Extracto
Antecedentes
El glioblastoma es el tumor maligno más frecuente y más cerebral primario con un mal pronóstico. La traducción de estrategias terapéuticas para el glioblastoma de la fase experimental a la clínica ha estado limitado por la insuficiencia de los modelos animales, que carecen de las características importantes de los tumores humanos. La terapia génica lentiviral es una opción terapéutica atractiva para el glioblastoma humano, que se validó en un modelo animal clínicamente relevante.
Metodología /Principales conclusiones
Se utilizó un modelo de xenoinjerto de roedor que recapitula la invasivo y angiogénico características de glioblastoma humano para analizar el patrón de transducción y la eficacia terapéutica de los vectores pseudotyped lentiviral. Tanto las células de glioblastoma humano, glicoproteína virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV-GP) y vesicular glicoproteína del virus de la estomatitis (VSV-G) pseudotyped lentiviral vectores transducen de manera muy eficiente
in vitro Opiniones y
in vivo
. Por el contrario, los vectores pseudotyped gammaretroviral, similares a los evaluados para el tratamiento clínico de glioblastoma, la transferencia de genes mostraron ineficaces
in vitro
y
in vivo
. Ambos vectores lentivirales pseudotipados transdujeron células madre como el cáncer se caracterizan por su CD133-, nestin- y SOX2-expresión, la capacidad de formar esferoides en medio de células madre neurales y para expresar marcadores astrocíticos y diferenciación neuronal en condiciones de suero. En un enfoque terapéutico usando el herpes simplex gen suicida timidina quinasa del virus (HSV-1
-tk
) fusionada a eGFP, ambos vectores lentivirales mediadas una remisión completa de tumores sólidos como se ve en la RM que resulta en una supervivencia muy significativa beneficio (p & lt; 0,001) en comparación con grupos de control. En todos los tumores recurrentes, las células tumorales supervivientes eGFP-positivos se encontraron, abogando por la aplicación profármaco durante varios ciclos para incluso aumentar y prolongar el efecto terapéutico.
Conclusiones /Importancia
En conclusión, los vectores pseudotyped lentiviral son candidatos prometedores para la terapia génica de glioma en los pacientes. La entrega de genes ineficaz por vectores gammaretroviral está en línea con los resultados obtenidos en la terapia clínica de GBM y por lo tanto confirma la alta reproducibilidad del modelo animal glioma invasiva para la investigación traslacional
Visto:. Huszthy PC, Giroglou T, Tsinkalovsky O, Euskirchen P, Skaftnesmo KO, Bjerkvig R, et al. (2009) La remisión de la invasivo, cáncer Stem-Como glioblastoma xenoinjertos Uso de Terapia Génica Mediada por suicidio-vector lentiviral. PLoS ONE 4 (7): e6314. doi: 10.1371 /journal.pone.0006314
Editor: Chris Jones, Instituto de Investigación del Cáncer, Reino Unido
Recibido: 9 Marzo, 2009; Aceptado: June 23, 2009; Publicado: 20 Julio 2009
Derechos de Autor © 2009 Huszthy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Noruega (concesión de 186.492 a SM), la Sociedad Noruega del cáncer, Helse chaleco, hospital Universitario de Haukeland, el Programa de Investigación Bergen traslacional, el 6º Programa Marco Europeo Comisión (Contrato 504.743) y por el Programa de Koeln fortuna en la Universidad de Colonia (28/2006 subvención a SM). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el glioblastoma es el tumor cerebral primario más frecuente y más maligna. A pesar de los avances en neurocirugía, radioterapia y la quimioterapia, el pronóstico de los pacientes sigue siendo pobre, con una supervivencia media de 14 meses [1].
Un inconveniente importante en la investigación del cáncer de cerebro de la traducción ha sido la falta de modelos animales adecuados. Syngeneic- o xenoinjertos de tumores basados en líneas de células de glioblastoma cultivadas como monocapas crecen como circunscrito y lesiones altamente angiogénicos
in vivo
[2], que carece de las células tumorales invasivas, que representan una característica importante de glioblastoma humano. Las células invasoras migran lejos de la masa inicial del tumor y pueden causar tumores recurrentes en diferentes regiones del cerebro. Por lo tanto, estas células representan un objetivo terapéutico importante.
Un modelo establecido recientemente en la que esferoides basado en la biopsia de glioblastoma se pasa en serie en los cerebros de ratas desnudas muestra altamente invasivos y características angiogénicas [3]. Por lo tanto, este modelo es muy adecuado para el estudio de nuevas estrategias terapéuticas. Aún así, los informes que utilizan este u otros modelos clínicamente relevantes para la terapia experimental son escasos. Recientemente, hemos analizado el potencial terapéutico de la Herpes oncolítico vector G207 basado en HSV-1 en el modelo basado en GBM esferoide biopsia. El volumen del tumor en los animales tratados se redujo en comparación con los grupos control, pero no había ninguna ventaja en la supervivencia significativa [4]. Por el contrario, la misma terapia fue más eficaz en un modelo animal basado de línea celular [5] y, como resultado Actualmente se está investigando en una fase I /II estudio clínico [6]. En la presente investigación se utilizó el modelo de xenoinjerto invasivo para evaluar la transducción y la eficacia terapéutica de los vectores pseudotyped lentiviral.
gammaretroviral vectores derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) han sido los retrovirus utilizados con más frecuencia para la terapia génica de tumores cerebrales [7] - [10]. Sin embargo, a pesar de los resultados prometedores en modelos animales, las pruebas clínicas utilizando sobrenadantes de vectores retrovirales o células de empaquetamiento retrovirales han fracasado [11] - [13]. Un inconveniente importante de los vectores gammaretroviral es la transducción exclusiva de las células en división, ya que en gliomas humanos, la mayoría de las células tumorales no se dividen dentro de una ventana de tratamiento dado. Por lo tanto, los vectores lentivirales con su capacidad para transducir células también que no se dividen son candidatos atractivos para el tratamiento de cáncer cerebral. En estudios anteriores, hemos desarrollado gammaretroviral y vectores lentivirales pseudotipados con las glicoproteínas (GP) del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) [14], [15]. Estos vectores tienen una amplia gama de huéspedes y se pueden concentrar por ultracentrifugación de
in vivo sobre las aplicaciones. Además, LCMV-GP no es citotóxico, y las líneas celulares de empaquetamiento estables recombinantes puede ser establecida [16], [17]. Recientemente, se demostró que los lentivirus pseudotipos LCMV-GP entregados de manera eficiente los transgenes a células de glioma de rata
in vivo
, mientras que las neuronas no residentes fueron transducidas [18]. Además, hemos demostrado un efecto terapéutico significativo de LCMV-GP vectores lentivirales pseudotipados en el modelo de glioma 9L de rata basado en células de línea utilizando el gen suicida HSV-1-
tk
. VSV-G pseudotipos lentiviral también mostraron una eficacia significativa, similar a la de pseudotipos LCMV, que fue mediado principalmente por un efecto espectador de las células normales del cerebro transducidas [19].
En el trabajo presentado, que puso de manifiesto que tanto células de glioma humano, VSV-G pseudotyped y lentivirus LCMV-GP transducidas eficientemente
in vitro
y
in vivo
, mientras que la transducción gammaretroviral era ineficiente. La transferencia de genes a células de glioma fue eficiente para ambos tipos de vectores pseudotyped lentiviral. Sin embargo, fue más específica utilizando vectores pseudotyped LCMV-GP, como VSV-G pseudotipos también transducen las células del cerebro de acogida en zonas invasivas. Análisis de las células tumorales transducidas reveló que ambos vectores lentivirales dirigidos CD133-positivo, así como células de cáncer de CD133-negativos. Además, las células de glioblastoma transducidas expresan marcadores de células madre de la nestina y Sox2. Es importante destacar que, cuando se evalúa para la aplicación terapéutica usando HSV-1-
tk
como un transgén, ambos vectores lentivirales mediada regresión completa del tumor en la RM, lo que resulta en un beneficio de supervivencia altamente significativa (p & lt; 0,001) en comparación con los grupos de control .
Materiales y Métodos
Ética Declaración
la colección de biopsia de tejido humano fue aprobado por el comité de ética regional. El manejo de los animales y los procedimientos quirúrgicos se realizaron de conformidad con la Ley de Animales de Noruega y el comité de ética local aprobó el protocolo.
Las líneas celulares
La línea celular de riñón embrionario humano 293T (ATCC número CRL-11268) y la línea celular TE671 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se mantuvieron en medio eagle modificado de Dulbbeco (DMEM) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 1% de glutamina. Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
cultivo de tejidos
fragmentos tumorales de pacientes de glioblastoma multiforme se obtuvieron durante la cirugía. Las muestras de tejido fueron tomadas de las zonas tumorales viables que correspondían a las regiones con realce de contraste en MRI-scan preoperatorios. Las muestras se transfirieron a tubos de ensayo que contienen medio de crecimiento completo, y esferoides se prepararon como se describe anteriormente [20]. El mismo método se aplicó para el material tumoral a pases en ratas desnudas. Brevemente, las muestras de tejido se desmenuzada en fragmentos ~ 0,5 mm y se colocaron en 80 cm
2 frascos de cultivo de tejidos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) de base recubierto con% de agar 0,75 (Difco, Detroit, MI). Los esferoides se mantuvieron en una incubadora de cultivo de tejidos estándar con 5% de CO
2 y 100% de humedad relativa a 37 ° C. El medio se cambió una vez por semana. Se seleccionaron esferoides con diámetros entre 400 y 600 micras para
in vitro
experimentos y para la implantación intracerebral.
disociación de los tumores
Los tumores se disociaron usando el Kit Neuronal de disociación (Miltenyi , Bergisch-Gladbach, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante
análisis citométrico de flujo y clasificación de células
las células se analizaron y se clasifican en un clasificador de células MoFlo (Beckman Coulter, EE.UU.;. ex Cytomation, EE.UU.), equipado con un láser de iones de argón 621 coherente Empresa sintonizado a 488 nm (utilizado a 180 mW), y 635 de diodo nm (25 mW). Dos g /ml de yoduro de propidio - PI (Molecular Probes) se añadieron a las muestras antes de flujo de clasificación para facilitar la discriminación de células muertas. La GFP y PI fueron excitados a 488 nm y la fluorescencia se midió a través 530/40 y 613/20 BP BP filtros ópticos (todos los filtros de Omega Optical, Brattleboro, VT, EE.UU.), respectivamente. Dobletes fueron discriminados usando una dispersión de luz frontal (FSC) frente a la anchura de pulso. canal de FL3 (en modo logarítmico) con el FSC se utiliza para mostrar y la puerta de salida PI células positivas /muertas. las señales de dispersión de la luz lateral (SSC) FSC y se detectaron y se muestran en el modo lineal. células GFP + se definieron en SSC frente a FL1 (en modo logarítmico) gráfico de puntos después de la exclusión de las células muertas y los desechos como se describe anteriormente.
Para el análisis de las células de expresión de CD133 se tiñeron con aloficocianina (APC) conjugado monoclonal CD133 /1 (AC133) anticuerpos (Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Alemania), de acuerdo con el protocolo general del fabricante para la tinción de inmunofluorescencia (durante 10 minutos en la oscuridad a 4 ° C). CD133-APC se excitó a 635 nm, la fluorescencia se midió a través 670/30 filtro óptico BP, y vivas las células CD133 + se define en SSC con respecto a FL6 (en modo logarítmico) gráfico de puntos. suspensión de células no teñidas-se utilizó como control.
células GFP + tumores se clasifican en "purificar 1" modo en polipropileno tubos de fondo redondo Falcon (Becton Dickinson Labware Europa, Francia) que contienen medios de cultivo, que se colocaron sobre hielo. Las alícuotas de algunas muestras al final de la clasificación se retiraron y volvieron a analizar para el control de la pureza tipo que era superior al 98%.
Cultura de células clasificadas
Las células clasificadas eran o cultivadas en neurobasal medio (Invitrogen, Carlsbad, CA) con suplemento B27 (20 l /ml; Invitrogen), Glutamax (10 l /ml; Invitrogen), factor de crecimiento de fibroblastos 2 (20 ng /ml; Peprotech, Rocky Hill, NJ), de crecimiento epidérmico factor de (20 ng ml; Peprotech) o se transfirieron a DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 1% de glutamina y crecido en cubreobjetos en placas de 24 pocillos
la tinción de inmunofluorescencia de esferoides /células adherentes
Los esferoides /células adherentes se tiñeron con anticuerpos humanos específicos de ratón anti-nestina (Millipore, Billerica, MA), anticuerpos de cabra anti-SOX2 (R & amp; D), ratón anti-β-tubulinIII (Millipore ) anticuerpos y anticuerpos-GFAP de ratón anti-(Millipore). Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 ° C. anticuerpos Alexa-Fluor647-cabra anti-ratón und Alexa-Fluor647-burro anti-cabra (Dianova, Hamburgo, Alemania) fueron utilizados como anticuerpos secundarios durante la noche a 4 ° C (para esferoides) o durante 2 horas a temperatura ambiente (por las células adherentes). Esferoides se examinan bajo un microscopio de fluorescencia (Nikon, Tokio, Japón) y las células adherentes fueron analizadas por microscopía confocal láser de barrido (Zeiss, Jena, Alemania).
Lentiviral vectores retrovirales y
El lentiviral vector plásmido pRRL.sinCMVeGFPpre fue publicado por Naldini et al. [21]. La construcción del vector lentiviral pRRL.sinCMV-TK /eGFPpre se ha descrito previamente. El vector retroviral pMP71-eGFP-pre ha sido descrito previamente [22].
Preparación de lentiviral y sobrenadantes de vectores retrovirales
La línea celular 293T se utiliza para la producción de vector lentiviral transitoria. El vector lentiviral plásmido pRRL.sinCMV-TK /eGFPpre (5 mg) o pRRL.sinCMVeGFPpre (5 mg), el VIH plásmido de expresión gag-pol-REV pCMV-dR8.91 (12,5 g) [21] y 2 g de la envolvente plásmido de expresión de pHCMV-LCMV-GP [14] o pCMV-G [23] se cotransfectaron en células 293T y se concentraron como se describe anteriormente [18]. Para la producción de vectores retrovirales, 293T células fueron transfectadas con 7,5 g de pMP71-eGFP-pre, 12,5 g de pSV-Mo-MLVgagpol, y 2 g del plásmido expresión de la envuelta pHCMV-LCMV-GP [14] o pCMV-G [23]. Los vectores se recogieron y se concentraron como se describe anteriormente [24].
La titulación de los sobrenadantes de vectores virales
vectores se titularon en células TE671 como se describe anteriormente [18].
Implantación de esferoides de glioblastoma
implantación intracraneal de esferoides de glioblastoma se realizó como se describe anteriormente [25].
Vector infusión
tres semanas a un mes después de la implantación, los animales fueron anestesiados y se preparó para la inyección del vector. La piel fue retirada para revelar la ubicación de la craneotomía. 2 veces 10 l de reservas de vectores se dieron en el centro de los tumores utilizando una jeringa de vidrio (modelo 701, Hamilton, Bonaduz, Suiza) fijado en una bomba de infusión controlada por microprocesador (UMP 2-1, World Precision Instruments, Aston, Stevenage , REINO UNIDO). Las coordenadas de inyección se estimaron después de analizar las imágenes de resonancia magnética para cada lesión individual. infusión vector hecho por la administración mejorada por convección en el transcurso de 25 min (200 nl /min durante 10 min, seguido de 400 nl /min durante 10 min, y finalmente 800 nl /min durante 5 min). Después de la infusión, la aguja se deja en su lugar durante 5 min para evitar el reflujo del vector. La aguja se retrae lentamente y los pliegues de la piel se cerró con hilo quirúrgico poliamida. Después de la cirugía, las ratas se les permitió recuperarse en una incubadora a 35 ° C antes de devolverlos a las jaulas.
El tratamiento de los gliomas de rata
Las ratas que llevan xenoinjertos de glioblastoma fueron tratados por vía intraperitoneal diaria inyecciones de 50 mg /kg de ganciclovir (GCV, Roche, Basilea, Suiza).
Análisis de los cerebros de ratas
Los animales fueron sacrificados y perfundidos con solución salina estéril y después con paraformaldehído al 4%. Se extrajeron los cerebros, se suspendió en 30% de sacarosa durante tres días, y luego se congelaron rápidamente en isopentano enfriado con hielo seco. secciones coronales (12 mM) se prepararon en un criostato. Para el análisis de inmunofluorescencia, las secciones se tiñeron con anticuerpos humanos específicos de anti-nestina (Millipore) para las células humanas de glioblastoma, anti-NeuN-ratón (Millipore) anticuerpos para neuronas, rata específicos anticuerpos de ratón-anti-nestina (Millipore) para astrocitos y progenitor Células. Los anticuerpos primarios (dilución 1:200) se incubaron durante la noche a 4 ° C. Biotinilado de cabra anti-ratón de cabra-anti-conejo (Vector Laboratories, Burlinghame, CA) se utilizaron como anticuerpos secundarios (dilución 1:100) durante 2 h a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron con Extravidin-Cy3 (Sigma, St. Louis, MO) como fluorocromo (dilución 1:200) durante 1 h a temperatura ambiente. Las secciones se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia (Nikon) y se analizaron por microscopía confocal de barrido láser (Zeiss, Jena, Alemania).
Para el análisis de la eficacia de transducción, secciones consecutivas (cada 20.-30.) En todo el tumores se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia (Nikon) con una etapa automatizada usando 10 × magnificación. El volumen de la transducción se calculó utilizando el software de imágenes Nikon Lucia.
inmunotinción de secciones de parafina
secciones de tejidos fijados con formalina embebidos en parafina de cerebro de rata y materiales de pacientes se colocaron en un baño de xileno durante 2 x 3 minutos , etanol absoluto 2 x 3 minutos, 96% de etanol 2 x 2 minutos y, finalmente, en agua destilada durante 30 segundos para la eliminación de la parafina y la rehidratación. Recuperación del epítopo se realizó por calentamiento de las secciones a 99 ° C durante 20 minutos en 10 mM de tampón de citrato a pH 6,0. Las secciones se incubaron con un anticuerpo monoclonal humano específico de anticuerpo anti-nestina 1:200 en TBS /BSA al 1% durante la noche a 4 ° C. Un anticuerpo biotinilado de cabra anti-ratón (Vector Laboratories) fue utilizado como anticuerpo secundario (dilución 1:100) durante 1 h a temperatura ambiente seguido de incubación ABC-complejo de 30 min. Las secciones fueron desarrollados con la 3'3-diaminobencidina (Dako Cytomation), siguiendo las instrucciones del fabricante.
La resonancia magnética
El uso de un escáner de Bruker Pharmascan 7 Tesla MR (Bruker Biospin, Billerica, MA ), las secuencias de RARE ponderadas en T2 axiales fueron adquiridos (tiempo de repetición, 4.200 ms; tiempo de eco, 36 ms; grosor de corte, 1 mm; campo de visión, 3,2 cm; tamaño de la matriz, 256 × 256; 20 rebanadas). Durante la exploración, los animales se mantuvieron bajo anestesia con 1,5% de isofluorano (Schering-Plough, Kenilworth, NJ) mezclado con 50% de aire y 50% de O2.
El análisis estadístico
La supervivencia se analizó por una prueba de log-rank en base a la prueba de Kaplan-Meier utilizando el software SPSS. Las diferencias entre pares de grupos se determinaron mediante de Student
t-test
.
P
valores & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
lentiviral vectores pseudotyped transducen eficazmente esferoides de glioblastoma
in vitro
glioblastoma humano. esferoides derivados ya sea directamente del paciente (baja generación) o de serie
in vivo
pasajes en los cerebros de ratas desnudas (alta generación), se infectaron con lentiviral LCMV-GP (5 × 10
4 en 10 l) o vectores pseudotyped lentiviral VSV-G (tanto 5 × 10
4 partículas en 10 l) o con vectores basados en MLV retrovirales pseudotipados con LCMV-GP (1 × 10
5 partículas en 10 l). Los vectores se prepararon de la misma manera para
in vitro Opiniones y
in vivo
experimentos (ver materiales y métodos). Ambos vectores lentivirales transducidas esferoides de pacientes y esferoides de alta generación de manera muy eficiente (Figura 1). En contraste, los vectores retrovirales transducen sólo unas pocas células individuales en esferoides alta generación (Figura 1) y fallaron en transducir esferoides de pacientes (datos no mostrados). En conclusión, los dos vectores de lentivirus son mucho más eficientes en la transducción de esferoides de glioblastoma humano
in vitro
que los vectores retrovirales.
esferoides de glioblastoma humano derivado de una biopsia del paciente o después de pases seriados en ratas desnudas (alto generación) fueron infectados por vectores lentivirales pseudotipados con LCMV-GP (5 × 10
4) o VSV-G (5 × 10
4) o por vectores retrovirales pseudotipados con LCMV-GP (1 × 10
5). Todos los vectores expresaban el gen marcador eGFP. Los esferoides se analizaron por microscopía confocal para la expresión eGFP 7 días después de la infección. Las imágenes muestran eGFP (verde), contraste de fase y una superposición de ambos. .: esferoides de baja generación derivados directamente de material del paciente (baja generación). Los altos Gen .: esferoides derivados de serie
in vivo
pasajes en el cerebro de rata (alta generación). Aumento original 100x.
lentiviral vectores pseudotyped eficiente y específicamente la transducción de células de glioblastoma
in vivo
Para comparar la eficacia de transducción de vectores lentiviral y gammaretroviral
in vivo, se utilizó un modelo de xenoinjerto que refleja las características angiogénicas e invasivos de glioblastoma humano
In situ
. El xenotrasplante también expresa el marcador neuronal nestina progenitora y estrechamente recapitula la histología del tumor del paciente (Figura 2). Los vectores se inyectaron en el centro de las lesiones que crecen progresivamente utilizando infusión estereotáctica controlada por microprocesador. Las coordenadas de inyección se estimaron después de analizar las imágenes de resonancia magnética para cada lesión individual. El volumen de inyección aplicada fue de 2 x 10 l y el título del vector 1 × 10
7 /ml para todos los vectores. La eficacia de transducción se evaluó 7 días después de la inyección del vector. Ambos vectores pseudotyped lentiviral mostraron transducción muy eficiente de los tumores (Figura 3A, D). Cuando se analizan con mayor ampliación, tanto LCMV-GP y vectores lentivirales pseudotipados VSV-G mostraron entrega transgén eficiente a las células nestina positiva tumorales en sólido (Figura 3B, E) y zonas tumorales invasoras (Figura 3C, F). En contraste, el vector retroviral sólo se transduce unas pocas células tumorales dispersas cerca del lugar de la inyección (Figura 3 G, H). Para una comparación cuantitativa de la eficacia de transducción entre los dos vectores pseudotyped lentiviral, las áreas positivas para GFP se midieron en cortes histológicos (ver material y métodos). El volumen total de tejido tumoral transducidas fue de 7,05 ± 3,51 mm
3 para los vectores pseudotyped LCMV-GP y de 4,05 ± 2,04 mm
3 para los vectores pseudotyped VSV-G (Figura 3I). Aunque hubo una diferencia en la media, no fue estadísticamente significativa (p = 0,269) debido a las altas diferencias interindividuales (desviaciones estándar)
secciones de parafina del tumor del paciente y el tumor de xenoinjerto se tiñeron con H & amp.; E (AD) o inmunotinción con anticuerpos anti-nestina específicos de humanos (E, F). tumor del paciente (A) y tumor de xenoinjerto (B) muestran características angiogénicas de glioblastoma humano con necrosis en empalizada (flecha) y prolifera vasculares (puntas de flecha). Mayor aumento de la paciente (C) y tumor de xenoinjerto (D) demuestran la morfología de las células tumorales similar con núcleos polimórficos en las proximidades de una de necrosis tumoral. Paciente (E) y tumor de xenoinjerto (F) muestran una fuerte expresión de nestina de las células tumorales. infiltración de células tumor individual en la sustancia blanca se observa en el tumor de xenoinjerto (F). La biopsia del paciente se deriva sólo de la núcleo tumor sólido. A, B, E, F: 100 × magnificación original. C, D: Aumento original 200 ×
gliomas intracraneales fueron infectadas con vectores de LCMV-GP o VSV-G pseudotyped lentiviral o con LCMV-GP pseudotyped vectores retrovirales que expresan eGFP 3-4 semanas después de la implantación esferoide. y se analizaron por fluorescencia (A, D, G) o microscopía láser confocal de barrido (B, C, e, F, H) 7 días después de la infección. Las imágenes confocales muestran superposición de eGFP (fluorescencia verde) y nestina específicos humanos (fluorescencia roja). Los tumores fueron transducidas eficientemente por lentiviral LCMV-GP (A-C) y VSV-G pseudotyped vectores (D-F), mientras que los vectores retrovirales sólo se transdujeron pocas células tumorales dispersas (G, H; flechas). células de glioma transducidas expresan nestina humano específico en sólido (B, E, H) y las zonas tumorales invasoras (C, F; flechas). (I) La eficacia de transducción de vectores lentivirales se comparó cuantitativamente midiendo el volumen de la transducción en las secciones histológicas utilizando un microscopio de fluorescencia y un software de imagen Nikon. tumores LCMV transducidas (n = 3) mostraron un volumen mayor que la transducción de tumores VSV transducidas (n = 3), sin embargo, la diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0,269). A, D: Aumento original × 40. C, E, G, H: Aumento original 100 ×. D, F:. Aumento original 200 ×
Para analizar la especificidad de la transducción, las secciones histológicas de áreas de adenocarcinoma invasor fueron teñidas con marcadores específicos de ratas NeuN (para las neuronas) y nestina (por astrocitos y células progenitoras). vectores lentivirales pseudotipados LCMV-GP transducidas exclusivamente las células tumorales en todas las áreas invasivas (Figura 4A), mientras que las células normales del cerebro no fueron transducidas (Figura 4B, C). También vectores pseudotyped VSV-G mostraron transducción específica de células tumorales en algunas áreas invasivas (Figura 4D, E), sin embargo, también transducidas unas pocas células cerebrales de acogida en otros sitios (Figura 4G, H).
intracraneal gliomas fueron infectados con LCMV-GP-o vectores lentivirales VSV-G-pseudotyped expresan eGFP 3-4 semanas después de la implantación del tumor y se analizaron microscopía confocal de barrido láser de 7 días después de la infección. La transducción de las células tumorales invasoras se analizó después de tinción con anticuerpos específicos de nestina humanos. anfitrionas neuronas y astrocitos fueron etiquetados utilizando anticuerpos contra NeuN y GFAP. áreas invasivas mostraron invasión de células individuales por las células tumorales (A-C, E, F) o una acumulación subependimario de las células tumorales (D, G, H). LCMV vectores pseudotyped específicamente las células del glioma transducidas invasivos (A-C). vectores pseudotyped VSV-G mostraron transducción específica de células tumorales en algunas áreas invasivas (D-F), pero también la transducción de las células cerebrales normales individuales en otros (G, H; flechas). Las células normales del cerebro transducidas se detectaron principalmente por criterios morfológicos (más procesos), como la tinción (GFAP o NeuN) no siempre coincide con las células transducidas. A, D: tinción de nestina, magnificación × 200. B, E, G: tinción GFAP, magnificación × 200. C, F, H:. Tinción NeuN, magnificación de 200 ×
lentiviral vectores pseudotyped la transducción de células de glioma cáncer de tallo como
Para analizar el potencial de los dos vectores de lentivirus para infectar el cáncer células madre como, los tumores transducidos se disocian enzimáticamente y la expresión CD133 se midió por citometría de flujo. Ambos vectores transducidas células CD133-negativo CD133-positivo y (Figura 5A). Aunque había grandes diferencias interindividuales en la fracción de células tumorales CD133 positivas totales en los diferentes xenoinjertos, ambos vectores mostraron una eficiencia similar en la transducción de las células CD133 positivas, que era ligeramente más alta que la fracción global de las células CD133 positivas (tabla 1) .
gliomas intracraneales se infectaron con VSV-G pseudotyped lentiviral vectores LCMV-GP o expresan eGFP 3-4 semanas después de la implantación del tumor. Los tumores fueron extirpados cuando las lesiones aparecieron en grandes resonancia magnética y se disociaron enzimáticamente. La transducción de las células CD133 positivas se midió por citometría de flujo. (A) LCMV-GP y VSV-G pseudotyped vectores transducen las células tumorales CD133 positivas y negativas. La fracción de células transducidas (GFP-positivas) es ligeramente mayor en las células CD133 positivas (columna derecha) en comparación con las células CD133 negativos (columna central). GFP + células fueron ordenados, se cultivaron en presencia o ausencia de suero y se analizaron por fluorescencia (B-G) o microscopía confocal (H-O). LCMV-GP (B) y las células transducidas VSV-G (E) forman esferoides sobre cultivo en medio basal neural exento de suero suplementado con EGF y bFGF. esferoides transducidas expresan la marcadores de células madre neurales nestina (C, F) y SOX2 (D, G). Las células transducidas cultivadas en medio que contiene suero expresan la marcadores de células madre nestina (H, L) y SOX2 (I, M), sino también la diferenciación Marcadores de GFAP (J, N) y beta-tubulinIII (K, O). Las fotos C, D, E, F, HO Mostrar superposición del transgén entregado virus (EGFP, verde) y detectaron antígeno (Alexa-647, de color rojo).
La GFP células positivas de tumores transducidas con LCMV-GP o lentiviral vectores pseudotyped VSV-G se clasifican y se cultivaron en medio basal neural complementado con EGF y bFGF. las células tumorales transducidas de ambos vectores fueron capaces de formar esferoides (Figura 5B, E). Esferoides expresa los marcadores de células madre nestina y SOX2 (Figura 5C, D, F, G). Las células clasificadas también se colocaron en placas en condiciones de suero. Las células continuaron mostrando expresión significativa de la nestina marcadores de células madre y SOX2, sino también de la GFAP marcadores de diferenciación y β-tubulinIII (Figura 5H-O).
vectores lentivirales pseudotipados que expresan el gen suicida HSV-1 -
tk
median un efecto terapéutico eficaz
in vivo
Para evaluar la eficacia terapéutica de estos dos vectores lentiviral pseudotyoped en el modelo de xenoinjerto invasiva, vectores que expresan el gen suicida HSV1-
tk
fundido a eGFP se inyectaron en tumores establecidos cuando sean visibles en la RM utilizando el mismo método que se ha descrito para el
in vivo
estudio tropismo. Los animales fueron tratados diariamente con 50 mg de ganciclovir /kg durante 30 días a partir de 7 días después de la inyección del vector. El crecimiento del tumor se midió cada 7-14 días por resonancia magnética. Después de 4 semanas de tratamiento, 7 de cada 8 animales, tanto en el LCMV- y el VSV-pseudotipo grupos tratados tuvieron una remisión completa en la RM (Figura 6). Un animal en cada grupo tenía una enfermedad estable hasta el final del tratamiento GC. Todos los animales en los grupos de control desarrollaron grandes tumores durante el período de tratamiento de 30 días (Figura 6). Ambos, LCMV- y VSV-pseudotype animales tratados tenían una ventaja de supervivencia muy significativa (p & lt; 0,001) en comparación con los grupos de control (Figura 7A). No hubo diferencia estadísticamente significativa en la supervivencia entre los dos grupos de tratamiento.
Representante tridimensional de resonancia magnética (T2 RARE). vectores (A, F, K, P) Lentiviral LCMV-GP con tratamiento con ganciclovir. vectores (B, G, L, Q) Lentiviral VSV-G con el tratamiento con ganciclovir. vectores (C, H, M, R) Lentiviral LCMV-GP sin tratamiento con ganciclovir. vectores (D, I, N, S) Lentiviral VSV-G sin tratamiento con ganciclovir. (E, J, O, T) del tratamiento con ganciclovir solamente. tiempos después de la implantación del tumor: (A-E) 1 día antes de la inyección del vector. (F-J) 1. semanas de tratamiento con ganciclovir. (K-O) 2. semanas del tratamiento con ganciclovir. (PT) 4. semana del tratamiento con ganciclovir.
gliomas intracraneales fueron inyectados con LCMV-GP o VSV-G pseudotyped lentiviral vectores que expresan HSV-1-
tk
fundido a EGFP 3 semanas después de la implantación del tumor. 7 días después de la infección del vector, los animales de ambos grupos tratados y en un grupo de control fueron tratados con ganciclovir durante 30 días. curva de supervivencia (A) de Kaplan-Meier. El beneficio de supervivencia para los dos grupos de tratamiento en comparación con los grupos de control fue estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,001; prueba de log-rank). No hubo diferencia significativa en la supervivencia entre los dos grupos de tratamiento. (B-D) Representante de resonancia magnética (T2 RARO) de los tumores recurrentes en la LCMV- (B, C) y el grupo tratado con VSV (D, E). (B) la recidiva contralateral invasivo. (C) Invasiva recidiva local y contralateral. (D) la recidiva local más circunscrito. (E) la imagen macroscópica del cerebro de una rata con una recurrencia en el cerebelo (círculo rojo), se trata con vectores pseudotyped VSV-G y GC. (F-M) Secciones de tumores recurrentes se tiñeron con anticuerpos contra nestin-humano específico y se analizaron por fluorescencia (F, J) o microscopía confocal (G-I, K-M).