Extracto
La mayoría de las células de cáncer de páncreas humanos son resistentes al factor de necrosis tumoral (TNF) -relacionado ligando inductor de apoptosis (TRAIL) mediada por apoptosis. Sin embargo, los mecanismos por los que las células de cáncer de páncreas utilizan sus moléculas extracelulares para contrarrestar la señalización proapoptótico mediado por la familia de TNF son en gran parte desconocidos. En este estudio, se demuestra por primera vez que DcR3, un receptor señuelo secretado que las células de cáncer de páncreas malignas expresan a un alto nivel, actúa como una molécula antiapoptótica extracelular mediante la unión a TRAIL y contrarrestar su función muerte de promoción. La reducción de DcR3 con siRNA TRAIL desenmascarado y en gran medida aumento de la apoptosis inducida por TRAIL. Gemcitabina, un medicamento de primera línea para el cáncer de páncreas, también redujo el nivel de DcR3. La adición de DcR3 siRNA mejora aún más la apoptosis inducida por gemcitabina. En particular, nuestro
in vivo
estudio demostró que el efecto terapéutico de la gemcitabina se podría mejorar mediante la reducción adicional de DcR3, lo que sugiere que la regulación por disminución de DcR3 en células tumorales podría inclinar el equilibrio de las células pancreáticas hacia apoptosis y servir potencialmente como una nueva estrategia para el tratamiento del cáncer de páncreas
Visto:. Wang W, M Zhang, Sun W, S Yang, Su Y, Zhang H, et al. (2013) Reducción de la apoptosis mediada por TRAIL-receptor señuelo 3 Mejora en el cáncer pancreático. PLoS ONE 8 (10): e74272. doi: 10.1371 /journal.pone.0074272
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Marzo, 2013; Aceptado: July 29, 2013; Publicado: 25 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Fondo Nacional de Ciencias Naturales de subvenciones China (81071968) de WW y el Programa clave de Investigación Científica de la Universidad de Medicina de Fujian (09ZD014) WW. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes: los co-autor Sunghee Kim es empleado por BioPowerTech. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El equilibrio entre los factores pro-apoptóticos y antiapoptóticos es un determinante importante en el destino de las células tumorales . Estas células se las arreglan para inclinar la balanza hacia la supervivencia mediante la sobreexpresión de moléculas anti-apoptóticas en sitios intracelulares e intercelulares. Un conjunto de estudios ha demostrado que el linfoma intracelular de células B 2 (Bcl-2) promueve la malignidad en varios tipos de tumores, mientras que el bloqueo de su función aumenta el efecto de los tratamientos contra el cáncer [1], [2], [3]. Bcl-2 se estabiliza la membrana mitocondrial y previene la liberación de citocromo c de la mitocondria y la formación de apoptosomes en el citoplasma [4], [5], lo que reduce la apoptosis de células tumorales y la mejora de la capacidad de los tumores para crecer y metastatizar.
Sin embargo, la mayoría de la señalización de apoptosis se activa extracelularmente a través de la unión de ligandos proapoptóticos de una célula a los receptores de muerte en la superficie de otra célula [6], [7]. Por ejemplo, los ligandos del factor de necrosis tumoral (TNF) familia se unen a sus receptores (por ejemplo, TNF a TNFR, FasL a Fas, LIGHT para Hvem /TR2) y luego desencadenar la señalización apoptótica en respuesta a eventos desfavorables [8], [ ,,,0],9]. El mecanismo extracelular por el cual las células se protegen antes de ligandos de muerte unen a sus receptores ha atraído mucha atención [10], [11]. Aunque el descubrimiento de receptores señuelo (por ejemplo, DcR1, DcR2, y DcR3) ha arrojado algo de luz sobre este fenómeno [8], [12], se necesita una comprensión más detallada de estos mecanismos.
Las células tumorales utilizan 2 capas de protección: (1) un sistema de defensa activa en la que los receptores señuelo bloquean el ligando muerte antes de que lleguen a los receptores de la familia de TNF en la superficie celular y evitar la iniciación de la señalización de la muerte; y (2) un sistema de defensa pasiva en la que la maquinaria antiapoptótico juega un papel una vez que la señal de muerte se activa dentro de las células. Puesto que las porciones de las moléculas de receptores de muerte celular de tipo I (por ejemplo, DcR3, DR3, DR5, TNFR1, OPG, y OX40) y ligandos de muerte (por ejemplo, FasL, LUZ, TL1A, y TRAIL LTA) comparten dominios funcionalmente similares, especialmente entre los 6 miembros de la familia TNFR [13], hemos utilizado varios enfoques para explorar la interacción de unión y de DcR3 con el ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL). Nuestros resultados mostraron que DcR3 no se une sólo a FasL, TL1A (VEGI), y la luz [14], [15], [16], [17] sino también a TRAIL, como lo demuestran los resultados de varios ensayos que incluían el enlace Biacore, citometría de flujo, inmunoprecipitación, inmunotransferencia de tipo Western, y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). células de cáncer de páncreas malignas expresan un alto nivel de DcR3, que puede ser downregulated de DCR3 siRNA o los medicamentos de quimioterapia, tales como gemcitabina. La combinación de DcR3 siRNA con TRAIL o gemcitabina mejora en gran medida el proceso de apoptosis
in vitro
y ralentiza el crecimiento del tumor
in vivo
, lo que sugiere que la regulación a la baja de DcR3 extracelular antiapoptótico puede mejorar la terapia contra el cáncer. Esto es especialmente cierto para el cáncer de páncreas agresivo, que utiliza DcR3 como los medios para su progresión.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y reactivos
Dos líneas celulares de cáncer de páncreas humano , AsPC-1 y MiaPaCa-2, y una línea celular de carcinoma de colon, SW480, se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células se mantuvieron como cultivos monocapa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 g /ml de estreptomicina, y 100 U /ml de penicilina a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera. reactivos relacionados con el DcR3 fueron proporcionados por BioPowerTech (Tuscaloosa, AL). La gemcitabina se adquirió de la farmacia en la Universidad de Rochester Medical Center (Rochester, NY). El siRNA para DcR3 se sintetizó en Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). FasL recombinante y TRAIL y sus anticuerpos se compraron de amp I +; D Systems (Minneapolis, MN) y BioLegend, Inc. (San Diego, CA). Proteína perlas de Sepharose se adquirieron de Pharmacia (Uppsala, Suecia). poli escindido con anti (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) anticuerpos policlonales se adquirieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA) y anti-gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) anticuerpo policlonal fue adquirido de Santa Cruz, Inc. (Santa Cruz, CA).
Biacore ensayo
La unión de TRAIL humano recombinante para DcR3 humano se analizó en un instrumento Biacore 3000 (Biacore, Inc., Piscataway, New Jersey). DcR3 se conjugó covalentemente a células de flujo sensor Biacore (chip CM5) a través de grupos amino utilizando N-etil-N '- (dimetilaminopropil) carbodiimida /N-hidroxisuccinimida. Varias diluciones de TRAIL (1 a 2.048 nM) se pasaron a través de la celda de flujo conjugado y la superficie en blanco en 20 l /minuto para un volumen total de 70 l. Se determinó la cantidad de proteína unida durante el lavado de la celda de flujo con tampón HBS-EP (HEPES 10 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, P20 al 0,005% de tensioactivo). Para regenerar la superficie de la célula de flujo, las proteínas unidas se lavaron con 20 mM de NaOH. LIGHT humana recombinante diluido en tampón HBS-EP (1-512 nM) se utilizó como control positivo. La asociación, disociación y las constantes de equilibrio se determinaron con un programa de cinética de evaluación en el software de evaluación Bia (Biacore, Inc.) usando un modelo de unión de 01:01 y el método de análisis global.
análisis de unión de la superficie celular
AsPC-1 y MiaPaCa-2 células se incubaron con o sin DcR3 recombinante (5 mg /ml), TRAIL (5 g /ml), o anticuerpo monoclonal anti-TRAIL murino (1 mg /ml) en los mismos o diferentes tubos durante 1 hora a 4 ° C, seguido por el anticuerpo monoclonal biotinilado DcR3 (0,5 g /ml), y luego isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpo secundario estreptavidina durante 1 hora a 4 ° C. Después del lavado, el DcR3 unido en la superficie celular se detectó con FACStarPlus (BD Inc., Franklin Lakes, NJ). Los datos se expresaron como el porcentaje de células teñidas positivamente.
inmunoprecipitación y Western Blot
La asociación física de DcR3 con TRAIL se examinó con inmunoprecipitación (IP) y Western Blot en 3 configuraciones diferentes. Para examinar la interacción entre 2 proteínas de recombinación puros, mezcla de 100-l de DcR3 con TRAIL (1 mg /ml) se precipitó con ya sea anti-DcR3 o anti-TRAIL (3-5 g) con 20 l de perlas de proteína A de suspensión. Después del lavado, el complejo unido DcR3-TRAIL en las perlas se eluyó con 30 l de tampón de muestra de Laemmli no desnaturalizado 1X, a electroforesis en electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida 12% (SDS-PAGE), se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, que se detectó con biotinilado anti-TRAIL o anti-DcR3 (1-2 mg /ml) seguido de estreptavidina HRP (SA), y se visualizó con un sustrato quimioluminiscente sensible (Pierce, Rockford, IL). Para detectar complejo DcR3-TRAIL soluble en medios de cultivo celular y el complejo unido a la membrana en lisado de células, las muestras con cóctel inhibidor de la proteasa se limpiaron (50 g /ml de PMSF, 1 mg /ml de aprotinina, leupetin, y pepstatina) con la proteína granos y después se incubaron con anticuerpos anti-DcR3 o anti-TRAIL a 4 ° C durante la noche mientras que se agita suavemente. El complejo DcR3-TRAIL unido sobre las perlas se sometió a transferencia de Western de una manera similar a la descrita anteriormente.
ELISA como ensayo
La unión de DcR3 con TRAIL de unión se examinó con una modificado ELISA. Los pocillos se recubrieron con FasL recombinante o TRAIL (100 l de 1 mg /ml). Después las placas se lavaron con tampón de lavado (0,01% Tween 20 en PBS) y se bloquearon con 5% PBS-T (5% de Tween 20 en PBS), 100 l de DcR3 recombinante (1 mg /ml) con o sin TRAIL recombinante o se añadió FasL (10-20 mg /ml, para la competencia) a cada pocillo y se incubó a 4 ° C durante la noche. Después del lavado, el anticuerpo biotinilado-DcR3 (0,2 ng /ml) se añadió a cada pocillo y se incubaron a 37 ° C durante 1 hora; a partir de entonces, se añadieron y se incubaron 100 l de 1:4000 estreptavidina-peroxidasa de rábano (SA-HRP) en pocillos durante 45 minutos a 37 ° C, se lava, se visualizaron con 3, 3 ', 5, 5' tetrametilbencidina (TMB), y se leyó a una longitud de onda de 450 nm. A la inversa, las placas se recubrieron con DcR3 (100 l de 2 mg /ml) y luego incubadas con FasL recombinante o TRAIL (100 l de 1 mg /ml) con o sin DcR3 (20-50 g /ml, para la competencia) , seguido por biotinilado anti-FasL o anti-TRAIL (0,5 g /ml), SA-HRP, TMB y se leyó a a
450.
ELISA para DcR3
DcR3 fue cuantitativamente medido, como se ha descrito previamente 17]. Desde DcR3 es una proteína secretada, se utilizó 100 l de medio de cultivo. Brevemente, se incubó durante la noche con una placa de ELISA recubierta con anti-DcR3 McAb (2 mg /ml) a 4 ° C. Después de varios proteínas se lavaron apagado, el DcR3 unido se detectó con biotina anti-DcR3 AnMc y SA-HRP y se visualizó con sustrato TMB. La concentración de la muestra desconocida se determinó a partir de la curva patrón, que se calculó de forma simultánea.
regulación a la baja de DcR3 con ARN interferente pequeño (ARNip)
interferente pequeño secuencias de ARN para DcR3 humano fueron diseñados utilizando el bloque -Es Diseñador RNAi (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). La secuencia de siRNA fue 5'CGCUGCAGCCUCUUGAUGGAGAUGUCC-3 ', y la secuencia de control de siRNA fue 5'-AGGUAGUUCCAGAACUGCGUGUAGUGG-3'. Ellos se sintetizaron químicamente por caída transitoria de DcR3 en cultivo celular. Además, las secuencias similares se insertaron en el vector de expresión para un pSilencer estable expresante bajo DcR3. La transfección se llevó a cabo con Lipofectamina LTX reactivo (Invitrogen Life Technologies) y los medios de Opti-MEM, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron las células, con la eliminación transitoria de DcR3 plazo de 3 días. Los transfectantes estables se seleccionaron en 50 g /ml de higromicina B. Se agruparon las células supervivientes para evitar la variación de colonias y el uso de
in vivo
estudio.
Ensayos de apoptosis
se detectaron las células apoptóticas con 3 ensayos. Las células se recogieron a las 24-48 horas y se tiñeron con anexina V /yoduro de propidio (PI) para células apoptóticas o fijadas en alcohol 75%, seguido por tinción con PI para la fracción sub-G1, según el protocolo estándar de los fabricantes. Los resultados se analizaron por citometría de flujo. Western Blot se realizó de PARP escindida. Las células recogidas se lisaron con 1% de tampón de lisis NP-40-Tris que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa, y se determinó la concentración de proteína de lisado con el método BCA (Pierce, Rockford, IL). La proteína (30 mg) se cargó en 10% SDS-PAGE, electroforesis, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, se incubaron con 0,5 g /ml de conejo anti exfoliados PARP o anti-GAPDH (como control de carga), seguido de anti-conejo-HRP , y se visualizó con sustrato quimioluminiscente ECL.
ética Animal
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con y aprobado por la Universidad de Rochester (Rochester, NY) Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC ), el Comité Universitario de Recursos Animales (UCAR), como se indica en el
Manual sobre el cuidado responsable y uso de Animales de Laboratorio
. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento y limitar el número de animales. Todo tipo de animales que mostraban signos de debilidad y deshidratación debido al tratamiento recibieron una dieta de comida húmeda. Animales que siguieron a mostrar signos de debilidad fueron sacrificados humanitariamente a través de la dislocación cervical.
El crecimiento del tumor en ratones desnudos
transfectantes de control o transfectantes con baja expresión DcR3 (2 × 10
6 en 0.2 ml de solución salina) se inyectaron por vía subcutánea en las patas traseras de ratones desnudos atímicos (5-6 semanas de edad) con una aguja de 27,5 de calibre. Los tumores se dejaron crecer durante 7 días (aproximadamente 0,1 cm
3) antes del tratamiento. Los ratones portadores de tumores formados por cualquiera de los transfectantes de control o transfectantes con baja expresión DcR3 se dividieron aleatoriamente en 2 grupos (8 ratones /grupo), se trató con solución salina como control o gemcitabina (IV 100 mg /kg) dos veces a la semana durante 4 semanas. Para la curva de crecimiento del tumor, el tamaño del tumor se midió dos veces por semana con calibradores Vernier. Los volúmenes tumorales se calcularon según la fórmula
(L x W2) /2
midiendo la longitud tumoral (L) y la anchura (W). Al final del experimento, los tumores se retiraron y se pesaron. Un ELISA se utilizó para evaluar el nivel de DcR3 en homogeneizado de tumor (30 g). Western Blot se realizó para DcR3, TRAIL, y se escindió de la PARP.
Los análisis estadísticos
Todos los datos se expresaron como la media ± desviación estándar (DE) de al menos 3 determinaciones, a menos que se indique lo contrario. Las diferencias entre los grupos o entre control y tratamiento se determinaron por el estudiante de
t-
prueba o análisis de la varianza (ANOVA).
P
. & Lt; 0,05 indica significación estadística
Resultados
DcR3 unido a TRAIL
TRAIL es un ligando de muerte unida a la membrana con niveles bajos en condiciones normales las condiciones de cultivo, y DcR3 es un receptor señuelo secretado. Aunque FasL, TL1A, y la luz se han identificado como ligandos de DcR3 [14], [15], [16], [17], [18], la interacción de DcR3 con TRAIL no se ha estudiado con gran detalle. Debido a que comparte TRAIL dominios funcionalmente similares con FasL, TL1A, y la luz, especuló que DcR3, que se une a FasL, TL1A, y la luz, también podría unirse a TRAIL.
Para determinar si DcR3 se une a TRAIL, nos estado llevado a cabo el análisis de la unión del arte Biacore. El DcR3 pura recombinante se vincula de manera covalente en la superficie del chip de flujo, y el rastro recombinante pura y la luz (como control positivo) se lava a través de la superficie en varias concentraciones. La Figura 1 muestra la curva de unión de TRAIL a DcR3 a diferentes concentraciones (1 a 2048 nM). Como se muestra en la Tabla 1, a pesar de la constante de equilibrio de control (
K
eq
) de la luz humana recombinante para DcR3 fue de 13,2 nM, la constante de velocidad de asociación (
K
a
) y la constante de velocidad de disociación (
K
d
) para TRAIL humano recombinante para DcR3 eran 1,97 × 10
4 1 /M y 1,04 × 10
1 -3 /s, respectivamente, y el
K
eq
fue 52,8 nM, lo que indica la unión entre RUTA y DcR3; Sin embargo, la afinidad fue menor que la de la luz a DcR3.
ensayos BIOCORE, citometría de flujo, transferencia Western, y se realizaron ensayos de unión similar a ELISA para determinar la interacción física entre DcR3 y TRAIL. análisis (A) Biacore. La curva de unión de TRAIL a DcR3 se determinó a diferentes concentraciones (1 a 2048 nM). El control
K
eq Red de luz humana recombinante para DcR3 fue de 13,2 nM, mientras que el
K
eq Foto de ruta para DcR3 fue 52,8 nM. (B) La citometría de flujo para DcR3 con TRAIL en la superficie celular. células AsPC-1 en suspensión se incubaron primero con PBS, TRAIL (5 g /ml) y sin (carril 2) o con DcR3 (carril 4), DcR3 recombinante (carril 3), o de ratón anti-TRAIL MAb (1 mg /ml) con DcR3 (carril 5). Después de ello, se añadieron 5 g /ml de biotina anti-DcR3 para determinar la unión de DcR3 en la superficie celular con citometría de flujo. (C y D) Citometría de flujo para TRAIL expuesto. La gemcitabina se añadió a AsPC-1 (0 a 1000 nM) o MiaPaCa-2 (0-100 nM) las células para estimular la expresión de TRAIL. Las células también se trataron con PBS, 10 nM de DcR3 siRNA (para reducir la unión y el enmascaramiento de TRAIL), o adicional DcR3 recombinante (para bloquear el Acceso de anti-TRAIL) para detectar TRAIL por citometría de flujo. (E y F) colocalización de DcR3 y TRAIL. ASPC-1 en las células tratadas y sin (como control) o con 500 nM de gemcitabina (para mejorar la expresión de TRAIL) se tiñeron con anti-TRAIL-PE y anti-DcR3-FITC. Doublestained células fueron evaluados con citometría de flujo. (G a L) La inmunoprecipitación y Western Blot para el complejo DcR3-TRAIL. 70-kDa complejo DcR3-TRAIL en 100 l de pura mezcla DcR3 y TRAIL (G y H), lisado (I y J), o medios de cultivo (K y L) de las células AsPC-1 fue capturado con AnMc anti-DcR3 ( G, I, K) o anti-TRAIL (H, J, L) McAb e inmovilizado con 30 l de perlas de proteína a. El complejo de McAb-DcR3-TRAIL se eluyó con tampón de Laemmli y se sometieron a transferencia Western con biotina anti-TRAIL (G, I, K) o anti-DcR3 (H, J, L), seguido de SA-HRP y detector ECL. (M y N) Encuadernación competencia entre las formas libres e inmovilizadas de DcR3 y TRAIL. M: Después de 100 l de 1 mg TRAIL recombinante /ml o FasL se inmovilizó sobre una placa de ELISA, se añadió 1 g /ml de DcR3 sin (sin grupo de competición) o con 10 mg /ml de TRAIL o FasL (Grupo de competencia) o TRAIL hervida o FasL (sin control de la proteína de función), seguido por biotinilado anti-DcR3 y SA-HRP y sustrato TMB. N: DcR3 se inmovilizó sobre una placa de ELISA. TRAIL y FasL se utilizaron como ligandos sin o con 10 mg /ml hervidas o funcionales de TRAIL o FasL en presencia de DcR3, seguido de biotina anti-TRAIL o anti-FasL, y el sustrato SA-HRP y TMB.
para determinar si DcR3 se une a TRAIL, se incubaron previamente AsPC-1 en las células de cáncer de páncreas humano con o sin DcR3 recombinante, TRAIL, o anti-TRAIL McAb, y luego teñidas con biotina anti-DcR3 seguido de estreptavidina-FITC. La citometría de flujo (Fig 1B) demostraron que, mientras que biotinilado anti-DcR3 y solo resultado estreptavidina-FITC en poca tinción de DcR3, DcR3 recombinante podría unirse a la superficie celular y se detectó con anti-DcR3. Debido a la competencia entre TRAIL TRAIL libre y unida a la membrana, TRAIL recombinante reduce DcR3 células de la superficie de unión. Esta unión también se redujo por la preincubación con anti-TRAIL, que bloqueó la accesibilidad de DcR3 a TRAIL unido a la membrana. En conjunto, los datos indican que DcR3 recombinante se une al mapa en la superficie de las células AsPC-1.
Para observar mejor la interacción entre RUTA y DcR3, se utilizó gemcitabina, una primera línea de antipancreatic medicamento contra el cáncer y TRAIL conocida inductor, a upregulate TRAIL. Debido a las diferencias de sensibilidad al fármaco, las células AsPC-1 (Fig 1C) requieren una 10 veces mayor nivel de gemcitabina para aumentar la expresión de TRAIL, en comparación con MiaPaCa-2 células (Fig 1D). La hipótesis de que DcR3 solubles ocultaría TRAIL en la superficie celular; Por lo tanto, la reducción de DcR3 reduciría el enmascaramiento y mejorar la tinción de TRAIL expuesta. Para probar esta hipótesis, se utilizó el enfoque de DcR3 siRNA. La reducción de DcR3 reducida enmascaramiento de TRAIL y una mayor accesibilidad de los anti-TRAIL en células AsPC-1 (figura 1C), mientras que los siRNA de control no tenían tal efecto. Del mismo modo, la hipótesis de que el aumento de DcR3 que rodea las células mejoraría el enmascaramiento y reducir la accesibilidad de los anti-TRAIL TRAIL. Recombinante DcR3 se añadió a las células, provocando de esta manera una tinción reducida de TRAIL como se detecta por citometría de flujo (Fig 1C). Un patrón similar se observó en MiaPaCa-2 (Figura 1D), lo que sugiere que el fenómeno de enmascaramiento TRAIL con DcR3 es común en la línea celular probado. Estos resultados apoyan firmemente la idea de que DcR3 se asocia con TRAIL en la superficie celular.
A fin de determinar la unión de DcR3 a TRAIL, se utilizó gemcitabina para desencadenar la sobreexpresión de TRAIL [19], [20] y DcR3 añadido recombinante. Doble tinción con anti-TRAIL-PE (rojo) y anti-DcR3-FITC mostró una colocalización mejorada (Fig 1F), en comparación con el control (Fig 1E), lo que sugiere que DcR3 se asocia físicamente con TRAIL.
Para confirmar la asociación física de DcR3 con RUTA, se realizó la inmunoprecipitación y Western Blot. FasL, un ligando conocido para DcR3, se utilizó como control positivo. Los resultados mostraron que el complejo de DcR3-TRAIL capturado-anti-DcR3 (aproximadamente 70 kDa MW en condiciones ligeramente desnaturalizantes) podría ser detectado por anti-TRAIL en una mezcla de pura DcR3 recombinante y TRAIL (Fig 1G), lisado (Fig 1I) , medios de comunicación o condicionado (figura 1C) de las células AsPC-1 que expresa tanto DcR3 y TRAIL. Del mismo modo, el complejo de DcR3-TRAIL anti-TRAIL-capturado puede ser detectado por anti-DcR3 en los mismos 3 ajustes (Fig 1H, 1J y 1L). Como control de lado a lado positivo, FasL exhibió un patrón similar a la del complejo DcR3-FasL anti-FasL-capturado detectado por anti-DcR3 (Fig 1G, 1I y 1K), que apoya fuertemente la noción de que TRAIL y FasL se unen a DcR3. En particular, el complejo de DcR3-TRAIL formado no sólo en una condición de proteína pura (Fig 1G y 1H), sino también en una condición natural en forma unida a la membrana (en lisado, Fig 1I y 1J) y en la forma secretora (en medios , Fig 1K y 1L). Las bandas de complejo DcR3-TRAIL en medios eran mucho más finas que las bandas en lisado, lo que indica que el complejo estaba unida a la membrana. Estos resultados fueron consistentes con los obtenidos mediante citometría de flujo.
Para confirmar aún más la asociación de DcR3 con RUTA, se realizó un ensayo similar a ELISA. Cuando TRAIL o FasL se revistió sobre placas de ELISA, la unión de DcR3 a estos ligandos se pudo detectar con anti-DcR3 y reduce por la adición de TRAIL recombinante libre o FasL, que compitió con DcR3 para el TRAIL o FasL inmovilizado (Fig 1M) . En contraste, cuando DcR3 se revistió sobre placas de ELISA, el TRAIL recombinante o FasL obligados a DcR3 inmovilizado y se detectó mediante anti-TRAIL o anti-FasL, que también fue bloqueado parcialmente por la forma libre de DcR3 (Fig 1 N).
En todas las pruebas, el complejo de FasL-DcR3 sirvió como control de lado a lado positivo y mostró un patrón similar a la del complejo DcR3-TRAIL (Fig 1G, 1I, 1K. 1L y 1M), fuertemente apoyando que TRAIL es de hecho un nuevo ligando de DcR3.
Alteración de DcR3 afectada gemcitabina inducida por la apoptosis
Para estudiar la función biológica de DcR3 en el cáncer de páncreas, que mide el nivel de DcR3 por una ELISA cuantitativo para DcR3 [21] en las células de cáncer de páncreas AsPC-1 y MiaPaCa-2. En comparación con SW480, una línea celular de adenocarcinoma de colon humano que se sabe que expresan altos niveles de DcR3, en comparación con otras líneas 13 de células [22], las células AsPC-1 y MiaPaCa-2 tenían un mayor nivel de DcR3 (Fig 2 A), lo cual es consistente con otros informes [23], [24]. Tanto DcR3 y TRAIL expresado en un nivel alto en las mismas células, lo que sugiere que las moléculas anti-apoptóticas y pro-apoptóticos se equilibran en un nivel alto para contrarrestar entre sí. La expresión natural de altos niveles de ambas moléculas hace que el estudio de su interacción mucho más fácil.
(A) Expresión de DcR3 en células SW480 AsPC-1, MiaPaCa-2, y (como control positivo). El nivel de DcR3 en 100 l de medio acondicionado a partir de células que se cultivaron en placas de 6 pocillos (4 ml) se midió con un ELISA. (B y C) La gemcitabina reducción de la expresión DcR3. células ASPC-1 y MiaPaCa-2 fueron tratados con gemcitabina a las concentraciones indicadas durante 48 horas. El nivel de DcR3 se midió en 100 l de medios de cada grupo. (D) siRNA derribado expresión DcR3. Las células (1 × 10
5) en placas de 6 pocillos fueron transfectadas con 10 nM de ARNsi DcR3 o controlar siRNA en TransFectin LTX (6,25 l /pocillo). Después de 24 horas, DcR3 en medios de cultivo se midió con un ensayo ELISA.
Para determinar el efecto interactivo de DcR3 y TRAIL en las células cancerosas, gemcitabina y siRNA para DcR3 se utiliza para regular el nivel de DcR3. Las células AsPC-1 y MiaPaCa-2 fueron tratados con diferentes dosis de gemcitabina durante 48 horas, y el nivel de DcR3 en los medios se midió con un ELISA. Los resultados mostraron que la gemcitabina redujo DcR3 de una manera dependiente de la dosis en ambas líneas celulares (Figura 2B y C). Una reducción similar se observó con siRNA (Figura 2D).
Si la función de DcR3 reducida gemcitabina-es para inclinar la balanza hacia la apoptosis, a continuación, la adición de DcR3 debe revertir la apoptosis inducida por gemcitabina. Así, las células AsPC-1 y MiaPaCa-2 fueron tratados con diferentes dosis de gemcitabina con o sin DcR3 recombinante durante 48 horas, y luego se midieron las células apoptóticas con tinción de anexina V. Los resultados mostraron que el 5-8% de las células fueron apoptóticas en el control, que aumentó a aproximadamente 30% en el grupo de gemcitabina. Esta apoptosis gemcitabina inducida se redujo por la adición de DcR3 recombinante (0, 0,5, 1, y 2 mg /ml) de una manera dependiente de la dosis (figura 3A y 3B). Del mismo modo, el aumento de gemcitabina inducida de la actividad de caspasa 3 se invirtió por DcR3 (figura 3C y 3D). Estos resultados sugieren que DcR3 juega un papel crítico en la inhibición de la apoptosis y que la reducción inducida por gemcitabina de DcR3 podría estar relacionada con su actividad antitumoral.
gemcitabina se añadió a los medios de AsPC-1 (500 nM) o MiaPaCa-2 células (50 nM) se incubaron con 0, 0,5, 1, o 2 mg /ml de DcR3 recombinante durante 24 horas. Las células se sometieron entonces a citometría de flujo para la fracción sub-G1 (A y B) o un ensayo enzimático para la actividad de la caspasa 3 (C y D). apoptosis gemcitabina-triggered se redujo por la adición de DcR3 de una manera dependiente de la dosis (
P
& lt; 0,01).
regulación a la baja de DcR3 con la apoptosis mediada por TRAIL siRNA promovido en vitro
para probar si el desenmascaramiento de TRAIL podría aumentar su accesibilidad a su receptor y potenciar esta vía de la muerte, se examinó el efecto de DcR3 sobre la apoptosis mediada por TRAIL. La fragmentación del ADN (sub-G1) ensayo mostró que cuando las células AsPC-1 se trataron con FasL o LIGHT más control de siRNA o DcR3 siRNA, la apoptosis no aumentó significativamente. Sin embargo, cuando se trataron con TRAIL y DcR3 siRNA, las células AsPC-1 mostraron un aumento dramático en la apoptosis, en comparación con las células tratadas con TRAIL más ARNsi de control (Fig 4A). MiaPaCa-2 células mostraron un patrón similar (figura 4C). La apoptosis mejorada se confirmó además por el aumento de PARP escindida, determinada por Western Blot (Fig 4B y 4D). Los resultados indican que la reducción de DcR3 podría mejorar en gran medida el efecto proapoptótico de TRAIL en estas 2 líneas celulares de cáncer de páncreas (en comparación con FasL y la luz), mientras que DcR3 es utilizado por estas células para contrarrestar el efecto proapoptótico de TRAIL.
células AsPC-1 o MiaPaCa-2 fueron transfectadas con 10 nM de ARNsi de control o DcR3 siRNA, respectivamente. Después de 24 horas, las células fueron tratadas con FasL recombinante, la luz o TRAIL (100 ng /ml para AsPC-1 y 20 ng /ml para MiaPaCa-2 células) durante 24 horas. Las células se recogieron y se sometieron a citometría de flujo para la fracción sub-G1 (A y C) o de Western blot para PARP escindida (B y D). DcR3 siRNA mejora de forma significativa la apoptosis inducida por TRAIL (
P Hotel & lt; 0,05).
DcR3 afectados gemcitabina mediada por apoptosis in vitro
DcR3 siARN y gemcitabina redujo la nivel de expresión de DcR3 (Fig 3 y 4). Quisimos determinar si más regulación a la baja de DcR3 a través de la combinación de estos 2 factores podrían mejorar el efecto proapoptótico, en comparación con un único factor por sí solo. Después las células se trataron con siRNA o solo o en combinación con gemcitabina, se midieron la fragmentación del ADN y PARP escindida. Los resultados mostraron que, mientras que la gemcitabina sola provocó aumento de la apoptosis (Fig 5A y 5C) y los niveles de PARP escindida (Fig 5B y 5D), su combinación con siRNA aumentó aún más la apoptosis y los niveles de PARP escindida (Fig 5). Sin un ligando proapoptótico con la que ligar y contrarrestar, DcR3 siRNA solo no tuvo ningún efecto; sin embargo, cuando TRAIL se upregulated por gemcitabina, la reducción de DcR3 disminuyó el enmascaramiento de TRAIL, promoviendo así la apoptosis.
AsPC-1 o MiaPaCa-2 células fueron transfectadas con 10 nM de ARNsi de control o DcR3 siRNA, respectivamente . Después de 24 horas, las células se trataron con gemcitabina (250 o 25 nM, respectivamente) durante 24 horas. Las células se recogieron y se sometieron a citometría de flujo para la fracción sub-G1 (A y C) o de Western blot para PARP escindida (B y D). La combinación de DcR3 siRNA y gemcitabina mejora de forma significativa el efecto proapoptótico.
Estos resultados son consistentes con los de la Figura 3. En relación con los resultados mostrados en las Figuras 1 y 4, los datos sugieren que la unión DcR3 a TRAIL reduce la apoptosis inducida por TRAIL y protege las células tumorales, lo que podría explicar la resistencia de los tumores al tratamiento TRAIL.
regulación a la baja de DcR3 aumentó el efecto quimioterapéutico sobre el crecimiento tumoral in vivo
Animados por prometiendo
in vitro
resultados, quisimos determinar si la reducción de DcR3 podría aumentar la eficacia de la quimioterapia
in vivo.
células ASPC-1 fueron transfectadas con un vector de expresión de mamífero que contenía ARNsi de knockdown de la expresión de DcR3 y un casete para la selección G418. Las células fueron inyectadas maqueta de transfección de vectores agrupado (como control), o células transfectadas con siRNA DcR3 baja expresión DcR3 (confirmado por ELISA) en ratones desnudos, y los tumores establecidos (60 mm3) fueron luego tratados con gemcitabina. Los resultados mostraron que DcR3 siRNA por sí solo no lento crecimiento tumoral (Figura 6A) o reducir el peso del tumor (Fig 6B);