Visto:. Un Chandrasekhar, Kalmykov EA, Polusani SR, Mathis SA, SN Zucker, Nicholson BJ (2013) intercelular redistribución de cAMP subyace supresión selectiva del crecimiento de células cancerígenas por connexin26. PLoS ONE 8 (12): e82335. doi: 10.1371 /journal.pone.0082335
Editor: David M. Ojcius, Universidad de California en Merced, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Agosto, 2013; Aceptado: 30 Octubre 2013; Publicado: Diciembre 3, 2013
Derechos de Autor © 2013 Chandrasekhar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyada por el texto siguiente: NIH - R01 CA048049, CA54174 P30, P01 AG19316, y AG013319 P30. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción uniones
Gap son matrices de canales intercelulares que son los únicos mediadores de intercambio intercelular directa de pequeños metabolitos y moléculas de señalización en los sistemas multicelulares [1,2]. En los vertebrados, estos canales se componen de proteínas integrales de membrana denominadas conexinas (Cx), con cuatro dominios transmembrana y citoplásmico N y C -termini. Seis conexinas se unen para formar un hemicanal o conexón, y dos de estos hemichannels de oponerse a las células muelle para crear el canal de unión intercelular brecha [3]. El papel integral, pero especializado de las uniones comunicantes en diversos tejidos se ve facilitada por la presencia de al menos 21 isoformas de conexinas diferentes en los seres humanos, con distintas proteínas que se clasifican en función de su peso molecular [4], y una nomenclatura gen se describe en [5 ]. Las proteínas Cx43, Cx32 y Cx26 estudiados aquí son codificadas por el
GJA1
,
GJB1
y
GJB2
genes, respectivamente.
Casi desde su descubrimiento, las uniones comunicantes se han implicado como supresores de tumores en varios tejidos [6]. Esto ha sido confirmado en pantallas genéticas de numerosos tipos de tumores incluyendo carcinoma de mama [7], cáncer de próstata [8], y melanoma [9]. Una multitud de tipos de tumores y líneas celulares transformadas demuestran disminución de la expresión de proteína conexina y /o funcionalidad brecha de la salida (revisado en 10). Además, hay varios casos documentados en los que la expresión exógena de conexinas en una línea celular transformada puede suprimir drásticamente sus propiedades transformadas y su capacidad para formar tumores en ratones nude [Cx43 en células de glioma C6 [11]; Cx43 en 10T1 /2 células mesenquimales embrionarias [12]; Cx43 y Cx32 en células de cáncer de próstata LNCaP [13]; Cx26 en células de cáncer cervical HeLa [14]; Cx26 y Cx43 en MDA-MB-231 células de cáncer de mama [15,16], y; Cx32 en células de hepatoma SKHep1 [17]. Esto último también es consistente con un aumento en la tumorigénesis hepática observada en Cx32 - /- ratones [8,18]
Supresión del crecimiento de las células transformadas por expresión Cx se ha relacionado con la regulación de la pro- y anti-apoptótica. (por ejemplo, proteínas Bcl-2) [19,20] o cambios en las proteínas del ciclo celular, tales como el NoV (CCN3) [21], Skp2 [22] y p21 [23,24]. Sin embargo, establecer una conexión directa entre cualquiera de estos eventos y el intercambio de moléculas de señalización entre las células a través de uniones ha sido difícil de lograr. Los avances en este sentido ha sido restringido por información limitada tanto de las propiedades de permeabilidad de conexinas y la distribución espacio-temporal de las concentraciones de metabolitos de bajo peso molecular en poblaciones multicelulares. En algunos casos, se han propuesto conexinas para suprimir el crecimiento, incluso en ausencia de demostrable brecha actividad del canal de cruce [15,21,24,25,]. Esto podría ocurrir a través de interacciones con otras proteínas conocidas que se unen a conexinas (por [26]), a través de su función como hemichannels, que puede contribuir a un aumento de la muerte celular [27], o incluso a través de mala localización de partes de la proteína ( 25). Sin embargo, una relación definitiva entre cualquiera de estos procesos y factores anti-oncogénicos aún no se han establecido.
Mientras que el papel de la celda de acoplamiento, en comparación con otras funciones de conexina, sigue siendo un tema de debate en la supresión tumoral, el enlace espacio de acoplamiento entre la salida y la mitogénesis se ha establecido en varias condiciones no patógenas. Varios factores de crecimiento, tales como EGF [28] y PDGF [12] han demostrado que induce desacoplamiento transitoria de células como parte de la respuesta temprana inmediata que precede a la iniciación de la mitosis. Oncogenes como
v-src
han demostrado que tienen similares, pero los efectos más duraderos sobre el acoplamiento [29].
In vivo
, como parte de la respuesta regenerativa tras hepatectomía parcial, una pérdida aguda de las uniones comunicantes entre los hepatocitos se ve que precedan inmediatamente a la primera ola de la mitosis [30]. Sin embargo, como ha sido el caso en los tumores, la base molecular de la inhibición mitogénica asociada con la celda de acoplamiento queda por resolver. En este estudio, hemos tratado de definir el mecanismo molecular de la supresión del crecimiento por conexinas en células HeLa, una línea celular de cáncer de cuello uterino transformado muy bien caracterizado, y poner a prueba la generalización de esos mecanismos con otros tipos de células. Nuestros resultados demuestran que Cx26 específicamente permite el paso de cAMP entre las células, la nivelación de los picos y valles de cAMP que se producen durante el ciclo celular y, a través de la activación de PKA, provocando retrasos del ciclo celular. El efecto es la conexina específica, como otras conexinas, como Cx43 y 32, cerca durante el ciclo celular en exactamente el momento en que los niveles de cAMP se acumulan. El examen de varias líneas de células tumorales indica una generalidad a este efecto siempre que las oscilaciones de cAMP se ven y los canales permanecen abiertas durante todo el ciclo celular.
Resultados
Cx26, Cx32 pero no ó 43, inhiben transforman crecimiento de las células HeLa
células HeLa son una línea celular de cáncer de cuello uterino ampliamente estudiada, que carecen de uniones gap endógenos, pero permiten la expresión robusta, el tráfico apropiado, y el procesamiento de conexinas expresadas de forma exógena. Hemos utilizado este sistema para caracterizar las propiedades de crecimiento conexina mediante la preparación de clones agrupados de células HeLa que expresan Cx43 (HeLa43), Cx32 (HeLa32), y Cx26 (HeLa26). Cada uno de los transfectantes HeLa expresan conexinas a niveles similares, y de acuerdo con el MW pronosticado en transferencias Western (Figura S1). Se forman placas de unión brecha típicos en la interfase célula-célula (Figura 1A), y muestran tasas similares de transferencia de colorante calceína pre-cargado para células no marcadas circundantes, con ~ 95% de las células cargadas acoplado a al menos un vecino, y 73 a 83% de los vecinos de primer orden que reciben colorante (Tabla 1).
(a) la tinción de inmunofluorescencia, utilizando el anticuerpo anti-Cx apropiado, muestra la expresión característica de conexinas en las placas entre las células. HeLaPar dio negativo con todos los tres anticuerpos anti-Cx (resultados contra-Cx26 anticuerpos se muestran aquí) (barras de escala, 10μm).
(B) Crecimiento de HeLaPar (cuadrados) con grupos de clones HeLa transfectadas con Cx26 (círculos), CX32 (triángulo invertido) o Cx43 (triángulo en posición vertical), se sometió a 3 días de privación de suero (0-3 días), seguido de 3 días en 1% de suero (días 3-6), revela la supresión del crecimiento selectivo por Cx26. Los datos representativos de uno de tres experimentos se muestra, con puntos que representan la media ± SEM de los recubrimientos por triplicado.
(C) Diagrama de topología de Cx26, con la superficie extracelular en la parte superior, representa la ubicación de dos mutantes puntuales utilizado en este estudio que interrumpir diferentes aspectos de la función del canal (R75Y y T135A).
(D) tinción de inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-Cx26 muestra que ambos mutantes forman placas conexinas en la superficie celular, con R75Y tener un poco más pequeños, menos frecuentes, placas, placas y T135A tener mayores y más frecuentes que W.T. Cx26 (panel A) (barras de escala, 10μm)
.
función (E) hemicanal se ensayó mediante la absorción de colorante LY en un ensayo de tinte dejando caer (ojeador et al., 2002). El panel izquierdo muestra la imagen de contraste de fase (asteriscos indican las células que tienen el tinte) y el panel derecho muestra la imagen fluorescente (barra de escala, 20μm). Tenga en cuenta que algunas células de tinte-positivas parecen tener tinte recibida a través de la transferencia intercelular de la célula original que ocupaba colorante en las culturas HeLa26
.
(F) La comparación del crecimiento en suero baja (panel B cf) de mutante Cx26 expresando células (Cx26T135A - diamantes, Cx26R75Y - triángulos) con las que expresan en peso HeLa26 (círculos) y HeLaPar células (cuadrados) demuestra que los canales intercelulares funcionales de W.T. Cx26 se requieren para la supresión del crecimiento. Los datos representativos de uno de tres experimentos se muestra, con puntos que representan la media ± SEM de los recubrimientos por triplicado.
Gap Junction
hemicanal
HeLa Tipo de la célula
% Junto
una primera orden
%
b acoplamiento
% de células de llenado con colorante extracelular
c
Parental000Cx 4395 ± 1,3273 ± 2,0180 10.43NTCx 3296 ± ± ± 0,6783 9.53NTCx 2.693 ± 8.283 ± 1.7Cx26 R75Y006 ± 1.2Cx 26T135A000Table 1. Análisis funcional de las uniones comunicantes y hemichannels.
a el porcentaje de células que pasan precargados tinte a por lo menos una célula del receptor.
b el porcentaje de células de primer orden (es decir, aquellos inmediatamente adyacente a la célula donante) que recibe colorante después de 6 horas de chapado.
c el porcentaje de células que muestran la absorción de colorante de amarillo Lucifer (LY) (véase la Figura 1E). Los resultados no incluyen las células recibir LY en segundo lugar a través de acoplamiento (es decir, Cx26) .nt: condiciones de suero No se ha probado CSV Descargar CSV
El efecto de la expresión de la conexina en las características de crecimiento transformadas de las células HeLa se evaluó en condiciones de baja (1%) y en poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) (poliHEMA) placas que no admiten la célula-sustrato de adhesión [31] recubierto. A pesar de los similares niveles de acoplamiento en todos los transfectantes connexin, se observa que sólo HeLa26 mostró retraso del crecimiento, de acuerdo con estudios anteriores (Mesnil et al., 1995). HeLa26 mostrar 3 veces más largo tiempo de duplicación en condiciones de bajo suero (Figura 1B), y ≥2 veces menor crecimiento independiente de anclaje (figura S2) en comparación con las células HeLa (HeLa parentales PAR) u otros transfectantes conexina, como se demostró en tres HeLa26 independiente clones. Todos los datos que se muestran aquí se obtuvo de grupos de clones mezclados en proporciones iguales para cada experimento.
La comunicación intercelular por Cx26 es necesaria para la supresión del crecimiento
La función específica de Cx26 responsable de la supresión del crecimiento se evaluó mediante mutaciones puntuales Cx26 que ablated la función del canal. La mutación Cx26T135A al final citoplasmática del tercer dominio transmembrana (Figura 1C) impide la apertura de cualquiera de los canales de salida brecha o hemichannels [32]. La mutación Cx26R75Y en el primer bucle extracelular (Figura 1C) impide la formación de canales brecha de la salida, pero deja hemicanal funcionan en gran medida sin cambios [33]. unión Gap y propiedades hemicanal de todos Cx26 construye, así como Cx43 y 32, se confirmaron usando Lucifer Yellow transferencia entre las células, o captación de los medios de comunicación después de la estimulación mecánica (Figura 1E), respectivamente (resumen en). Ambos mutantes Cx26 forman placas en células HeLa (Figura 1D), la documentación de que estas mutaciones todavía apoyan montaje de estructuras de unión hueco [32]. Las placas parecían ser más numerosos en el caso de HeLa26T135A, y menor en el caso de HeLa26R75Y (Figuras 1A y C. F. D), de acuerdo con las indicaciones anteriores que Cx26R75Y pueden reducir la estabilidad y el tamaño de las placas de unión hueco [34].
A diferencia de tipo salvaje (W.T.) Cx26, ninguno de los mutantes de Cx26 causó supresión del crecimiento de células HeLa, ya sea en bajo suero (Figura 1F), o en condiciones independientes de anclaje (Figura S2). Por lo tanto, se requiere la comunicación intercelular para el retraso del crecimiento por Cx26. Mientras que la función de hemicanal HeLa26R75Y hizo reducir la densidad de saturación, lo que sugiere un papel parcial para hemichannels en el grado de embalaje de células, el efecto fue de un moderado 20%, en comparación con W.T. Cx26, que redujo la densidad de saturación de 60%. A pesar de acoplamiento intercelular era claramente necesaria para la conexina mediada reversión de las características de crecimiento transformadas, el acoplamiento a través de otras conexinas (Cx43 y Cx32) fue ineficaz, lo que indica un papel único para los canales de Cx26.
efectos de crecimiento de uniones gap de Cx26 están mediadas por los bloques del ciclo celular reversible
Como un primer paso para identificar el mecanismo por el cual Cx26 acoplamiento brecha de la salida suprime el crecimiento de las células HeLa transformado, nos preguntamos si esto fue una consecuencia del aumento de la muerte celular, o la división celular reducida. HeLa26 células mostraron ningún aumento en la tinción de TUNEL, o la actividad de caspasa-3 (no mostrado), lo que indica que Cx26 no aumentó la apoptosis en células HeLa (Tabla S1). No hubo cierto aumento de la anexina V y el etiquetado de las células Hoechst HeLa26, pero estas células no mostró características morfológicas características de la muerte celular por apoptosis, necrosis o la autofagia. En cambio, mostraron características compatibles con las células que pueden haber sido bloqueados en la citocinesis (ver más abajo), que normalmente muestran una mayor permeabilidad de la membrana. análisis FACS de HeLa Par y Cx26 transfectantes después de la liberación en 1% de suero de timidina bloque /nocodazole (detención G2), reveló una salida prolongada de la mitosis en las células HeLa26, con retrasos aparentes en todas las fases del ciclo celular. (Figura 2A). HeLa43, HeLa32, y los dos Cx26 HeLa transfectantes distribuciones Demostración del ciclo celular HeLa mutantes similares a Par (datos no mostrados). Estudios similares que comparan el crecimiento después de la liberación del bloque G1 inducida por el bloque doble timidina dieron resultados similares, con salida de G1 /S está especialmente retrasado en las células HeLa26 en comparación con HeLa43, HeLa32, y los transfectantes Cx26 HeLa mutantes (datos no mostrados).
(A) La distribución del ciclo celular de HeLaPar (panel superior) y HeLa26 (panel inferior) se analizó por FACS [separar células en G1 (barras de color gris claro), S (barras de color gris oscuro) y G2-M (negro bares)] fases en los tiempos indicados después de la adición de suero 1% tras la privación de suero. HeLa26 células muestran una progresión más lenta a través del ciclo celular (por ejemplo, el tiempo para volver a G2: & gt; 24 horas en comparación con 16 horas para HeLaPar), así como una notable pérdida de la sincronización. Los datos son medias ± SEM de tres experimentos independientes.
(B) tinción del núcleo con DAPI (columna izquierda) revela una frecuencia mucho más alta de los núcleos multilobulados en Cx26 células que expresan (10 a 14% - paneles III, V y VII) que HeLaPar células (2 - 5% - del panel i). Co-tinción de las mismas células para gamma-tubulina (columna derecha) muestra uno (células quiescentes) o dos (células en división) centrosomas en las células HeLaPar (panel II). En contraste, las células HeLa26 (paneles IV, VI y VIII) a menudo comparten un solo centrosoma entre múltiples núcleos (flechas), o tiene un grupo de múltiples centriolos (punta de flecha) (barras de escala, 10μm).
(C ) el porcentaje de células polilobulados determina a diferentes días después de la adición de suero 1%, es consistentemente mayor en HeLa26 (barras rellenas) que HeLaPar (barras abiertas), con la diferencia máxima en 1 día. Los datos son la media ± SEM. * Denota significancia al valor de p & lt; 0,05. ** Denota importancia a los valores de p & lt; 0,005.
Hoechst o DAPI tinción en 1% de suero reveló una acumulación significativa de núcleos polimórficas, o células multinucleadas en HeLa26 (≥10% 24 horas después de la adición de suero) en comparación a la observada en HeLa Par ( & lt; 4%) (Figura 2B). Estas células son significativamente más grandes y más aplanada que aquellos con núcleos individuales, y parecen coherentes con el fracaso para completar con éxito la fase M y /o citocinesis. Estas anormalidades nucleares están asociados con o bien individuales (flechas en la figura 2B, iv y vi), o centrosomas múltiple (punta de flecha en la Figura 2B viii) dentro de una sola célula, compartido por múltiples núcleos, o lóbulos nucleares. Esto está en contraste con los habituales dos centrosomas asociados con la división de las células HeLa Par (flecha abierta en la figura 2B ii), y sugiere que las células HeLa26 tienen problemas con la regulación de la duplicación del centrosoma. membranas nucleares intactas, la falta de cromatina condensada, y la ausencia de la señal de TUNEL en HeLa26 (Tabla S1), indican que las células no entran en apoptosis, pero finalmente salir de la mitosis. Consistente con esto, mientras que las células de múltiples lóbulos o multi-nucleadas son siempre más abundante en los cultivos HeLa26, que no se acumulan con el tiempo (Figura 2C).
acoplamiento Cx26 brecha de la salida afecta a los niveles y la actividad de varios mitogénica moléculas
, se encontró que el estado de activación de varios reguladores mitogénicos
de acuerdo con los efectos observados de Cx26 en el ciclo celular de las células HeLa que aumentarse crónicamente en HeLa26 comparación con las células HeLa Par y otros transfectantes Cx (Cx26R75Y muestra de señalización como un ejemplo) durante el crecimiento en% de suero de 1 (Figura 3 y la Figura S3). Específicamente, los niveles de la CDK inhibidores, p21 y p27, que regulan directamente G1 (p21 y p27) y G2 progresión (p27), eran de 1,5 a 2 veces mayor en células HeLa26 durante la privación de suero (0 punto de tiempo), y permanecido más alta durante 48 o 24 horas después de la adición de suero 1%, respectivamente.
(AG) Los niveles de proteína en HeLaPar (barras blancas), HeLa26 (barras cerradas) y HeLa26R75Y (barras a cuadros) se cuantificaron a partir de imágenes digitalizadas de las transferencias Western (Figura 2, los datos adicionales) inmediatamente después de la privación de suero (día 0), y diariamente después de la adición de suero 1%. Niveles para cada proteína se normalizaron a la de las células HeLaPar en el día 0. La actina sirvió como control de carga interno. Los niveles de los inhibidores de CDK, p21 (A) y p27 (B), y la relación de fosforilada (activada) a niveles totales de los miembros de la familia MAPK y sus reguladores, MEK (C), ERK (D), JNK (E) p38MAPK (F) y la subunidad catalítica de PKA (G) eran más altos en cada HeLa26. Esta elevación, evidente durante la privación de suero, persistió de 1 - 3 días, dependiendo de la proteína.
(H) los niveles de cAMP fueron evaluados por ELISA en HeLaPar (barra libre), HeLa26 (barra cerrada) y HeLa26T135A (barra de cuadros). A diferencia de la actividad de PKA, los niveles de cAMP no muestran aumentos constantes en HeLa26 en comparación con los otros tipos de células. células HeLa26R75Y muestran los niveles de cAMP similares a HeLa26T135A. Los datos son la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. Los asteriscos indican los casos en que la actividad en HeLa26 es significativamente mayor (* = p & lt; 0,05; ** = p & lt; 0,005) que AMBOS HeLaPar y HeLa26R75Y o células T135A
Varios miembros del mitógeno activadas. proteína quinasa (MAPK) de la familia, conocido para regular los niveles de p21 y p27 (Erk 1/2, p38 y JNK) (Figura 3 CE), mostró aumentos persistentes (de 2 a 3 veces) en HeLa26. Dos quinasas aguas arriba, MEK y la proteína quinasa A (PKA) catalítico de la subunidad alfa (Figura 3 F y G), mostraron aumentos aún mayores prolongada de la actividad en HeLa26 (de 3 a 5 veces por más de 72 horas después de la adición de suero). Estos incrementos no fueron vistos en todas las vías mitogénicas como no se observaron cambios en Akt o p70 S6 quinasa.
Mientras que la activación prolongada de las MAPK se asocia con una disminución de la división celular [35,36], su activación aguda suele ser pro-mitogénica. Consistente con esto, en las primeras 2 horas después de la estimulación de suero 1%, las células HeLa Par mostraron una activación transitoria de Erk y JNK y una disminución de p38, seguido por la reanudación del estado basal. Por el contrario, HeLa26 no mostró estos cambios transitorios en la actividad (Figura S4), pero sólo una partida de activación más lenta aparición ~ 2 horas después de la adición de suero.
La activación de PKA es a la vez necesaria y suficiente para la supresión del crecimiento por Cx26
la contribución funcional de la elevación de estas quinasas a la supresión del crecimiento Cx26 se evaluó mediante estudios de siRNA desmontables de ERK, JNK y la subunidad catalítica de PKA alfa. siRNAs añadido durante la privación de suero inicial, 24 horas antes de la adición de suero 1%, provocó una reducción de 5 veces en JNK y una reducción de 2 veces de Erk y PKA (Figura 4A). los niveles más altos de siRNA no se utilizaron para evitar efectos tóxicos sobre las células, como cada una de estas vías de señalización también se requiere para la división celular basal.
(A) Lisados de HeLa26 (panel izquierdo), se trató con secuencia aleatoria siRNA (control), o siRNAs específico para las quinasas indicados, se prepararon 24 horas después de la adición de suero y se sondearon con anticuerpos contra la proteína total como se indica a la izquierda de cada mancha. Los niveles de todos los quinasas se redujeron, con JNK disminuye ser más dramático. Los lisados de células HeLaPar (panel derecho) transfectadas con un constructo de CA-PKA (constitutivamente activo) mostraron mucho más alta expresión de PKA que los controles no transfectadas. La actina sirvió como control de carga.
(B) Crecimiento de los diferentes siRNA células tratadas HeLa26 (barras abiertas), o células HeLaPar con y sin expresión PKA constitutivamente activa (barras cerradas) se comparan como una proporción de células número 24 horas después, y en el momento de, la adición de suero. El papel de la activación constitutiva de cada uno de las quinasas mitogénicas en la inhibición del crecimiento de HeLa26 es evidente en la inversión de la supresión del crecimiento inducida Cx26 por sus respectivos siRNAs. Esto es más dramático en el caso de PKA, donde el crecimiento vuelve a los mismos niveles que las células HeLaPar. Supresión del crecimiento de las células HeLaPar, en el mismo grado como se ve en HeLa26, por la expresión CA-PKA indica que PKA solo puede mediar este efecto. diferencias significativas en el crecimiento se indican con asteriscos (p & lt; 0,05).
Durante las primeras 24 horas en 1% de suero, células HeLa Par duplicaron en número, mientras que las células HeLa26 no mostraron un crecimiento significativo (Figura 4B ), consistente con el retraso en la progresión del ciclo celular observado en el análisis FACS en la Figura 2A. El tratamiento con siRNA de secuencia aleatoria no tuvo efecto sobre este patrón de crecimiento. Erk y JNK siRNAs individualmente, o en conjunto, causado una pérdida parcial de la inhibición del crecimiento en células HeLa26, pero siRNA para PKA provocó una reversión completa a el patrón de crecimiento de las células HeLa par. Por otra parte, la sobre expresión de la PKA catalítica de la subunidad alfa en células HeLa (Figura 4A, panel derecho) suprime su crecimiento a la misma velocidad que la de las células HeLa26 (Figura 4B). Por lo tanto, mientras que la activación de otras quinasas aguas abajo contribuye a la regulación del crecimiento celular HeLa, la activación de PKA parece ser el factor que influencia predominante, siendo a la vez necesaria y suficiente para los efectos de Cx26 en el crecimiento de células HeLa en suero baja.
La activación de PKA por Cx26 brecha ocasiones presentan acoplamiento es causado por la redistribución de cAMP, no por la elevación de su nivel
La función principal de la PKA ha demostrado más arriba implica fuertemente cAMP como una señal reguladora probable crecimiento. Sin embargo, las comparaciones de los niveles de cAMP globales en HeLa26, HeLa Par y culturas HeLa26R75Y (Figura 3H) no revelaron diferencias consistentes entre las líneas celulares de más de tres días de crecimiento en suero al 1%. Sin embargo, el AMPc se ha demostrado que es permeable a través de Cx26 brecha cruce de canales entre las células HeLa [37,38]. Dado que se requieren canales intercelulares funcionales para la activación de PKA y la supresión del crecimiento, esto nos llevó a investigar si una difusión de AMPc de las células con altas concentraciones a las células con concentraciones más bajas podría resultar en una mayor fracción de células con PKA activada, sin ningún requisito para adicional la producción de cAMP.
con el fin de visualizar directamente los niveles de cAMP espacialmente, un reportero de FRET empleando EPAC como el dominio de detección de cAMP intercalado entre PPC y YFP fluoróforos se introdujo en las células mediante transfección. El blanqueo de la YFP (el aceptor) fluoróforo resultó en un aumento de la PPC fluorescencia (donante) (23%) (Figura 5A) que no se observó cuando PPC y YFP se expresaron solo (2%) o en conjunto, pero en diferentes moléculas ( ~ 4%). Elevación de cAMP por 8-Br cAMP (agonista de cAMP), forskolina (ciclasa activador de ciclasa) y 3-isobutil-1-metilxantina (inhibidor de la fosfodiesterasa) causó una pérdida de FRET a & lt; 10%, presumiblemente debido a la extensión de la molécula de EPAC en la unión del AMPc (datos resumidos en la Figura 5B). FRET lecturas a partir de células individuales en cultivos no sincronizados HeLa Par y HeLa26 fotografiados en un microscopio confocal se correlacionaron con el contenido de ADN y la morfología nuclear. Los niveles de AMPc en las células HeLa Par aumentaron ~ 2 veces a partir de la interfase de la mitosis. Esta diferencia fue casi completamente perdido en las células HeLa26, debido al aumento de los niveles de interfase y la disminución de los niveles en las células mitóticas (Figura 5C). El seguimiento de los niveles de cAMP largo de un ciclo celular normal en las células par HeLa sincronizadas por doble bloque de timidina, confirmaron que los niveles de cAMP se mantienen bajos durante G1 y S, aumento de la G2, pico en metafase, y luego descender en la última parte de la mitosis (Figura 5D) . Estos "picos y valles" de cAMP parecen ser eliminado en las células HeLa26 debido a la difusión de cAMP de las relativamente pocas células en la fase M, en la mayoría de las células en fase G1 /S. El aumento resultante en AMPc en las células en fase G1 /S induce la activación de PKA, que es inhibidor del crecimiento en esta fase del ciclo celular [39]. Esto explica los resultados de la Figura 4B, donde knock-down de la PKA (en particular durante la fase G1 /S) puede eliminar los efectos supresores del crecimiento Cx26 de Cx26, mientras que su activación puede imitar la misma.
(A) Representación de aceptor photobleaching FRET, mostrando un aumento de los donantes (PPC) de fluorescencia después de photobleaching aceptor completa (YFP).
(B) FRET eficiencia es mínima cuando PPC y YFP se expresan por separado o juntos, pero no vinculado a través de una transportista común. FRET eficiencia del doblemente marcada EPAC construir aumenta en casi 10 veces, pero se reduce a solamente 3-4 veces por encima de fondo cuando se incrementan los niveles de cAMP.
(C) FRET mediciones 1 día después de adición de suero a partir de células individuales en ya sea en interfase o mitosis muestran que los cambios en los niveles de AMPc con el ciclo celular observada en las células HeLa se elimina después de la expresión de Cx26.
(D) análisis de una población de células HeLaPar sincronizadas en G1 FRET, muestra la oscilatorio patrón de cAMP con el ciclo celular, con niveles restantes baja en toda la interfase, y alcanzando un máximo durante la porción de la metafase de la mitosis.
La barra de escala representa ~ 40μM. Un mínimo de 25 células se promedió para cada tipo de célula y de la etapa del ciclo celular para FRET.
(E) La inmunocitoquímica de activo fosfo-PKA (catalítico de la subunidad alfa) 1 día después de 1% adición de suero (fila superior) revela un patrón de tinción heterogénea en células HeLaPar y células que expresan Cx43 o el canal de unión brecha deficiente Cx26R75Y mutante. Por el contrario, los niveles de p-PKA en HeLa26 son más altos y más uniforme a través de todas las células. Anotando las células individuales de contenido neto de la señal y el ADN de p-PKA como se evaluó mediante tinción con DAPI revela una correlación (gráficos inferiores), con niveles de p-PKA ser baja en G1 /S (menor contenido de ADN) y alta en G2 /M (ADN mayor contenido). Esta diferencia se reduce drásticamente en HeLa26 culturas.
Para confirmar si esta redistribución de cAMP fue consistente con el aumento global de la fosforilación de PKA en el sitio de la activación de Thr197 [40] que habíamos observado (Figura 3G), que también examinó los patrones espaciales de p- tinción de PKA en HeLa Par, 26, 43 y culturas 26R75Y (Figura 5E). La tinción de las células individuales fue muy heterogéneo en todas las culturas que muestran un rápido crecimiento en bajas concentraciones séricas (HeLa Par, Cx43 y Cx26R75Y). Co-tinción con DAPI reveló una clara correlación entre la intensidad de etiquetado P-PKA de cada celda con su contenido de ADN (Figura 5E - parcelas debajo de cada imagen de inmunofluorescencia), con los niveles más altos de P-PKA después de la replicación del ADN de ser coherente con el pico observado en los niveles de cAMP en la fase M se muestra en la Figura 5B. HeLa26 células presentan una excepción a este patrón en el que la tinción de las células fue más uniforme. Como era de esperar, la correlación de la intensidad de P-PKA con contenido de ADN también se redujo drásticamente, en consonancia con las mínimas diferencias que vemos en los niveles de cAMP entre la fase M y las células en fase S en estos cultivos (Figura 5C). Estos resultados sólo se explican fácilmente por una redistribución de cAMP a través de canales Cx26, a partir de células con concentraciones más altas (fase M), a células con concentraciones más bajas (G1 /S de fase). Esto aparentemente resulta en una fracción mucho mayor de células que alcanzan los niveles de cAMP suficientes para inducir la fosforilación de PKA, que conduce a su activación y una regulación al alza general de la actividad PKA en la cultura sin ningún aumento real de los niveles globales de AMPc.
Cx43 y canales CX32 no eran eficaces en la supresión del crecimiento ya que estos canales se cierran durante el ciclo celular
dado que las células HeLa43 y HeLa32 muestran robusto acoplamiento intercelular, y la evidencia previa dado que el AMPc puede pasar efectivamente a través de ambos canales Cx43 y Cx26 en estos las células [37], hemos tratado de determinar qué Cx43 y 32 fueron ineficaces en la supresión del crecimiento. Dado que los niveles de AMPc sólo aumentan durante la fase M, donde se ha informado de que el acoplamiento de la unión brecha puede disminuir, se examinó si estos tres conexinas son regulados diferencialmente durante el ciclo celular. Las células se sincronizan en la fase S por el bloque doble timidina en el suero normal (10%). A diferencia del comportamiento en bajo suero (Figura 1), todas las líneas celulares HeLa crecieron a tasas similares en suero normal. El grado de sincronía, así como la progresión del ciclo celular después de la liberación del bloque, se encontró que era el mismo para los tres transfectantes de conexinas en condiciones de suero normales. .
Apoyo a la Información
Figura S1.