Extracto
Antecedentes
Para establecer, caracterizar y dilucidar los posibles mecanismos de resistencia a la bleomicina adquirida (BLM) utilizando líneas celulares de cáncer humano. Siete líneas celulares BLM resistentes fueron establecidos por la exposición a la escalada de concentraciones BLM durante un período de 16-24 meses. IC
50 valores y tiempos de duplicación celular se cuantificó usando un ensayo de citotoxicidad en tiempo real. Cometa y γ-H2AX ensayos, análisis del ciclo celular, y la evaluación de la apoptosis investigarse más a fondo los mecanismos de resistencia BLM en estas líneas celulares.
Resultados
En comparación con líneas celulares de sus padres, los ensayos de citotoxicidad en tiempo real revelaron 7 a 49 veces los aumentos de IC
50 y una media de duplicación incremento de tiempo de 147% (rango 64% -352 %) en sub-clones de BLM resistentes (P & lt; 0,05 para ambos). BLM concentraciones más altas de mantenimiento se asociaron con mayor CI
50 y aumentaron duplicando el tiempo (p & lt; 0,05). Se ha reducido significativamente el daño del ADN (cometa y γ-H2AX ensayos), G2 /M detención y la apoptosis (p & lt; 0,05 para cada conjunto de comparación) siguiente altas dosis de exposición BLM aguda se observó en sub-clones resistentes, en comparación con su BLM- homólogos parentales sensibles. Tres semanas de cultivo BLM-libre resultó en un retorno parcial a la sensibilidad BLM en 3/7 sub-clones de BLM resistentes (p & lt; 0,05).
Conclusión
resistencia a la bleomicina puede estar asociada con una reducción de daño en el ADN después de la exposición bleomicina, resultando en la reducción G2 /M detención, y la reducción de la apoptosis
Visto:. Wang Q, Cui K, Espín-Garcia O, Cheng D, Qiu X, Chen Z, et al. (2013) La resistencia a la bleomicina en líneas celulares de cáncer se caracteriza por prolongado Tiempo de duplicación, daño del ADN reducido y la evasión de G2 /M detención y la apoptosis. PLoS ONE 8 (12): e82363. doi: 10.1371 /journal.pone.0082363
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Julio, 2013; Aceptado: 23 de octubre de 2013; Publicado: 4 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación hospital Princess Margaret. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la bleomicina (BLM) es un antibiótico glicopéptido aislado de
Streptomyces verticillis
[1,2]. Como un agente quimioterapéutico, que se utiliza en el tratamiento de tumores múltiples, incluyendo pero no limitada a carcinomas testiculares, linfomas, y cánceres de cabeza y cuello [3,4]. Aunque la vía completa del mecanismo del fármaco de acción no se ha dilucidado, BLM no se une al hierro y oxígeno para producir especies reactivas de oxígeno (ROS) [5] que induce roturas en el ADN de una y de doble filamento, siendo este último el principal responsable por sus efectos anti-tumorales [6,7]. También causa la peroxidación lipídica y daño en el ADN mitocondrial [8]. Extendido la detención del ciclo celular /senescencia, la apoptosis y muerte celular mitótico son las respuestas celulares más comunes para el tratamiento BLM [9].
BLM se encontró para inducir la detención del ciclo celular G2 /M en las líneas celulares de cáncer [10,11]. Esto se puede explicar por una respuesta de punto de control G2 /M al daño del ADN. El G2 /M puesto de control es importante para la estabilidad genómica, ya que asegura que los cromosomas están intactos y listo para la separación antes de las células entran en mitosis [12]. A diferencia del punto de control G1, genes de punto de control G2 /M a menudo no están mutados en células del cáncer [13].
La resistencia a la BLM es un problema clínico, y por lo general ocurre durante la recaída en los tumores de células germinales, donde BLM es más comúnmente utilizado clínicamente. Aunque el mecanismo de BLM-resistencia es poco clara, varias posibilidades se han propuesto, incluyendo: (a) la ingesta de BLM alterado y flujo de salida [14,15]; (B) elevado nivel de antioxidantes [5,11]; (C) la capacidad de reparación mejorada de lesiones del ADN inducidas por BLM [14,16,17]; y (d) el aumento del metabolismo (inactivación) de BLM [17-19]
.
El desarrollo de la resistencia BLM sirve como un importante mecanismo para la evasión de la erradicación de la quimioterapia en las células cancerosas. Sin embargo, los mecanismos responsables de la resistencia adquirida BLM en células tumorales humanas no han sido bien investigada. En este estudio, hemos establecido BLM-resistencia en siete líneas celulares de cáncer humano, incluyendo las líneas de tipos de tumores tratados actualmente con BLM y otros conocidos por ser sensibles o resistentes a la BLM. Por otra parte, que caracteriza estas líneas celulares con respecto a su nivel de BLM-resistencia, el daño del ADN inducido por BLM, tiempo de duplicación, la distribución del ciclo celular, y el grado de apoptosis (antes y después del tratamiento BLM) para aumentar nuestra comprensión de los mecanismos potenciales de resistencia.
Materiales y Métodos
células y cultivo celular
Siete líneas disponibles en el comercio de células cancerosas humanas con amplias diferencias en la sensibilidad innata /resistencia a la BLM (HOP62, ACHN, NT2 /D1, SF-295, NCCIT, NCI-H322M, y MBA-MB-231) fueron elegidos de Instituto Nacional del cáncer (NCI) o American Type Culture Collection (ATCC) [20]. Dos (NT2 /D1, NCCIT) eran líneas de células testiculares (Tabla 1). La línea celular
Abreviatura (padres /resistente): perfil del Derivado de qué tipo de cáncer
parental IC
50 (g /ml) *
ACHNACHN
celular 0Renal carcinoma0.009ACHN
0.25HOP-62HOP
0Lung adenocarcinoma0.11HOP
0.05SF-295SF
0CNS glioblastoma 0.14SF
0.4NT2 /D1NT2
celular 0Germ carcinomaN /ANT 2
0.1NCCITNCCIT
0Germ carcinomaN celular /ANCCIT
1.5NCI-H322MH322M
0Lung adenocarcinoma25.8H322M
2.5MDA-MB-231MB231
0Breast adenocarcinoma27.9MB231
3.0Table 1. Descripción de Líneas celulares.
Nota: Las líneas celulares con subíndice "0" indican las líneas parentales (control) (por ejemplo, HOP
0). Los resistentes sub-clones tienen un subíndice identificar su concentración BLM mantenimiento, en g /ml (por ejemplo, HOP
0,05). * Los datos obtenidos de NCI-60 panel de detección de drogas [20]. Descargar CSV CSV
NT2 /D1 se mantuvo en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM). Otras líneas se cultivaron en RPMI 1640. Las condiciones fueron 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C en 5% de CO
2. Las células fueron cultivadas como monocapas en matraces de cultivo de 75 cm
2 de células a menos que se indique lo contrario. Todas las líneas celulares dieron negativo para la contaminación por micoplasmas por Polymer Chain Reaction (PCR) [21]. Las líneas celulares se autentican utilizando corto repeticiones en tándem (STR) ensayo [22]. líneas celulares
Establecimiento de bleomicina resistente sub-clones de los padres (de control): perfil
Para desarrollar BLM-resistencia, las células fueron expuestas continuamente a los aumentos graduales en la concentración de BLM en un período de 16 a los 24 meses. Brevemente, las células se sembraron a una densidad de ~ 5 × 10
5 /ml en un matraz de cultivo de células T75 con 10 ml medio completo de crecimiento. Después de 4-6 horas de incubación, concentraciones relativamente bajas de BLM (que van desde 0,01 a 0.1μg /ml dependiendo de la innata BLM-sensibilidad), disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca
2 + y Mg
2 +, se añadieron en el medio. Las células se dejaron en BLM durante 2 a 4 semanas o hasta que una célula estable re-población formado. la reposición periódica medio se llevó a cabo a lo largo de este período. A continuación, la concentración BLM se incrementó en 0,5 a 2 veces. Este aumento de la dosis escalonada continuó durante 16 a 24 meses hasta que la concentración alcanzó BLM al menos diez veces la concentración de partida. A partir de entonces, todas las líneas celulares BLM-resistentes ( "sub-clones BLM resistentes") se mantuvieron en su concentración más alta BLM alcanzado ( "dosis de mantenimiento"). Al mismo tiempo, el paso regular de las líneas celulares parentales se llevaron a cabo en paralelo con el proceso de establecimiento de BLM-resistencia.
prueba de sensibilidad BLM y la duplicación de análisis en tiempo
Antes de la evaluación BLM resistencia /sensibilidad (ensayo de citotoxicidad), un ensayo de proliferación celular se llevó a cabo en el sistema xCELLigence (Roche, EE.UU.) para identificar las condiciones óptimas en las que el ensayo de citotoxicidad en tiempo real debe estar funcionando. Específicamente, se realizó el ensayo de proliferación: a) para identificar la densidad de siembra óptima para el ensayo de citotoxicidad para cada una de las líneas celulares; y b) para determinar la duración del ensayo de citotoxicidad.
El ensayo de proliferación se llevó a cabo mediante la siembra de varios números de células en una placa de 96 pocillos (placa de E-96, Roche, EE.UU.) en cuatro ejemplares, seguida de la monitorización en tiempo real de crecimiento celular durante un máximo de 7 días . Veinticuatro horas después de la siembra, la mitad de los pocillos de la placa se trataron con BLM para determinar la respuesta celular. El ensayo de proliferación se repitió dos veces en cada línea celular. densidades de siembra óptimas para cada línea fueron seleccionados sobre la base de los cambios dramáticos en la proliferación en 72-96 horas después del tratamiento BLM y pequeñas variaciones entre pocillos replicados.
Para los ensayos de citotoxicidad, se llevó a cabo primero el recuento de células, y las células se siembran a continuación en pocillos por triplicado con 180μl de medio de cultivo de células BLM libre en una placa de 96 pocillos. Veinticuatro horas después de la siembra inicial, se añadieron 20μl de medio de cultivo celular que contiene BLM diluido en serie que van desde 0 a 800 g /ml en cada pocillo. El número de células vivas viables se controló cada 15 minutos, para un total de al menos 120 horas. IC
50 (software integrado, sistema de xCELLigence) y doblar las diferencias en CI
50 entre (control) líneas de células BLM-resistentes y parentales (IC
50 BLM-resistente /IC
50 de control) fueron posteriormente calculado. Se aisló el periodo de crecimiento más rápido observado para cada una de las líneas celulares en el ensayo de proliferación para duplicar la determinación del tiempo y su cambio porcentual se calculó utilizando el software del sistema xCELLigence.
evaluación del ensayo cometa BLM inducida por daño en el ADN
BLM es conocido por causar daños en el ADN en las células [6,7]. Para determinar las pausas iniciales (línea de base) y la cadena de ADN después de BLM dosis alta exponen, se realizaron ensayos cometa alcalino (electroforesis de gel de una sola célula) [23] para cada uno de los sub-clones parentales y resistentes. Los valores de oliva momento de la cola (OTM) de un centenar de células se obtuvieron de forma aleatoria por diapositiva utilizando microscopio de fluorescencia con el software KOMET 5.0 (Kinetic imaginar).
BLM inducida por la formación de focos γ-H2AX
ADN doble filamento se rompe (DSBs) provoca la formación celular de γ-H2AX focos (proteína H2AX fosforilada) [24]. Para confirmar la respuesta al daño del ADN celular para BLM a través de la prueba del cometa, se realizó un análisis cuantitativo de la formación de focos γ-H2AX después de altas dosis de exposición BLM en un subconjunto de cuatro pares de los padres /resistente (HOP, ACHN, NCCIT, y H322M) [25 ] usando fosfato histona H2AX pSer139 anticuerpo monoclonal y Alexa Harina 488-conjugado anti-fosfo-H2AX (BioLegend, San Diego, CA, EE.UU.). Un mínimo de 10000 eventos fueron contados en citómetro de flujo para cada medición; la intensidad de γ-H2AX, que se correlaciona directamente con los recuentos de citometría, se analizó utilizando el software Cell Quest (BD, EE.UU.).
distribuciones del ciclo celular análisis de distribución
ciclo celular de cada uno de par de siete sub-clones resistentes a los padres y se pusieron a prueba pre y post 24 horas de alta dosis de exposición BLM a diez veces la concentración de mantenimiento de los resistentes sub-clones. Entonces, las células en la suspensión mono-dispersado se fijaron con etanol, seguido de yoduro de propidio (PI) tinción (PI, Sigma, EE.UU.) y se analizaron usando el citómetro de flujo FACScalibur (BD, EE.UU.). Los porcentajes de células en reposo en G1, S y G2 /M fase se determinaron (CellQuest software, BD, EE.UU. y el software ModFit LT, Verity Software House). la distribución del ciclo celular se midió en cada par de los padres /BLM resistentes al inicio del estudio y en diferentes puntos de tiempo hasta 24 horas de tratamiento BLM. Se analizaron las correlaciones entre la distribución del ciclo celular, IC
50 valores, y la línea celular tiempos de duplicación.
Anexina V ensayo /PI para la apoptosis inducida por BLM
Para determinar celular pre y post-tratamiento de la apoptosis BLM, un subconjunto representativo de cuatro pares de los padres /resistente (HOP, ACHN, NCCIT, y H322M) se trató con 24 horas de BLM dosis altas. Las células fueron teñidas con anexina V-FITC y PI, y se evaluaron para la apoptosis por citometría de flujo de acuerdo con el protocolo del fabricante (BD PharMingen, San Diego, CA, EE.UU.). Tanto temprano (Anexina V-positivo, negativo PI) células apoptóticas y finales (Anexina V-positivo, PI-positivo) se contaron las células apoptóticas como.
Análisis estadístico
Para evaluar la significación de tratamiento o diferencia, pareadas T-pruebas o prueba t no pareada (dependiendo de las especificaciones experimentales) se realizaron con un nivel de significación bilateral de 0,05. supuestos de normalidad se evaluaron mediante pruebas de Shapiro-Wilks. Cuando la hipótesis de normalidad no se pudo realizar, emparejado o se realizaron pruebas de suma de rangos de Wilcoxon no apareados en su lugar. Para la evaluación del ensayo cometa entre los sub-clones resistentes a los padres y después de tratamiento con altas dosis de BLM, los valores de p se calcularon utilizando un estadístico t de varianzas no iguales, poniendo a prueba la hipótesis nula de igualdad de los coeficientes de registro. La regresión logística se realizó para evaluar las diferencias iniciales G2 /M de distribución entre los sub-clones parentales y resistentes. Para investigar la correlación entre las distintas medidas (IC
50 de control, IC
50 cambio tras tratamiento con altas dosis de BLM, el tiempo de duplicación y distribución del ciclo celular), se realizaron análisis de regresión lineal. Todos los análisis se realizaron utilizando SAS versión 9.2 o el programa SPSS versión 13.0.
Resultados
líneas de células BLM-resistentes mantenidos en BLM muestran de forma estable superiores IC
50 valores y tiempos prolongados duplicar
Los siete BLM-resistentes sub-clones demostraron una mayor IC
50 que sus homólogos parentales (Figura 1). Los ensayos de citotoxicidad mostraron entre 7-49 veces los aumentos de IC
50 en sub-clones resistentes BLM. Se observó una correlación positiva entre la concentración BLM mantenimiento e IC
50 valores (P & lt; 0,001, R
2 = 0,58). Después de la exposición prolongada BLM, líneas celulares con mayor sensibilidad parental a BLM (media IC
50, 0.1μg /ml) mostró un mayor aumento de la resistencia (media de 48 veces) en comparación con líneas parentales que eran menos sensibles (media IC
50, 9μg /ml, 15 veces; p & lt; 0,05 comparando sensible parental a las líneas menos sensibles).
Modelos de regresión lineal determinó que los valores más altos de CI
50 se asociaron con menores valores de cambio veces (logaritmo pendiente escala de: -0.11 (error estándar: 0,02), P & lt; 0,0001, R
2 = 0,58). Cada IC
50 valor es la media de experimentos realizados por triplicado.
Se observó que BLM-resistentes sub-clones crecieron más lento que sus líneas celulares de sus padres. Dos líneas de células, cuando se mantiene en concentraciones más altas de BLM, como MB231
3,0 y H322M
2,5 (subíndices denotan la concentración BLM mantenimiento), también mostraron ampliada y aplanado morfología celular se asemeja a la de la senescencia celular en comparación con sus líneas parentales , pero sólo después de muchas generaciones. En contraste, la exposición aguda a altas dosis de BLM no dio lugar a cambios morfológicos. El crecimiento celular más lento fue confirmada por el tiempo de duplicación celular calculada con el sistema xCELLigence. Todos los sub-clones BLM resistentes muestran estadísticamente significativa prolongación del tiempo de duplicación, con una media de duplicación incremento de tiempo de 147% (rango: 64% -352%) en comparación con sus líneas de células parentales (figura 2, P & lt; 0,05). No hubo correlación entre el tiempo de duplicación celular e IC
50 valores, y ninguno entre el porcentaje de aumento en el tiempo de duplicación y doble aumento de la IC
50.
La media de tiempo de duplicación ± error estándar de la media (SEM, n = 3) se informó. El tiempo de duplicación promedio (medido en horas) de las líneas parentales fue más corto que el de BLM resistentes a sub-clones en las siete líneas de células. * P & lt; 0,05 en comparación con los padres.
Para probar la estabilidad de la resistencia en BLM BLM resistentes sub-clones, las comparaciones de la CI
50 valores y tiempos de duplicación fueron hechas entre los sub-clones resistentes BLM normalmente mantenidos y la misma resistentes sub-clones que eran posteriormente cultivadas en medio libre de BLM durante tres semanas. Después de tres semanas de BLM-libre cultivo, tres de los sub-clones originalmente resistentes (incluyendo tanto las líneas de células testiculares NT2
0,1, NCCIT
1.5 y la HOP línea celular de cáncer de pulmón
0,05) mostraron una IC significativa
50 reducción (Figura 3) y la duplicación de la reducción del tiempo (Figura 4), en comparación con un mantenimiento regular BLM resistentes a sub-clones. No hubo cambios estadísticamente significativos en la IC
50 y el tiempo de duplicación de las cuatro líneas restantes. Se realizaron
Los experimentos por triplicado. Entrar IC se realizaron
50 comparaciones. Tres (HOP
0,05, NT2
0,1, y NCCIT
1,5) de las siete líneas celulares tenían reducciones significativas en la CI
50 valores después de tres semanas de mantenimiento BLM-libre. * P & lt; 0,05 para las comparaciones entre BLM resistentes sub-clones y sus correspondientes homólogos con tres semanas de descanso del tratamiento.
El experimento se realizó por triplicado. Tres (HOP
0,05, NT2
0,1, NCCIT
1,5) de las siete líneas de células BLM-resistentes exhibió disminución significativa en el tiempo de duplicación después de tres semanas de tratamiento BLM-libre. * P & lt;. 0,05 en comparación con BLM después de la eliminación de las líneas celulares de 3 semanas
BLM resistencia puede ser dependiente de la dosis
Dado que existe una correlación general entre IC
50 valores y las concentraciones de BLM de mantenimiento a través de 7 líneas de células (Figura 1), se ensayó la posibilidad de resistencia BLM dependiente de la dosis. Para la línea de células individuales ACHN, IC
50 valores se obtuvieron a partir ACHN
0 (línea parental), y sus dos sub-clones resistentes, ACHN
0,1 y ACHN
0,25. Se encontró una correlación positiva entre las concentraciones de BLM de mantenimiento (0, 0,1 y 0.25μg /ml) y sus IC
50 valores (0,01, 0,29, y 0.74μg /ml, respectivamente, p & lt; 0,05). Por otra parte, también se observó una correlación positiva entre las concentraciones de mantenimiento y tiempos de duplicación de BLM (0μg /ml-12hrs, 0.1μg /ml-16.5hrs, 0.25μg /ml-23.5hrs, P & lt; 0,05). Este hallazgo no fue probado o confirmado en cualquiera de las otras líneas celulares.
BLM resistentes a sub-clones tenían menos inducida por BLM daño en el ADN en ensayos de Comet
Cuantificación de daño del ADN en los siete pares de los padres /resistentes utilizando el ensayo cometa (medido en OTM) mostraron que antes del tratamiento BLM, seis de las siete líneas celulares resistentes tuvieron mayor daño en el ADN basal en comparación con el control (la excepción fue HOP
0,05, p & lt; 0,05). Esto generalmente correlacionada con el tiempo de duplicación celular basal prolongado observado en estas sub-clones resistentes. Después de dosis alta BLM tratamiento, cinco de los siete sub-clones resistentes (SF
0,4, HOP
0,1, NT2
0,1, NCCIT
1,5, y H322M
2,5) tuvieron un menor daño en el ADN de sus líneas parentales. No se observó ningún incremento en el daño del ADN después de la exposición BLM en cinco de las siete líneas resistentes (SF
0,4, NT2
0,1, NCCIT
1,5, H322M
2,5, y MB231
3.0). Por el contrario, todas las líneas celulares parentales tenían mayor daño en el ADN BLM posterior de BLM pre- (p & lt; 0,05 para cada comparación; Figura 5). Además, todas las siete líneas parentales muestran aumento significativamente mayor daño al ADN después del tratamiento BLM en comparación con sus contrapartes resistentes (p & lt; 0,05).
Los experimentos se realizaron por triplicado. Las células fueron sujetas a alta dosis de exposición BLM (correspondiente a diez veces sus concentraciones respectivas de mantenimiento) durante 24 horas. OTM fue utilizado para la fragmentación del ADN (daño) de cuantificación, y se calculó como: OTM = (Tail.mean - Head.mean) × (% del ADN de la cola) /100. ensayo Comet reveló mayor aumento de la fragmentación del ADN (expresado en los niveles de OTM) después del tratamiento BLM en todas las líneas parentales * P & lt;. 0,05 para la comparación entre las líneas celulares antes y después de la dosis de tratamiento BLM. Todas las líneas parentales mostraron aumento significativo en el daño del ADN.#P & lt; 0,05 para la comparación entre las líneas celulares parentales y resistentes al inicio del estudio (pre-tratamiento). Todas las líneas BLM-resistentes a excepción de HOP
0,05 exhibió un aumento del daño del ADN al inicio del estudio en comparación con sus líneas parentales. &erio; P & lt; 0,05 para la comparación entre las líneas celulares resistentes línea celular y el tratamiento posterior de los padres BLM. Menos daño en el ADN (en comparación con sus líneas parentales) post-tratamiento BLM se encontró en cinco de las siete líneas de células BLM-resistentes (SF
0,4, HOP
0,1, NT2
0,1, NCCIT
1,5, y H322M
2,5).
BLM-resistentes sub-clones habían reducido los niveles de γ-H2AX en comparación con sus líneas parentales después de altas dosis de tratamiento BLM
Como segunda medida de la respuesta celular al daño del ADN, γ- H2AX también se evaluó en un subgrupo de cuatro líneas celulares (HOP, ACHN, NCCIT y H322M). Después de 24 horas de alta dosis de tratamiento BLM, las intensidades de γ-H2AX aumentaron en todas las líneas celulares de sus padres. En las sub-clones resistentes, aumentaron γ-H2AX intensidades se observaron solamente en dos de cuatro líneas (ACHN
0,25 y HOP
0,05, Figura 6). Esto está de acuerdo con los ensayos de cometa. Tres (HOP
0,05, NCCIT
1,5, y H322M
2,5) de los cuatro sub-clones resistentes mostraron significativamente menos cambio en la intensidad γ-H2AX (γ-H2AX intensidad de post-tratamiento, menos de pre-tratamiento) en comparación con sus parentales sub-clones post-tratamiento BLM (p & lt; 0,05). Esta tendencia estaba en el límite significativo en la cuarta línea (H322M
2,5, p = 0,054).
Los experimentos se realizaron por triplicado. Las células fueron sujetas a alta dosis de exposición BLM (correspondiente a diez veces sus concentraciones respectivas de mantenimiento) durante 24 horas. a continuación, se obtuvieron detección de citometría de flujo de la formación de focos γ-H2AX BLM inducida en un subgrupo de cuatro líneas celulares (ACHN, HOP, NCCIT y H322M). * P & lt; 0,05 para la comparación entre las líneas celulares anteriores y después de la dosis de tratamiento BLM. Todas las líneas parentales mostraron aumento significativo en la formación de γ-H2AX.#P & lt; 0,05 para la comparación entre las líneas celulares parentales y resistentes al inicio del estudio (pre-tratamiento). Una de las cuatro líneas de células BLM-resistentes (NCCIT
1,5) tenía una mayor formación de γ-H2AX que su homólogo de los padres al inicio del estudio. &erio; P & lt; 0,05 para la comparación entre las líneas de células resistentes y parentales después del tratamiento BLM. Dos de cuatro líneas de células BLM-resistentes (HOP
0,1 y NCCIT1.
5.) Reveló una menor formación significativamente γ-H2AX que sus homólogos de los padres después del tratamiento BLM, con una tercera línea (H322M
2.5) siendo limítrofe significativa (p = 0,054).
líneas de células BLM-resistentes tuvieron un menor porcentaje de G2 /M detención después de altas dosis de exposición BLM
Desde la detención del ciclo celular en G2 /M fase fue una respuesta celular característica general a la exposición BLM, se evaluó la capacidad de BLM resistentes a sub-clones para suprimir G2 inducida por BLM detención /M. Como se muestra en la figura 7, tres de los siete sub-clones BLM-resistentes (HOP
0,05, NCCIT
1,5, y H322M
2,5) mostraron mayor distribución G2 /M fase al inicio del estudio, en comparación con sus líneas parentales (p & lt; 0,05). Del mismo modo, para las otras cuatro líneas celulares, los resistentes sub-clones también mostraron una mayor distribución de fase G2 /M al inicio del estudio, aunque no significativamente. Después de 24 horas de alta dosis de exposición BLM, cinco (SF
0,4, NT2
0,1, NCCIT
1,5, H322M
2,5, y MB231
3,0) de siete sub-clones BLM resistentes exhibió una distribución inferior G2 /M que sus líneas parentales correspondientes (p & lt; 0,05). Comparando el% G2 distribución /M antes y después de 24 horas de alta dosis de tratamiento BLM, todas las líneas celulares parentales exhibido aumentos en G2 distribución /M después del tratamiento (p & lt; 0,05) .La misma tendencia se observó en todos los sub-clones resistentes, aunque dos (NT2
0,1 y MB231
3.0) no resultaron significativos. El grado de% G2 /aumento de distribución de M (calculado como% G2 /M
postratamiento menos% G2 /M
pre-tratamiento) fue menor para todas las sub-clones resistentes que sus líneas parentales correspondientes (p & lt; 0,05).
Las dosis altas de BLM tratamiento corresponde a diez veces la concentración de mantenimiento correspondiente para cada línea celular. La media ± SEM (n = 3) se reportan valores. * P & lt; 0,05 para la comparación entre las líneas celulares antes y después de la dosis de tratamiento BLM. Todas las líneas parentales mostraron aumentos significativos en la distribución del ciclo celular G2 /M.#P & lt; 0,05 para la comparación entre las líneas celulares parentales y resistentes al inicio del estudio (pre-tratamiento). Tres de los siete líneas de células BLM-resistentes (HOP
0,05, NCCIT
1,5, y H322M
2,5) mostraron una mayor distribución% G2 /M al inicio del estudio en comparación con sus líneas celulares de sus padres. &erio; P & lt; 0,05 para la comparación de% G2 /M de distribución entre las líneas celulares parentales y resistentes después del tratamiento BLM. Menos% G2 distribución /M de líneas parentales se encontró en cinco de las siete líneas de células BLM-resistentes (SF
0,4, NT2
0,1, NCCIT
1,5, H322M
2,5, y MB231
3,0) después del tratamiento BLM.
G2 /M detención se hace más frecuente después de 8 horas de alta dosis de tratamiento BLM
Para evaluar el tiempo de G2 /M detención después de la dosis de exposición BLM, cuatro líneas celulares (la forma innata BLM HOP sensible y líneas ACHN, la línea testicular NCCIT y la H322M innata BLM resistentes, las mismas líneas evaluadas para el experimento γ-H2AX) fueron sometidos a un análisis de evolución en el tiempo. Aunque no hubo aumento de detención en G2 /M en ambas sub-clones parentales y BLM-resistentes (Figura 8), esta detención fue visto más prominente entre 8 y 12 horas después del tratamiento BLM en las células parentales.
Se corrieron
Experimentos por triplicado. Se encontró la distribución de G2 /M a ser mayor en las líneas parentales (en comparación con los sub-clones resistentes) 8 horas después del tratamiento BLM.
Reducción de la apoptosis se encontró en sub-clones resistentes BLM-
Siguiendo los mismos cuatro sub-clones emparejados, se examinó si las células se sometieron a la apoptosis después de la dosis de tratamiento BLM. Después de 24 horas de tratamiento BLM, el porcentaje de células apoptóticas aumentó en todas las cuatro líneas parentales prueba (Figura 9). En contraste, no hay sub-clones resistentes mostraron aumentos estadísticamente significativos en la apoptosis tras el tratamiento BLM. Esto está de acuerdo con el análisis del ensayo cometa (daño en el ADN). Por otra parte, tres de los cuatro sub-clones resistentes (HOP
0,05, NCCIT
1,5, y H322M
2,5) mostraron significativamente menos aumento de la apoptosis (% de apoptosis después de menos% apoptosis antes del tratamiento BLM) en comparación con sus padres líneas siguientes tratamiento BLM (p & lt; 0,05). Esto generalmente correlacionada con el daño reducida ADN y G2 detención del ciclo celular /M en sub-clones BLM-resistentes (en comparación con las líneas parentales, post-tratamiento) como ya se observó.
* P & lt; 0,05 para la comparación entre las líneas celulares antes y después de la dosis de tratamiento BLM. Todas las líneas parentales, pero no hay líneas resistentes mostraron un aumento significativo en la apoptosis después del tratamiento BLM. &erio; P & lt; 0,05 para la comparación entre la línea celular resistente a los padres después del tratamiento BLM. Menos apoptosis de las células se encontró en tres (HOP
0,05, NCCIT
1,5, y H322M
2,5) de cuatro líneas BLM-resistentes, en comparación con sus líneas parentales.
Discusión
En este estudio, hemos establecido con éxito siete líneas celulares de cáncer humano BLM resistentes a partir de líneas celulares de cáncer disponibles en el mercado de diversos orígenes de órganos (pulmón, testículo, mama, riñón, así como el sistema nervioso central). Después aguda repentina, la exposición a corto plazo a la BLM, estos BLM-resistentes sub-clones mostró menos daño en el ADN, tenía ya los tiempos de duplicación, tenían una menor proporción de células en G2 /M detención, y había reducido la apoptosis, en comparación con su más líneas celulares de sus padres BLM-sensibles. líneas de células BLM resistentes fueron desarrollados por aumentar progresivamente la concentración BLM incubar durante un período prolongado de 16-24 meses. Estudios previos pueden haber utilizado métodos similares en el cultivo de sub-clones resistentes BLM. Sin embargo, algunos de ellos alcanzó el alto nivel de BLM-resistencia observada en este estudio (que era 7-49 veces mayor en IC
50 entre los sub-clones resistentes y de los padres, en comparación con un aumento de 3-20 veces en la otra estudio [15]). Por otra parte, a través del análisis de los daños BLM inducida por ADN, la distribución del ciclo celular, y los porcentajes de apoptosis, varios mecanismos putativos de resistencia BLM /Se evaluó la sensibilidad.
BLM se sabe que causa G2 extendida /M detención y /o apoptosis celular [9] en las células sensibles BLM. Esto puede ser mediada por ATM /ATR [26,27], las proteínas aguas arriba de una reparación del ADN y la vía de señalización que desencadena la detención G2 /M o apoptosis de las células a través de una gama de productos de los genes corriente abajo, tales como Chk1 /2, cdc 25 [28 ], p53, y p21
WAF1 /CIP1, donde los dos últimos son críticos para el mantenimiento de G2 /M detención del ciclo [29]. Por otra parte, se encontró que la histona H2AX ser necesario para la activación del punto de control G2 /M [30].
Comet y los resultados gamma-H2AX reveló menos daño en el ADN inducido por BLM en las líneas resistentes, lo que sugiere que los resistentes sub-clones pueden tener una mayor capacidad para prevenir y /o reducir el daño del ADN causado por la BLM. Esto puede ser debido a la reducción de la captación celular de BLM, y /o el incremento de BLM eliminación /desintoxicación, mediada por los receptores de la superficie celular o transportadores [31], antioxidantes moléculas /enzimas que reducen generado por el BLM ROS [11,32]; o enzimas que inactivan BLM [33,34]. Los estudios futuros deben estudiar más a fondo estos mecanismos.
En este estudio, la resistencia BLM también resultó en una menor G2 /M detención y la apoptosis de las células, en consonancia con los resultados de un estudio previo sobre una línea BLM resistentes sola [11] . El ligero aumento en G2 /M detención en la línea de base (antes de la alta dosis de tratamiento BLM) para estas sub-clones resistentes BLM podría explicarse por la exposición crónica a BLM. El hecho de que las células BLM resistentes eran capaces de proliferar en una concentración BLM que no era viable por sus líneas parentales sugiere que la evasión de bloqueo del ciclo celular podría ser otro mecanismo de resistencia. En conjunto, nuestros resultados sugieren que las células resistentes BLM pueden haber adquirido una mayor capacidad de prevenir /reducir el daño del ADN causado por la BLM. Esto a su vez, puede haber dado lugar a la detención de G2 y la apoptosis reducida /M.
Un paso a paso la escalada de dosis método para el desarrollo de resistencia BLM puede dar lugar a una relación dosis-respuesta entre la concentración de mantenimiento de BLM, IC
50 valores y tiempos de duplicación observados en ACHN
0, AHCN
0,1 y AHCN
0,25 células. Sin embargo, hasta que estos resultados se confirman en otros conjuntos de sub-clones, esto seguirá siendo un hallazgo interesante en la necesidad de validación.
Después de la eliminación de las concentraciones de BLM el mantenimiento de todos los siete sub-clones resistentes, hubo reversión parcial de IC
50 valores y el tiempo de duplicación en tres de las siete líneas celulares. La ausencia de reversibilidad en las otras cuatro líneas de células podría ser el resultado de diferencias de líneas celulares individuales, o tal vez estas líneas celulares necesarios descansos más largos de la exposición BLM para desarrollar sensibilidad BLM de nuevo. A nuestro entender, la literatura sobre la marcha atrás BLM-resistencia en líneas celulares de cáncer ha sido extremadamente limitada.