Extracto
A pesar de la señalización de Wnt se ha demostrado ser importante para la morfogénesis embrionaria y la patogénesis del cáncer de varios tejidos, su papel en desarrollo de próstata y la tumorigénesis no se entiende bien. Aquí nos muestran que la señalización Wnt regulado prostática ramificación morfogénesis epitelial y la diferenciación de células epiteliales luminales en el desarrollo de cultivos de órganos de próstata de rata. Específicamente, la señalización de Wnt regula la proliferación de células progenitoras epiteliales de próstata. Evaluación de los niveles de expresión de una vía de Wnt gen diana transcripcional, AXIN2, mostró que la vía de Wnt se activó en la próstata en desarrollo, pero se había reducido regulado en el adulto. La castración dio lugar a una regulación al alza de AXIN2 mientras que la sustitución de andrógenos dio lugar a una regulación a la baja de AXIN2. Tales cambios dinámicos de la actividad de Wnt también se confirmó en una línea de ratón transgénico BAT-gal en el que reportero β-galactosidasa se expresa bajo el control de β-catenina /factor de célula T elementos de respuesta. Además, se evaluó la función de señalización de Wnt en la tumorigénesis de próstata. Se encontró expresión AXIN2 upregulated en la mayoría de líneas celulares de cáncer de próstata humano examinados. Por otra parte, la adición de un inhibidor de la vía Wnt, Dickkopf 1 (DKK1), en el medio de cultivo inhibió significativamente el crecimiento de células de cáncer de próstata y la migración. Estos hallazgos sugieren que la señalización Wnt regula ductal morfogénesis epitelial prostática ramificación influyendo en la proliferación celular, y pone de relieve el papel de activación de la vía Wnt en la progresión del cáncer de próstata
Visto:. Wang BE, Wang XD, Ernst JA, Polakis P, Gao WQ (2008) la regulación de la morfogénesis epitelial de ramificación y el crecimiento de células cancerígenas de la próstata mediante la señalización de Wnt. PLoS ONE 3 (5): e2186. doi: 10.1371 /journal.pone.0002186
Editor: Hernán López-Schier, Centro de Regulación Genómica, España |
Recibido: 17 Enero, 2008; Aceptado: April 7, 2008; Publicado: 14 de mayo de 2008
Derechos de Autor © 2008 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La vía de señalización de Wnt es crucial en una variedad de proceso biológico incluyendo patrón neural, polaridad planar, el vástago de mantenimiento celular y la diferenciación celular [1]. Esto se ha demostrado en una serie de sistemas, a través de enfoques genéticos y bioquímicos. La señalización de Wnt se inicia mediante proteínas extracelulares, es decir, Wnts, mediante la unión a sus respectivos familia de receptores Frizzled. La señal es entonces transduce a ß-catenina a través de una cascada de moléculas de transducción de señales en el citoplasma. β-catenina a continuación, entra en el núcleo, forma un complejo con TCF y transactiva los genes diana aguas abajo que regulan o participan en varios procesos. La complejidad de la señalización surge en parte de la multitud de los componentes de esta vía, incluyendo, por ejemplo, 19 ligandos Wnt humanos, 1 Wnt factor inhibidor (WIF), 5 secretadas proteínas relacionadas frizzled (SFRPs) que puede secuestrar ligandos Wnt de la unión a sus receptores afines , 2 proteínas relacionadas con el receptor de lipoproteínas de baja densidad de proteínas que modulan la actividad de los receptores frizzled (LRP5 /6) y 4 Dickkopf (DKK) [1], [2].
En la canónica vía Wnt, la estabilización y translocalization de β-catenina en el núcleo es un paso crítico de la activación de la señalización de Wnt. En ausencia de la unión del ligando Wnt, β-catenina está dirigida a la degradación a través de su interacción con la proteína poliposis adenomatosis coli (APC) y la señalización de Wnt se activa mínimamente. Cuando está mutado APC, β-catenina se acumula en el núcleo y la señalización de Wnt es constitutivamente activa [1]. El programa de aguas abajo de señalización de Wnt es poco conocida, y un gen aguas abajo muy útil específico para esta vía es Axin 2, que tras la transcripción y la traducción, actúa como un regulador de realimentación negativa de la vía siginaling Wnt, ayudando β-catenina directa de la degradación en el proteasoma [3], [4]. La estabilización de la proteína β-catenina y la elevación de AXIN2 transcripción se consideran indicadores de activación de la vía Wnt [4].
desregulación de la señalización de Wnt también se asocia con la patogénesis del cáncer de diversos tejidos [5], [6]. alteraciones genéticas en los genes APC causa predisposición para el cáncer colorrectal (Groden, Cell 1991), y la función de supresor de tumores APC de efecto /oncogénico de la vía de Wnt se demuestra claramente en ratones transgénicos APCmin donde se forman numerosos adenomas en el intestino [7]. El papel de la vía Wnt en la tumorigénesis de próstata ha recibido recientemente un aumento de atenciones, pero todavía no se entiende bien. Los estudios recientes informaron de que ciertos ligandos Wnt, como Wnt1 se expresan en líneas celulares de cáncer de próstata y parecen ser elevados en algunos tejidos de tumor de próstata humanos [8]. inhibidores de la vía Wnt específicos como WIF1 parecen ser las reguladas en un porcentaje considerable de las muestras de cáncer de próstata [9]. eliminación prostático específico de gen APC en ratones resulta en la formación de adenocarcinoma [10]. Además, la interacción entre β-catenina y el receptor de andrógenos (AR) se ha demostrado para mejorar la transcripción mediada por AR [11], que desempeña un papel crítico durante la progresión del cáncer de próstata. Elucidar cómo la señalización de Wnt regula el desarrollo de la próstata y la tumorigénesis facilitaría el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de cáncer de próstata.
En un esfuerzo para entender el papel de Wnt de señalización en el desarrollo epitelial prostática, se realizó cultivos de órganos de el desarrollo de la próstata preparadas a partir de ratas postnatales tempranas para determinar los efectos de la modulación de la vía de señalización de Wnt en la morfogénesis epitelial prostática ramificación. Se encontró que la señalización Wnt diferenciación de células epiteliales de próstata regulado a través de influir en la proliferación de células progenitoras epiteliales prostáticas. Además, el análisis TaqMan RT-PCR reveló que varias líneas celulares de cáncer de próstata comúnmente estudiadas y xenoinjertos mostraron activación de la vía Wnt. Por otra parte, Dickkopf1 (DKK1), un inhibidor de Wnt vía [12] - [14], el crecimiento de células de cáncer de próstata inhibió significativamente y la migración. Estos hallazgos juntos sugieren que la activación de la vía Wnt juega un papel crucial durante el desarrollo de la próstata, y el nuevo crecimiento y que la inhibición de la vía Wnt podría ser de valor terapéutico en el tratamiento de la progresión del cáncer de próstata.
Resultados
señalización de Wnt regula la morfogénesis de ramificación epitelial prostática
prostática epiteliales morfogénesis de ramificación en los roedores se produce principalmente después de nacer por la expansión y la ramificación más lejos de los primodia epiteliales [15], [16]. Este proceso puede ser recapitulado en un cómodo sistema de cultivo de órganos [17], [18]. Para examinar si la señalización de Wnt desempeña un papel en la morfogénesis epitelial prostática ramificación, se trataron cultivos de órganos del día 2 (P2) de rata próstatas ventrales postnatales con un ligando Wnt, Wnt3a, o un inhibidor de la señalización de Wnt potente, DKK1 [12]. Como se muestra en la Fig. 1, la próstata en los cultivos de control mostraron extensa ramificación no sólo con los conductos primario y secundario pero, ramas finas también terciarias después de 7 días en cultivo (Fig. 1A). Sin embargo, el tejido en los cultivos tratados con Wnt3a a una concentración de 50 nM muestran embotado, consejos ductales agrandados (flecha en la Fig. 1B) y un número reducido de ramas terciarias, finas. Próstatas tratados con DKK1 en 400 nM, la próstata aparecido más pequeño en tamaño y tenía menos ramas epiteliales. Sin embargo, en contraste con próstatas tratadas con Wnt3a, DKK1 tratada próstatas agrandadas carecían consejos ductales (Fig. 1C). La cuantificación de estos cultivos mediante la medición de los diámetros de las próstatas cultivadas y las puntas de los conductos y contando los puntos de ramificación de estos cultivos mostró diferencias estadísticas entre los cultivos de control y los cultivos tratados con Wnt3a en los 3 aspectos (Fig. 1D-F). Estos resultados sugieren que tanto la activación y la inhibición de la señalización de Wnt afectan negativamente a la morfogénesis epitelial prostática ramificación, y ponen de relieve la importancia de la señalización de Wnt-regulada con precisión para el correcto desarrollo de la próstata.
Mount próstatas ventrales enteras se han preparado a partir de P2 ratas y se mantuvo durante 7 días en medio libre de suero en ausencia (a) o presencia de 50 nM de Wnt3a (B) o 400 nM de DKK1 (C). Patrones similares se observaron consistentemente en 3 experimentos repetidos de 5-6 órganos de próstata por grupo en cada experimento individual. Tenga en cuenta que la adición de cualquiera de Wnt3a o DKK1 a la cultura dio como resultado un cambio en la morfogénesis epitelial de ramificación. La cuantificación de los cultivos mediante la medición del diámetro de las próstatas cultivadas (D) y las puntas de los conductos (E) utilizando software Axiovision y los puntos de ramificación (F) se realizaron mediante el análisis de 4 cultivos seleccionados al azar por grupo. Los datos se expresan como media + SEM (t-test, en comparación con los cultivos de control). Bar, 400 micras.
Wnt influencias de señalización proliferación y diferenciación celular en el epitelio de próstata desarrollo
epitelio prostático se compone principalmente de basales y células luminales junto con una población menor de células neuroendocrinas [19]. Se cree que las células basales p63 expreso [20], citoqueratina 14 (CK14) y CK5 y para contener la población de células progenitoras [21]. Las células luminales expresan CK8 o CK18, y en general son post-mitótico y células diferenciadas terminalmente. En roedores, casi todas las células epiteliales son células progenitoras y están proliferando hasta P5 cuando algunos de los progenitores sufren mitosis terminal y se diferencian en células luminales que expresan solamente CK8 o CK18 [19]. Para determinar si la modulación de la señalización de Wnt influye en la diferenciación de los progenitores en células luminales, se realizó inmunohistoquímica en secciones de los cultivos de órganos de próstata utilizando basal y marcadores de células luminales, p63 y CK8, respectivamente. Como se muestra en la Fig. se observaron 2, más células positivas p63 en la región ductal de cultivos tratados con Wnt3a (Fig. 2B) que los cultivos de control (Fig. 2A). Por el contrario, un menor número de células positivas p63 estaban presentes en los cultivos tratados con DKK1 (Fig. 2C). Las células que fueron etiquetados por DAPI tinción nuclear en el epitelio, pero negativas para p63, representan aquellas células luminales diferenciados, lo que fue confirmado por CK8 inmunotinción (datos no mostrados). Los recuentos de células a partir de cultivos seleccionados al azar de los 3 grupos revelaron que el porcentaje de células basales más de la población total de células epiteliales dentro de una unidad ductal individuo dado fue significativamente mayor en los cultivos tratados con Wnt3a en comparación con cultivos de control (Fig. 2D). En contraste a la acción Wnt3a, las proporciones de células basales vs células epiteliales totales fueron significativamente inferiores en los cultivos tratados con DKK1 que en los cultivos de control (Fig. 2C). La inmunotinción usando un anticuerpo CK8 mostró un patrón complementario: Wnt3a resultó en una reducción en el número de células luminales mientras que DKK1 condujo a un número mayor de células luminales (datos no mostrados). El cambio en la basal vs. células epiteliales totales no fueron atribuibles a la muerte celular como el etiquetado TUNEL sólo detectó mínima, señales de fondo con ninguna diferencia entre los tres grupos de los cultivos (datos no mostrados).
Las secciones de tejido se contratiñeron con DAPI (azul). Mientras p63 células positivas (púrpura) representan células basales, donde residen las células progenitoras, las células azules (flechas) que son negativas para p63 en el epitelio luminal son células diferenciadas. (D) La cuantificación de las células positivas p63 sobre las células epiteliales totales. Los datos fueron recolectados a partir de 22-27 unidades ductales seleccionados al azar de las secciones de los cultivos de órganos por grupo y se expresan como media ± SEM (t-test). Tenga en cuenta que mientras que Wnt3a condujo a un aumento significativo en el número de células basales, DKK1 resultó en una reducción en las células basales. Bar, 50 micras para AC.
Dado que los tratamientos Wnt3a y DKK1 conducido a una mayor y disminución del número de células positivas para p63, respectivamente, que están compuestos principalmente de los progenitores en esta etapa temprana de desarrollo, hemos tratado para determinar si Wnt3a y DKK1 afectarían a la proliferación de células progenitoras en estos cultivos de órganos de próstata utilizando bromo-desoxiuridina (BrdU) e inmunohistoquímica Ki67. Como se muestra en la Figura 3, después de un tratamiento de 3 días, se observaron más células en proliferación en los cultivos tratados con Wnt3a (Fig. 3C, D), y un menor número de células en proliferación en los cultivos tratados con DKK1 (Fig. 3E, F), en comparación a los cultivos de control (Fig. 3A, B). Los recuentos de células se realizan a partir de campos seleccionados al azar indicaron que hubo un aumento de 1,63 veces en el número de células Ki67 positivas en los órganos de próstata tratados con Wnt3a en comparación con cultivos de control (Fig. 3G). En contraste, no hubo una disminución significativa en el número de células Ki67 positivas en los órganos de próstata tratados con DKK1 (Fig. 3G). En consonancia con los ensayos de incorporación de BrdU, nuestra inmunohistoquímica de Ki67 de las culturas 7 Días también mostró la proliferación de células que mejoran y que inhiben efectos similares por Wnt3a y DKK1, respectivamente (Fig. 3H). Para entender cómo la proliferación celular está regulada por la señalización de Wnt durante el desarrollo de la próstata, se examinaron los patrones de expresión de varios genes de ciclina en un estudio de microarrays separada de desarrollar próstatas de ratón. Se encontró que la expresión de ciclina B2 fue significativamente mayor en P4 de datos P19 y 10 semanas de edad ratones (aproximadamente de 4 y 8 veces, respectivamente) y que la asociación de la ciclina B2 con el desarrollo de la primera era mucho más fuerte que los de otras ciclinas (no mostrado). Para confirmar si la proliferación elevada, sobre la base de la tinción de Ki67, visto en el cultivo de órganos puede ser en parte mediada por ciclina B2, se realizó un análisis TaqMan RT-PCR de estos cultivos. Como se muestra en la Fig. 3I, la expresión de la ciclina B2 fue de aproximadamente 118,8 veces mayor y aproximadamente 4,5 veces menor en los cultivos de órganos tratados con Wnt3a y DKK1, respectivamente. En conjunto, estos resultados sugieren que la señalización de Wnt regula la diferenciación terminal de las células basales en las células luminales mediante el control de la proliferación y /o mantenimiento de las células progenitoras epiteliales.
(AF) muestra son anti-BrdU anticuerpo (B, D, F) y DAPI (a, C, e) el doble etiquetado de las culturas P3 de rata de la próstata ventral de órganos se mantuvo durante 3 días en ausencia (a, B) o presencia de 50 nM de Wnt3a (C, D) o 400 nM de DKK1 (E, F). (GRAMO). La cuantificación de células BrdU-positivas en un campo visual de 434 micras dado × 322 micras. (H) La cuantificación de las células Ki67 positivas en los cultivos P2 próstata mantenidas durante 7 días, que se normalizó a los cultivos de control. Los recuentos de células (por G y H) se realizaron a partir de los campos visuales seleccionados al azar de 5 cultivos de órganos por grupo y los datos se expresaron como media ± SEM (t-test). Tenga en cuenta que mientras que Wnt3a mejora de forma significativa la proliferación de células progenitoras, DKK1 inhibió la proliferación de células progenitoras. (YO). Expresión cambio de nivel de la ciclina B2 en P2 cultivos de órganos de próstata de rata .. Los datos fueron recolectados a partir de cultivos de órganos 4 mantenidas durante 2 días por grupo y se expresan como media ± SEM (t-test). Tenga en cuenta que la expresión de la ciclina B2 se reguló por Wnt3A, pero las reguladas por DKK1. Bar, 100 m de la FA.
Los cambios dinámicos de la activación de Wnt de señalización durante el desarrollo de la próstata, después de la castración y posterior al reemplazo de andrógenos
Para proporcionar una prueba más de apoyo para el papel de la señalización Wnt en el mantenimiento de progenitores epiteliales de la próstata, se realizó RT-PCR cuantitativa usando AXIN2 como un indicador para la activación de la señalización Wnt con el tejido de próstata preparada a diversos puntos de tiempo de desarrollo. Se encontró que los niveles de AXIN2 fueron los más altos en P2, pero declinó con el tiempo como la próstata madurado (Fig. 4A). Estos datos sugieren que la señalización de Wnt es más activo en las primeras etapas de desarrollo de la próstata, en consonancia con una población de células progenitoras más alto que en próstatas completamente desarrolladas donde la mayoría de las células epiteliales son células luminales terminalmente diferenciadas.
(A ) Una regulación a la baja gradual de AXIN2 desde recién nacidos hasta adulthood.nbsp; (B) AXIN2 se reguló después de la castración, pero regresó a los bajos niveles normales después de reemplazo de andrógenos. Los datos se obtuvieron de 4-6 muestras por grupo y se expresan como media ± SEM (t-test, en comparación con próstatas normales de un adulto). Abreviatura: N, próstata normal; C3, 3 días después de la castración, C17; 17 días después de la castración; T + C14. 14 días después de la castración + 3 días de tratamiento con testosterona.
Estudios anteriores han demostrado que la parte del compartimento de células basales sobre las células epiteliales totales en el epitelio de la próstata se altera después de la castración y la sustitución hormonal [22 ]. retirada de andrógenos inducida por la castración se conoce a agotar aproximadamente 90% del contenido epitelial [23] y los resultados en el enriquecimiento de la población de células basales /progenitoras. El reemplazo de andrógenos a su vez conduce a la proliferación de las células progenitoras y su diferenciación en células luminales, lo que resulta en la próstata re-crecimiento de nuevo a su tamaño normal [24]. Se realizó cuantitativa en tiempo real RT-PCR para comparar los niveles de expresión de AXIN2 en próstatas recogidas de ratones normales, ratones después de 3 días y 17 días después de la castración y ratones después de 3 días de reemplazo de testosterona después de la castración. Como se muestra en la Fig. 4B, los niveles AXIN2 eran 1,5 veces y 1,7 veces mayor en próstatas 3 y 17 días después de la castración, respectivamente, pero se negó 3 días después de reemplazo de testosterona. Estos datos tanto de desarrollo y vuelva a crecer próstatas indican que la señalización Wnt está positivamente correlacionado con el número de células basales y inversamente correlacionada con la diferenciación de células progenitoras en las células luminales en próstatas.
A continuación examinó una línea de ratones transgénicos BAT-gal en el que β-galactosidasa reportero se expresa bajo el control de β-catenina de factor /Tcell elementos de respuesta [25]. Esta línea de ratones se ha demostrado que ser
bona fide
in vivo indicadores de señalización de Wnt /β-catenina, lo que permite la visualización de la situación general de la activación de Wnt en las células en un tejido dado. El examen de las secciones de tejidos preparados a partir de próstatas en diferentes etapas incluyendo P5 (próstatas en desarrollo, la Fig. 5A-C), adulto (maduro próstatas, Fig. 5D-F)), después de la castración (Fig. 5G-I) y después del reemplazo de andrógenos (Fig. 5J-L), indicó que el número de células β-galactosidasa-positivos fue mucho mayor en próstatas en desarrollo, de próstatas adultos (28,7 ± 6,9 /conducto, n = 10 vs. 1,92 ± 0,4 /conducto, n = 13 , Fig. 5M). La castración condujo a un número elevado de células β-galactosidasa-positivos (5,2 ± 0,7 /conducto, n = 13), pero el reemplazo de andrógenos resultó en un número más bajo que era equivalente al nivel normal en próstatas adultos (2,3 ± 0,5 /conducto, n = 15, Fig. 5M). Además, se encontró que la actividad de Wnt se observó exclusivamente en células epiteliales, principalmente en el compartimiento de células basales, donde residen las células progenitoras. Además, el doble etiquetado de estas secciones de tejido con anticuerpo anti-p63, un marcador de células basales, y el anticuerpo anti-β-galactosidasa reveló que en el adulto, la gran mayoría de las células β-galactosidasa-positivos fueron co-etiquetado con anti- anticuerpos p63 (flechas en la Fig. 5A-L y N), aunque en próstatas postnatales, hubo notable número de células β-galactosidasa-positivas en la capa de células luminal, lo que podría ser debido a una posibilidad de retraso en la degradación de la actividad β-galactosidasa en las células mitóticas terminal que salieron del ciclo celular para diferenciarse en células luminales. Por lo tanto, estos resultados no sólo confirman los cambios dinámicos de la actividad de Wnt durante el desarrollo de la próstata y el nuevo crecimiento obtenidos por análisis TaqMan RT-PCR de la expresión AXIN2, sino que también proporcionan apoyo adicional para la asociación de señalización Wnt con las células basales de la próstata donde las células progenitoras son por lo general cree que residen.
inmunotinción doble de secciones de tejido de próstata con anti-β-galactosidasa (verde en la a, D, G, J) y anti-p63 (rojo, en B, e, H, K) anticuerpos, preparada a partir de ratones de P5 (AC), adulto (DF), 14 días post-castración (GI) y 14 días después de la sustitución de andrógenos (JL). Las secciones se contratinción con DAPI (azul). Mientras que las flechas indican las células que co-expresa p63 y β-galactosidasa, punta de flecha (fig. 1A-C) muestra una célula que es positivo ß-gal pero p63 negativo en el desarrollo de la próstata. Tenga en cuenta que las células β-galactosidasa que expresan se encuentran exclusivamente en el epitelio, y principalmente en el compartimento de células basales en la próstata adulta, aunque un número notable de la se ven en la capa de células luminal en el desarrollo de la próstata. Bar, 50 micras. (M) La cuantificación de la β-gal células positivas por unidad ductal epitelial, que se determina en las secciones de tejido a base de DAPI contratinción y la presencia de un lumen epiteliales. (N) Los recuentos de células β-gal de las células positivas frente a las células basales p63 totales (células positivas). Los datos fueron recolectados a partir de 14-20 unidades ductales seleccionados al azar en secciones de 4-5 próstatas por grupo y se expresan como media ± SEM (t-test, en comparación con próstatas normales de un adulto).
Inhibición de Wnt de señalización conduce a la supresión de la proliferación celular y la migración de las células de cáncer de próstata
señalización aberrante Wnt se ha observado en muchos tumores [5], [6]. Para determinar si la señalización de Wnt desempeña un papel en la tumorigénesis de próstata y la progresión del tumor, se evaluó el estado de la señalización de Wnt en líneas celulares de cáncer de próstata humano y 2 xenoinjertos de tumores de próstata humanos mediante la medición de los niveles de expresión de AXIN2. Como se muestra en la Fig. 6, análisis cuantitativo de RT-PCR reveló que AXIN2 se expresó en niveles más altos en PC3, líneas DU145 y LNCaP celulares y muestras de xenoinjerto de tumor de próstata humano (LuCaP35 y LuCaP77) [26], que las células epiteliales de próstata humanos normales o no tumorigénicas como células PREC y BPH1 [27]. Por lo tanto, la señalización de Wnt es upregulated en células de cáncer de próstata en comparación con las células epiteliales normales de la próstata.
análisis TaqMan RT-PCR de la expresión AXIN2 en diversas células epiteliales de la próstata humana y células cancerosas. Se recogieron datos de trillizos y se expresan como media ± SEM (t-test). Tenga en cuenta que la expresión AXIN2 es mucho mayor en las líneas de próstata de células de cáncer (LNCaP, Du145, PC3) y xenoinjertos de tumor de próstata humano (LuCaP35, LuCaP77) en comparación con células primarias epiteliales de próstata (PrEC) o células epiteliales de próstata inmortalizadas no tumorigenenic (BPH1) .
a continuación evaluó si Wnt3a o DKK1 tratamiento podría afectar el crecimiento de las células PC3. Mediante la medición de la proliferación celular utilizando
incorporación de 3H timidina, encontramos que el tratamiento de los cultivos con Wnt3a resultó en un aumento significativo en la proliferación celular (Fig. 7A). En contraste, el tratamiento DKK1 reduce la proliferación celular de una manera dependiente de la dosis (Fig. 7A). Resultados similares se observaron también en células LNCaP (datos no mostrados).
Para examinar si la señalización de Wnt también afecta a la migración de células de cáncer de próstata o la motilidad celular, hemos realizado experimentos de migración celular con las células PC3. Como se muestra en la Fig. 7B, la adición de Wnt3a en el medio de cultivo dio lugar a un número mayor de células migradas, mientras que DKK1 inhibe la migración celular, en comparación con el cultivo de control. En contraste, el tratamiento de las células BPH1 en el que la expresión AXIN2 fue baja o no detectable (Fig. 6) con DKK1, no se observaron efectos inhibitorios sobre la migración de células (datos no presentados). Por otra parte, ya sea la tinción con azul de tripano o clasificación FACS utilizando anexina 5 inmunotinción no reveló la muerte celular mejorada en los cultivos tratados con DKK1 (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la señalización de Wnt contribuye a un aumento de la motilidad celular, que a su vez puede promover la invasión y /o metástasis de las células de cáncer de próstata
.
(A) incorporación de timidina tritiada en cultivos de PC3 en ausencia o presencia de Wnt3a o DKK1. Mientras que la alta concentración de Wnt3a (10 nM) una mayor proliferación de células PC3, DKK1 inhibió la proliferación PC3 de manera dependiente de la dosis. (B) La regulación de la migración celular PC3 por la señalización de Wnt. Los datos fueron recolectados a partir de cultivos de 6-8 por grupo y se expresan como media ± SEM (t-test). Tenga en cuenta que Wnt3a aumentó el número de células que migraron, mientras que DKK1 inhibe la migración celular.
Discusión
El papel de la señalización de Wnt durante el desarrollo de la próstata
En este estudio, se investigado el papel de vía de señalización Wnt en la próstata primero desde una perspectiva de la biología del desarrollo y luego como una extensión, en un proceso patogénico estrechamente relacionado, es decir, la tumorigénesis. La
ex vivo
experimentos de cultivo de tejido prostático postnatales no sólo permite la supervisión conveniente de los efectos de factores de crecimiento o agentes inhibidores sobre el desarrollo de próstata temprano, sino que también permite la realización de los experimentos, incluso cuando el suministro de reactivos es bastante limitado. Este sistema se ha utilizado anteriormente en la aclaración de la función de las hormonas androgénicas, los componentes del tejido y varias nuevas vías en prostática morfogénesis y desarrollo de la primera [17] ramificación, [18], [28] - [30]
Tenemos examinado directamente la función de señalización de Wnt durante el desarrollo de la próstata mediante el uso tanto de señalización Wnt estimulante y factores inhibidores, Wnt3a y DDK1, respectivamente. La adición del ligando Wnt, Wnt3a, resulta en la proliferación celular mejorada y una reducción de la diferenciación celular epitelial luminal, mientras que el tratamiento con el inhibidor de Wnt vía, DKK1, la diferenciación celular y la proliferación celular mejorada reducida. La modulación de la proliferación celular por la señalización de Wnt se puede atribuir, en parte, a niveles alterados de la ciclina B2, como moléculas de ciclina se informó anteriormente para jugar un papel en la proliferación de células de próstata [31], [32]. Estos datos en conjunto sugieren que el requisito para la señalización Wnt en la próstata morfogénesis de ramificación está regulada fuertemente y delicadamente como el aumento o disminución de la actividad de Wnt podría afectar negativamente a la morfogénesis de ramificación de próstata en cultivos ex vivo. Por otra parte, el análisis de los niveles de ARN mensajero de AXIN2 y la expresión de β-galactosidasa en BAT-gal ratones transgénicos como indicadores de la actividad de la vía Wnt en próstatas postnatal también sugieren que la vía Wnt es más activo en el desarrollo de la próstata que próstatas maduros.
Asociación de células basales de señalización Wnt y de la próstata, donde en general se cree que las células progenitoras a residir
Nuestros resultados de cultivos de órganos de las próstatas en desarrollo son consistentes con el papel de la señalización de Wnt en el mantenimiento de las células progenitoras en otros tejidos tales como la delgado [33], de la glándula mamaria [34] y el sistema hematopoyético [35]. Además, la correlación de las células basales, donde en general se cree que las células progenitoras a residir con la activación de la vía de Wnt también se observa durante la próstata re-crecimiento después de la castración y la sustitución hormonal. células progenitoras epiteliales de la próstata son independientes de andrógenos para la supervivencia. En consecuencia, los estudios anteriores han demostrado que después de la castración, la población de células progenitoras epiteliales de la próstata se ha mejorado o enriquecido [30], [36], [37] debido a la apoptosis de, la población luminal diferenciación terminal dependiente de andrógenos de células epiteliales. A la inversa, cuando se sustituye la próstata andrógeno se activa para volver a crecer a su tamaño original atribuible a una mayor proliferación de las células progenitoras y su posterior diferenciación en nuevas células luminales. Usando AXIN2 como indicador molecular, se encontró que Wnt es upregulated después de la castración, pero se regula hacia abajo después de la sustitución de andrógenos, lo que corresponde bien con el contenido de las células progenitoras en la próstata. patrón dinámico similar de actividad de Wnt se observó en los ratones transgénicos BAT-gal. Represión de la vía de señalización Wnt después de la sustitución hormonal, como se indica por la baja regulación de AXIN2 mRNA o el número de células β-galactosidasa-positivo reduce puede ser debido a una interacción entre β-catenina y la vía AR. β-catenina se ha demostrado capaz de interactuar con AR y funciona como un co-activador de la AR [38]. Es posible que siguientes ligando de unión, la forma activa de la AR, además de su función normal como un factor de transcripción para el desarrollo de la próstata, también se une y secuestra β-catenina nuclear, lo que lleva a una reducción en la piscina de β-catenina disponible para β-catenina-TCF trans-activación [38]. Como resultado de la señalización de Wnt reducido, las células progenitoras de próstata entonces serían inducidas a diferenciarse en células luminales. Tomados en conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de apoyo para la función de señalización de Wnt en el mantenimiento de células progenitoras en el epitelio de la próstata.
Consecuencias de la señalización de Wnt en el crecimiento de células de cáncer de próstata
La evidencia creciente sugiere que la Wnt vía también puede contribuir a la progresión del cáncer de próstata [39]. Varios ligando Wnt incluyendo Wnt1 y Wnt2 están regulados en muestras de tumores de próstata humanos [40], [41]. sFRP3 puede suprimir el crecimiento de células tumorales de próstata y la invasión [42]. Dkk3 Recientemente se ha demostrado que el regulado en muestras de tumores de próstata humanos, y el tratamiento puede inhibir DKK1 próstata crecimiento de células tumorales [43]. Más recientemente, se ha informado que los adenocarcinomas se forman en una APC supresión modelo de ratón específico de la próstata [10]. Nuestro estudio indica que AXIN2 es elevada en varias líneas celulares de cáncer de próstata humano y los tumores de próstata humanos de xenoinjerto en comparación con PrEC humano normal y las células epiteliales de próstata humanas inmortalizadas no tumorigénicas, proporcionando un mayor apoyo para un papel oncogénico para activación de la vía Wnt en la tumorigénesis de próstata. Además, nuestra conclusión de que el tratamiento DKK1 inhibe significativamente el crecimiento de células de cáncer de próstata y la migración refuerza esta idea. Debido a las dificultades inherentes asociados con la producción y purificación de una gran cantidad de DKK1 requerido para los experimentos de xenoinjerto in vivo, la vivo experimento de xenoinjerto de cáncer de próstata en los no se ha realizado, pero se justifica en el futuro para confirmar los efectos inhibidores sobre DKK1 en próstata el crecimiento y progresión tumoral.
Un modelo de cáncer de células madre ha sido recientemente propuesto para muchos tipos de cáncer. En el caso de cáncer de próstata, cáncer de células madre son aquellas que se cree que es independiente de andrógenos para la supervivencia. Dado el hecho de la señalización de Wnt es importante para la proliferación celular y la diferenciación durante el desarrollo normal y se asocia con las células basales, donde en general se cree que las células progenitoras a residir durante la re-crecimiento después de la castración y el reemplazo de andrógenos, sería interesante determinar si la vía Wnt también está asociado con las células madre del cáncer de próstata que pueden desempeñar un papel crucial en la resistencia a los andrógenos y la progresión del cáncer de próstata en etapa tardía.