Extracto
La línea celular de cáncer de ovario resistentes al cisplatino IGROVCDDP es también resistente a paclitaxel y el fenotipo de resistencia modelos de los pacientes con cáncer de ovario en recaída después de la quimioterapia de primera línea de platino /taxano. Se utilizó una matriz de baja densidad TaqMan (TLDA) para caracterizar la expresión de 380 genes asociados con la resistencia a la quimioterapia en las células IGROVCDDP. resistencia a paclitaxel en IGROVCDDP está mediada por el gen y la proteína de la sobreexpresión de la glicoproteína P y la proteína es funcionalmente activa. la resistencia a cisplatino no se invirtió por elacridar, lo que confirma que el cisplatino no es un sustrato de la glicoproteína P. la resistencia a cisplatino en IGROVCDDP es multifactorial y está mediada en parte por la vía de glutatión y la disminución de la acumulación de fármaco. glutatión celular total no se incrementó. Sin embargo, son regulados hasta la actividad enzimática de la GSR y GGT1. La localización celular de transportador de cobre CTR1 cambió de membrana asociada en IGROV-1 a citoplasmática en IGROVCDDP. Esto puede mediar el defecto acumulación se informó anteriormente. Hubo disminución de la expresión de la bomba de sodio y potasio (ATP1A), MRP1 y FBP, que todos han sido previamente asociado con defectos de acumulación de platino en líneas celulares resistentes al platino. localización celular de MRP1 también fue alterada en IGROVCDDP desplazamiento hacia la membrana basolateral, en comparación con IGROV-1. BRCA1 fue también hasta reguladas a nivel de genes y proteínas. La sobreexpresión de P-glicoproteína en un modelo resistente desarrollado con cisplatino es inusual. Esto demuestra que la glicoproteína P puede ser de hasta reguladas como una respuesta de estrés generalizado en lugar de como una respuesta específica a un sustrato. Mecanismos que se caracterizan en las células IGROVCDDP pueden ser aplicables a pacientes con cáncer de ovario en recaída tratados con quimioterapia de primera línea de platino /taxano
Visto:. Stordal B, Hamon M, McEneaney V, S Roche, Gillet JP, O'Leary JJ, et Alabama. (2012) La resistencia a paclitaxel en una línea celular de cáncer de ovario resistentes al cisplatino está mediado por la P-glicoproteína. PLoS ONE 7 (7): e40717. doi: 10.1371 /journal.pone.0040717
Editor: Alexander James Roy Bishop, Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de febrero, 2012; Aceptado: June 12, 2012; Publicado: 11 Julio, 2012
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Financiación:. Esta investigación fue financiada por una Marie Curie Fellowship Internacional Recepción del programa de la Unión Europea 7PM, y un Irlandesa contra el Cáncer Sociedad beca posdoctoral (BS) . La colaboración entre Britta Stordal y el Instituto Nacional del Cáncer fue apoyado por una beca de viaje de la Asociación Europea para la Investigación del Cáncer. Esta investigación también fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer, Centro de Investigación del Cáncer (JPG, MG). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y un nálisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El pronóstico de las mujeres con cáncer de ovario es muy pobre. La mayoría de los pacientes se presentan con enfermedad avanzada y la supervivencia a largo plazo en estos pacientes es de 10-30% [1]. El tratamiento actual del cáncer de ovario es la cirugía seguida de quimioterapia combinada con platino /taxano [1]. El medicamentos cisplatino y paclitaxel quimioterapéutico se utilizan en el tratamiento de muchos tumores sólidos, incluyendo el carcinoma de ovario. El cisplatino se une a la cadena de ADN, lo que dificulta tanto la replicación del ADN y la traducción del ARN y la apoptosis finalmente desencadenante. Paclitaxel causa citotoxicidad mediante la unión a y la estabilización de los microtúbulos polimerizados. Debido a sus diferentes mecanismos de acción, platinos y taxanos se combinan a menudo en la terapia del cáncer. la respuesta inicial a la quimioterapia en el cáncer de ovario es alto, pero hasta el 80% de los pacientes finalmente recaída y convertirse en platino /resistentes a taxano.
La línea celular de ovario resistentes al cisplatino IGROVCDDP es un modelo resistente al cisplatino-inusual, ya es también resistencia cruzada a paclitaxel. Cuando la resistencia a cisplatino adquirida se produce en líneas de células, sólo el 17% también son resistentes a paclitaxel [2]. 41% de los modelos resistentes a los medicamentos cisplatino no son resistentes a paclitaxel y 28% de los modelos de células llegan a ser hipersensibles a paclitaxel [2]. Esto sugiere que la mayoría de los pacientes con cáncer se beneficiarían de recibir quimioterapia que alterna entre cisplatino y paclitaxel, como el desarrollo de resistencia a es menos probable que resulte en la resistencia a la otra droga. El desafío es cómo identificar qué pacientes responderán bien a la terapia entre cisplatino y paclitaxel alterna. Esto se debe a que mientras la mayoría de los pacientes con cáncer puede responder bien a esta estrategia de tratamiento, la cohorte resistente a la cruz, que no respondan bien y necesitan ser tratados con la terapia alternativa.
modelos IGROVCDDP el fenotipo de resistencia de pacientes con cáncer de ovario que han fallado en primera línea de quimioterapia de combinación de platino /taxano estándar. fármacos quimioterapéuticos que IGROVCDDP es sensible a pueden ser adecuados para el tratamiento de cáncer de ovario resistente platino /taxano. Estudiar el modelo resistente a los medicamentos IGROVCDDP nos permitirá entender los mecanismos de resistencia cruzada entre los platinos y taxanos. Nuestro objetivo es traducir los marcadores moleculares de esta fenotipos de resistencia cruzada para el tratamiento clínico de carcinoma de ovario resistente a los medicamentos en recaída.
Métodos
Cultivo celular y Ensayos de citotoxicidad
La IGROV-1 línea celular de cáncer de ovario humano y su variante resistente a cisplatino IGROVCDDP se obtuvieron de Prof. Jan Schellens [3], [4]. Las células fueron cultivadas en antibióticos y libre de la quimioterapia RPMI (Sigma#R8758) con 10% de FCS (Lonza, Bélgica). Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 ° C, y fueron
Mycoplasma
libre. Para determinar las células de citotoxicidad (1 × 10
4 células /pocillo) se sembraron en placas de fondo plano, de 96 pocillos y se dejaron unir durante la noche. Los pocillos se trataron por triplicado con diluciones en serie de fármaco en un volumen final de 200 mL. controles libres de drogas se incluyeron en cada ensayo. Las placas se incubaron durante 5 días y la viabilidad celular se determinó usando un ensayo de fosfatasa ácida [5].
Array TaqMan Low Density (TLDA)
Las células (1.25 × 10
6 células /placa de 10 cm) se sembraron y deja que se unan y crecer durante 3 días para llegar a un 70-80% de confluencia. Después las células se tripsinizaron, se lavaron en 10 ml de PBS, se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. Los sedimentos celulares se almacenaron a -80 ° C antes del análisis. El ARN total se preparó usando un kit RNeasy Mini (Qiagen, Reino Unido). La matriz de TLDA se realizó en muestras por triplicado biológicos como se describe en Gillet
et al
. 2011 [6]. La mediana de expresión de cada muestra se resta de todas las expresiones de genes para esa muestra. Los datos fueron analizados utilizando
ArrayTools BRB
, una herramienta de análisis estadístico de microarrays de datos (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) [7]. Los genes expresados en menos del 50% de las muestras se separaron por filtración y se realizó una prueba t de dos muestras univariante para determinar los genes que fueron significativamente diferentes entre IGROV-1 y IGROVCDDP basado en una p & lt;. 0.01 de corte
la epirubicina Acumulación Ensayo
Las células se sembraron a una densidad de 2,5 × 10
5 en un matraz T25 sin ventilación. El día siguiente, el medio se retiró y las células se trataron con 1 epirubicina mu M durante 2 horas en presencia o ausencia de elacridar 0,25 M, 0,67 M, 3,33 M o 33,3 M de cisplatino. Las células se lavaron con 4 ml de PBS frío y se tripsinizaron. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en 1 ml de PBS y se realizó un recuento de células (9 l). Se centrifugaron las células restantes, sobrenadante se retiró y el sedimento se almacenaron a -20 ° C antes del análisis. a continuación, epirubicina total se cuantificó mediante LC-MS después de una preparación de la muestra de extracción líquido-líquido, de acuerdo con el método de la pared
et al
. 2007 [8].
Total celular glutatión Ensayo
Las células se sembraron a una densidad de 1,25 × 10
6 células en una placa de 10 cm de diámetro y dejó que se unieran durante la noche. Las células fueron tratadas con fármaco durante 24 horas, a continuación se tripsinizaron y un recuento de células realizan. Las células se lavaron en 10 ml de PBS, se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. Los sedimentos celulares se almacenaron a -20 ° C antes del análisis. glutatión total se determinó usando una modificación del Suzakake
et al
. [9]. Los sedimentos celulares se lisaron en 150 l de agua y se sonicaron, se añadieron 12,5 l de ácido sulfosalicílico 30% y se agitaron las muestras. Después de 30 minutos en hielo, los sobrenadantes libres de proteínas se recogieron por centrifugación (12 000
g
durante 5 minutos a 4 ° C). concentración de glutatión se determinó utilizando una mezcla de reacción que contiene 20 l de lisado o estándar, 90 l de tampón de trietanolamina, pH 8,0 (0,2 M), 30 l de NADPH (4 mM) y 20 uL de DTNB (6 mM). Después de 2 minutos a 30 ° C, la reacción se inició por la adición de 0,3 unidades de la glutatión reductasa por pocillo. Las placas se leyeron a 405 nM (precalentamiento a 30 ° C) con la medición cinética por un HT sinergia lector de placas, Bio-Tek® (MASON Technology). La velocidad de cambio de la ensayo cinético se calcula entonces por software KC4
glutatión reductasa (GSR) y la gamma glutamil transpeptidasa (GGT1) Ensayos de enzimas
Cultivo de células -. Las células (6,25 × 10
5 células /placa de 10 cm) se sembraron y dejó que se unieran durante la noche. Las células se trataron luego con 0,67 M de cisplatino. células tratadas con la droga y sus controles se tripsinizaron y un recuento de células llevan a cabo. Después, las células se lavaron en 10 ml de PBS, se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en 400 l de tampón de enzima frío de ensayo (100 mM fosfato de potasio monobásico, EDTA 100 mM; pH 7,5). Se añadió 16 l de 25 × completa inhibidor de proteasa (Roche, Reino Unido), y se sometió a ultrasonidos la muestra. Después de la centrifugación (13.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C) se recogió el sobrenadante y se congeló a -80 ° C antes del análisis
GSR -. GSR estándares (Sigma) se prepararon en tampón de dilución de la glutatión reductasa ( mM monobásico de fosfato de potasio 100; mM EDTA 100; 1 mg /ml de BSA, pH 7,5) que van desde 0.3-0.0037 unidades /mL. 40 l de cada muestra y el patrón se analizaron por duplicado en placas de 96 pocillos. A continuación, la mezcla de reacción se añadió a 160 l volumen total (2 mM de glutatión oxidado (100 l); DNTB 3 mM (50 l); NADPH 2 mM (10 l)).
GGT1- Este método fue adaptado de el método de Silber
et al
. [10]. normas GGT1 (Patricell, Reino Unido) se prepararon en agua que van desde 1000-1.6 unidades /L. 30 l de cada muestra y el patrón se analizaron por duplicado en placas de 96 pocillos. a continuación, se añadieron 100 l de mezcla de reacción (60 mM gamma-glutamil-p-nitroalinine (10 l); glyclglycine 55,5 mM en 133.33 mM Tris Base pH 8,5 (90 l)).
Análisis - Se leyeron las placas a 412 nM (precalentamiento a 30 ° C) y 405 nM (precalentamiento a 37 ° C) para GSR y GGT1 respectivamente, con la medición cinética por un lector de placa como se describe para el ensayo de glutatión.
Western Blots
Las células (1.25 × 10
6 células /placa de 10 cm) se colocaron en placas y dejó que se unieran durante la noche. Las células fueron luego fármaco-tratados con cisplatino y se cultivaron durante 3 días. Las células se resuspendieron en 100 l de tampón de lisis (0,01 M Tris /HCl, pH 7,4) y se sonicó. 20 g de proteína se diluyó en tampón de muestra de Laemmli, se hirvieron durante 3 minutos, se enfrió en hielo y se cargaron en 12% geles de Tris /glicina con un gel de apilamiento al 4%. Las muestras y los marcadores de peso molecular fueron entonces electrophoresised durante 90 minutos a 100 V. Los geles se electrotransfirieron a 0.45 micras membranas de nitrocelulosa (BioRad) durante 90 minutos a 100 V usando un sistema de transferencia húmeda (Biorad). Las membranas se bloquearon con leche sin grasa desnatada 5% (Biorad) en PBS durante 2 horas, después se incubaron con el anticuerpo primario preparado en 3% de leche desnatada /0,1% de Tween /PBS (Tabla 1) durante la noche a 4 ° C [11 ]. Las membranas se lavaron en 0,3% de Tween /PBS 3 x 10 minutos y después se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (Tabla 1). Las membranas se lavaron de nuevo y se expusieron al reactivo de luminol (Santa Cruz) o ECL avanzada reactivo Western Blot (GE Healthcare). Las membranas se expusieron a película autorradiográfica. β-actina transferencias se desarrollaron utilizando un anticuerpo fosfatasa alcalina (Tabla 1) y reactivo BICP Fast Sigma. Densitometría en un mínimo de n = 3 repeticiones biológica se realizó utilizando software Quantity One (Biorad), utilizando la corrección de fondo local. La abundancia de proteínas se normalizó a Ponceau para cada muestra y después de cada serie biológica se normalizó a IGROV-1.
Microscopía Confocal
Las células (1,5 × 10
5 células /pocillo) se sembraron en portaobjetos de cámara de 8 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. Todos los lavados fueron con PBS y todas las incubaciones fueron a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Las células se lavaron dos veces, y se fijaron con paraformaldehído al 4% (Sigma) en PBS durante 30 minutos a 37 ° C. Las células se permabilised con 0,5% Triton-X-100 (Sigma) durante 10 minutos y se lavaron dos veces. Las células se tiñeron con un /ml solución TRITC fluorescente 50 g en PBS durante 40 minutos y después se lavaron dos veces. Las células se incubaron entonces con tampón de bloqueo (0,02% de BSA en PBS) durante 30 minutos a 37 ° C. Las células fueron incubadas con el anticuerpo primario (Tabla 1) durante 2 horas en una atmósfera humidificada. Después, las células se lavaron 3 veces durante 5 minutos y se incubaron con anticuerpo secundario (Tabla 1) durante 1 hora. Después, las células se lavaron 3 veces durante 5 minutos. Las células después se cubrieron con medio de montaje que contiene DAPI (Sigma) y se almacenaron a 4 ° C antes de la microscopía. Las imágenes fueron capturadas con un aumento de x63 y 1 × zoom. Exploraciones se realizaron a 1 micras profundidades de intervalos fijos a través de las células, y las imágenes individuales o fusionadas se presentan ya sea como XY planos individuales a través de la sección media de las células o vista ortogonal.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se llevaron a cabo, como mínimo, por triplicado. De dos muestras, se utilizaron dos pruebas t de estudiantes de cola para determinar las diferencias significativas usando p & lt; 0,05. Como un punto de corte
Resultados
Resistencia taxano en IGROVCDDP está mediada por la glicoproteína P
El IGROV-1 y IGROVCDDP para 380 genes asociados con la quimiorresistencia por matriz TLDA con el fin de caracterizar los mecanismos de platino y resistencia taxano. Se encontraron 145 genes a ser significativamente diferente entre IGROV-1 y IGROVCDDP basado en una p & lt; 0,01 de corte. Los genes seleccionados para otros análisis se basaron en el más significativo por p-valor, así como las vías previamente asociados con el platino y la resistencia taxano (Tabla 2). Todos los genes enumerados en la tabla de dos fueron validados a nivel de proteínas por transferencia de western.
La expresión génica de P-glicoproteína (P-gp) se incrementa en IGROVCDDP (Tabla 2), y hay un aumento correspondiente en expresión de la proteína (Figura 1A). Un tratamiento de 3 días con una baja dosis de cisplatino tendió a aumentar la expresión de P-gp en tanto IGROV-1 y IGROVCDDP pero esto no fue significativo (Figura 1A). P-gp también se confirmó que era funcionalmente activa en IGROVCDDP con un ensayo de acumulación de epirubicina (Figura 1B). Las células IGROVCDDP tienen niveles significativamente más bajos de P-gp epirubicina sustrato después de una exposición de 2 horas en comparación con IGROV-1. Cuando IGROVCDDP se trató con 0,25 M de la elacridar inhibidor de P-gp, lo que impide la acción de la bomba de drogas [12] la masa acumulada de epirubicina aumentó y fue significativamente mayor que la de las células parentales IGROV-1. El aumento por encima del nivel de IGROV-1 es una observación interesante, y puede ser debido a las células IGROVCDDP ser tan dependiente de la P-glicoproteína de eflujo de fármaco; sufren más la acumulación del fármaco cuando se inhibe.
A) Western blot de la P-glicoproteína, IGROV-1 (barras blancas) y IGROVCDDP (barras grises) con y sin tratamiento con cisplatino 0,67 M durante 72 horas (barras a rayas). imagen representativa muestra. El gráfico muestra la cuantificación de n = 6 repeticiones biológicos normalizados de ß-actina. * Indica diferencias significativas entre IGROV-1 p & lt; 0,05 t-test de Student. B) La acumulación de epirubicina determinado por LC-MS. IGROV-1 (barras blancas) y IGROVCDDP (barras sombreadas). Las células fueron tratadas con 1 epirubicina mu M durante 2 horas, 0,25 M elacridar, 0,67 M, 3,33 M o 33,3 M cisplatino se investigaron como moduladores de la acumulación epirubicina. El gráfico muestra la cuantificación de n = 3 repeticiones biológicos normalizados al número de células. * Indica una diferencia significativa entre IGROV-1 IGROV-y CDDP,#indica una diferencia significativa en la adición de un modulador (p & lt; 0,05 estudiantes t-test). C) La citotoxicidad de IGROV-1 y IGROVCDDP a la P-glicoproteína y sustratos no-glicoproteína P.
IGROVCDDP células fueron seleccionadas por su respuesta a una variedad de agentes quimioterapéuticos (Figura 1C). IGROVCDDP células son significativamente más resistentes a los sustratos no-P-gp cisplatino y carboplatino [13]. IGROVCDDP también es significativamente resistente a sustratos de P-gp [14]; taxanos, paclitaxel y taxotere, la epirubicina y vinca alcaloide antraciclina vinblastina. Por el contrario, IGROVCDDP es hipersensible al tratamiento con sustrato no-P-gp 5-FU [15]. IGROVCDDP es resistente a metotrexato sustrato MRP1 [14], pero no es resistente a sustrato BCRP SN-38 (Figura 1C) [16]. El tratamiento con 0,25 M elacridar invierte de manera significativa la resistencia de las células IGROVCDDP a todos los sustratos de P-gp, pero no la resistencia al cisplatino, carboplatino y metotrexato. células IGROVCDDP son también más sensibles a elacridar tratamiento que IGROV-1 (Tabla 3). células IGROVCDDP han disminuido mRNA expresión de BCRP (Tabla 2) y no es detectable por transferencia de western (datos no mostrados). Esto sugiere que los efectos observados con el tratamiento de reversión elacridar son específicos de P-gp y no BCRP, que también inhibe elacridar.
Se investigó el impacto de la cooperación o pre-tratamiento con cisplatino sobre la citotoxicidad de paclitaxel y no se observó ningún cambio significativo (datos no mostrados). Del mismo modo, co- o pre-tratamiento con paclitaxel no invirtió la resistencia a cisplatino (datos no mostrados).
resistencia Platinum se asocia con un cambio intracelular de la captación de platino transportador CTR1 no resistencia mediada por MRP2.
a) citotoxicidad de IGROV-1 y IGROVCDDP de CuSO
4. B) ATP7A western blot. Las barras abiertas son IGROV-1, barras sombreadas son IGROVCDDP y las barras rayadas indican el tratamiento con 0,67 M de cisplatino durante 72 horas. imagen representativa muestra. El gráfico muestra la cuantificación de n = 4 repeticiones biológicos normalizados de ß-actina. C) CTR1 western blot. imagen representativa muestra. El gráfico muestra la cuantificación de n = 3 repeticiones biológicos normalizados de ß-actina. * Indica diferencias significativas entre IGROV-1 p & lt; 0,05 t-test de Student. CTR1 microscopía confocal in D) células IGROVCDDP IGROV-1 y E). planos XY se muestran para DAPI (azul), aparato de Golgi (rojo) y CTR1 (verde), una imagen fusionada también se muestra.
MRP2, un transportador que puede flujo de salida conjugados cisplatino, había disminuido la expresión génica en IGROVCDDP (Tabla 2), pero no era detectable por transferencia de western en cualquiera de las líneas de células (datos no presentados). Esto sugiere que no hay papel de la MRP2 transportador de flujo de salida de platino en la resistencia de platino de IGROVCDDP. transportadores de cobre también pueden desempeñar un papel en la absorción de platino (CTR1) y el flujo de salida (ATP7A y ATP7B) [17]. Una disminución en la expresión CTR1 o aumento de ATP7A o ATP7B potencialmente podría mediar resistencia de platino. Las células IGROVCDDP son 2,26 veces resistente a CuSO
4 (Figura 2) lo que sugiere que el metabolismo del cobre puede jugar algún papel en el mecanismo de resistencia. No hubo ningún cambio significativo en la expresión de ARNm CTR1, ATP7A y ATP7B en la matriz de TLDA (datos no mostrados). expresión de la proteína ATP7A tendió a aumentar en IGROVCDDP en respuesta a cisplatino, pero este cambio no es significativa (Figura 2B). Sin embargo, hubo una disminución significativa en la expresión CTR1, en respuesta al tratamiento con fármacos cisplatino en las células IGROVCDDP (Figura 2C). CTR1 está presente en la membrana celular en IGROV-1 y se desplaza de forma intracelular al citoplasma en IGROVCDDP (Figura 2D, E). Hay una cierta asociación de CTR1 con el aparato de Golgi en IGROVCDDP pero la tinción es consistente en todo el citoplasma.
Los transportistas como biomarcadores de la acumulación de defectos Platinum
Uno de la mayoría de los genes expresados diferencialmente significativos en IGROVCDDP se una disminución de la expresión de la Na
+ /K
+ bomba (ATP1A1) (Tabla 2), que ha sido previamente asociado con defectos de acumulación de platino [18]. El cisplatino no es transportado por ATP1A1 y potencial de membrana alterada puede jugar un papel en la acumulación pasiva de la droga. Hubo una disminución correspondiente en la expresión de la proteína de ATP1A1 (Figura 3A) y también una sensibilidad al tratamiento con el inhibidor de la ouabaína ATP1A1 [19] (Tabla 3). Sin embargo, cuando 0,01 nM ouabaína fue co-incubó en un ensayo de cisplatino citotoxicidad en lugar de la inversión de la resistencia en IGROVCDDP disminuyó la IC
50 tanto de las células IGROV-1 y IGROVCDDP igualmente, la resistencia pliegue entre las dos líneas celulares se mantuvieron constante (Tabla 3). IGROVCDDP no era resistente a NaCl o KCl como agentes individuales y la adición de 40 mM de estas sales no alteró significativamente la citotoxicidad cisplatino (datos no mostrados)
.
Las barras abiertas son IGROV-1, barras sombreadas son IGROVCDDP y barras a rayas indican el tratamiento con 0,67 M de cisplatino durante 72 horas. A) ATP1A1 western blot. imagen representativa muestra. El gráfico muestra la cuantificación de n = 4 repeticiones biológicos normalizados de ß-actina. B) MRP1 western blot. imagen representativa muestra. El gráfico muestra la cuantificación de n = 3 repeticiones biológicos normalizados de ß-actina. * Indica diferencias significativas entre IGROV-1 p & lt; 0,05 t-test de Student. MRP1 microscopía confocal en C) células IGROVCDDP IGROV-1 y D). imágenes ortogonales se muestran para una imagen fusionada de DAPI (azul) y MRP1 (verde), flechas en las barras laterales indican la apical (IGROV-1) y la localización basolateral de MRP1 (IGROVCDDP). FBP microscopía confocal en E) células IGROV-1 y F) IGROVCDDP. planos XY se muestran para DAPI (azul), actina (rojo) y FBP (verde), una imagen fusionada también se muestra.
Las investigaciones anteriores han demostrado disminución de expresión y un desplazamiento intracelular de proteínas de membrana MRP1 y FBP a estar asociada con un defecto en la acumulación de platino en líneas celulares resistentes al cisplatino [20]. Por lo tanto, hemos examinado la MRP1 y FBP como potenciales biomarcadores de un defecto en la acumulación de platino en IGROVCDDP. Las células IGROVCDDP tienen una disminución en la expresión de ARNm de MRP1 (Tabla 2), así como una pequeña disminución en la expresión de proteína MRP1 en respuesta al tratamiento con cisplatino (Figura 3B). distribución MRP1 se examinó por microscopía confocal (Figura 3C, D). La tinción en ambas líneas celulares IGROV-1 y IGROVCDDP es evidente en el citoplasma y la región perinuclear con algunas acumulaciones de MRP1 aparente. En IGROV-1 hay más MRP1 arriba y a lo largo de la línea azul en la vista ortogonal que indica que se encuentra en la mitad de la sección apical y en las células. Una mayoría de la tinción en IGROVCDDP está por debajo de la línea azul que se encuentra en la membrana basolateral. FBP se localiza principalmente adyacente al núcleo dentro de las vesículas discretas subcelulares; poca tinción citoplasmática es evidente (Figura 3E, F). No hay ningún cambio en la distribución celular de FBP entre IGROV-1 y IGROVCDDP, pero una disminución en la expresión de FBP en IGROVCDDP es evidente a partir de las imágenes confocales
.
Las barras abiertas son IGROV-1, barras sombreadas son IGROVCDDP y barras rayadas indican el tratamiento con 0,67 M de cisplatino. A) glutatión intracelular total. El gráfico muestra n = 3 repeticiones biológicos normalizaron al número de células. B) γGCS western blot. imagen representativa muestra. El gráfico muestra la cuantificación de n = 4 repeticiones biológicos normalizados de ß-actina. C) western blot GSR. imagen representativa muestra. El gráfico muestra la cuantificación de n = 3 repeticiones biológicos normalizados de ß-actina. D) ensayo de la enzima GSR. muestra el gráfico n = 4 repeticiones biológicos normalizaron al número de células. E) GGT1 western blot. imagen representativa se muestra el gráfico muestra la cuantificación de n = 3 repeticiones biológicos normalizados de ß-actina. E) GGT1 ensayo enzimático. muestra el gráfico n = 4 repeticiones biológicos normalizaron al número de células. * Indica diferencias significativas entre IGROV-1 p & lt; 0,05 t-test de Student.#Indica diferencia significativa de IGROVCDDP sobre la adición de cisplatino. G) La modulación de la citotoxicidad del cisplatino IGROV-1 y IGROVCDDP con la BSO.
resistencia de platino en IGROVCDDP se asocia con un aumento en el glutatión El reciclaje no Aumento de la síntesis de novo
La expresión del ARNm de la glutatión reductasa (GSR) y la gamma glutamil (GGT1) se aumentó significativamente tanto en IGROVCDDP (Tabla 2). funciones GSR para reciclar glutatión oxidado dentro de la célula [21], [22] y GGT1 recicla glutatión desde fuera de la membrana celular [21], [22]. La expresión de la proteína de GSR y GGT1 no se aumentó en las células IGROVCDDP, GSR se redujo significativamente en IGROVCDDP y no hubo ningún cambio en GGT1. (Figura 4A y 4B). Sin embargo, la actividad enzimática de ambos GSR y GGT1 aumentaron significativamente (Figura 4C y figura 4D); lo que sugiere que el glutatión es de ser reciclado más interior y desde el exterior de la célula.
Las barras abiertas son IGROV-1, barras sombreadas son IGROVCDDP y las barras rayadas indican el tratamiento con 0,67 M de cisplatino durante 72 horas. A) BRCA1 western blot. imagen representativa muestra. El gráfico muestra la cuantificación de n = 4 repeticiones biológicos normalizados de ß-actina. * Indica diferencias significativas entre IGROV-1 p. & Lt; prueba t de Student 0,05
IGROVCDDP células no tienen mayores niveles de glutatión, y los niveles no se incrementan con el tratamiento con cisplatino de bajo nivel (Figura 4E) . Los niveles de glutatión también eran más variables en las células IGROVCDDP. El tratamiento con 12,5 mM sulfoximina butathione (BSO), un inhibidor de γGCS [23] redujo significativamente glutatión celular tanto en las células IGROVCDDP IGROV-1 y (datos no mostrados). IGROV-1 y IGROVCDDP también tienen expresión de la proteína similar de γGCS y no está regulada positivamente en respuesta al bajo nivel de tratamiento con cisplatino (Figura 4F). tratamiento BSO también sensibiliza significativamente ambas líneas celulares con el cisplatino (Figura 4G). Sin embargo, el efecto fue equivalente y la resistencia a cisplatino pliegue se mantuvo constante (18,76 veces). Las células IGROVCDDP tendían a ser más sensibles al tratamiento con BSO solo en un ensayo de citotoxicidad, sin embargo esto no fue significativo (Figura 4G).
IGROVCDDP ha aumentado la expresión de BRCA1
El aumento de expresión de el gen BRCA1 reparación del ADN se ha asociado previamente con la resistencia a cisplatino [24]. IGROVCDDP células han aumentado ARNm (Tabla 2) y proteínas de expresión de BRCA1 (Figura 5A).
Discusión
La sobreexpresión de P-gp es inusual en un modelo de resistencia adquirida cisplatino
Resistencia a paclitaxel en células IGROVCDDP está mediada por una sobreexpresión de P-gp en el gen (Tabla 2) y el nivel de proteína (Figura 1A). P-gp se ha demostrado que es funcionalmente activa de los ensayos de citotoxicidad (Figura 1C) y ensayos de acumulación de epirubicina (Figura 1B). En contraste con otros estudios [25], el tratamiento con cisplatino a corto plazo no modulan la expresión de P-gp de proteína, actividad o citotoxicidad taxano en células IGROVCDDP (Figura 1A, 1B, datos no mostrados). Es inusual, pero no sin precedentes para ver un modelo de resistencia adquirida cisplatino sobreexpresan P-gp (Tabla 4) [26] - [30]. Esto probablemente representa una respuesta de estrés generalizado al tratamiento con cisplatino a largo plazo como el cisplatino no es un sustrato de la P-gp [13]. P-gp puede ser de hasta reguladas como parte de una respuesta a un aumento de especies reactivas del oxígeno (ROS) dentro de una célula [31]. Esta puede ser la razón por la expresión de P-gp se indujo en IGROVCDDP como ROS también se producen en respuesta a cisplatino [32]. Sin embargo, cuando las células se cultivan sin IGROVCDDP cisplatino en los medios de comunicación, parece ser otro estímulo que favorece la expresión de P-gp o P-gp está proporcionando una ventaja selectiva a las células IGROVCDDP.
Muchos de los modelos de la resistencia a los medicamentos adquiridos tendrá la sobreexpresión de un transportador, que effluxes el fármaco que se utilizó para desarrollar el modelo. La colchicina, un sustrato de la P-gp [33] seleccionada para la sobreexpresión de P-gp en células KB-8-5-11 [34] y epirubicina, un sustrato MRP1 [35] MRP1 expresión inducida en CCRF-CEM /E1000 [36]. Sin embargo, metotrexato, fluorouracilo, clorambucilo, cisplatino, hidroxiurea y todos se han demostrado que induce transitoriamente la expresión de P-gp en células de leucemia K562 cuando estos fármacos no son sustratos de la P-gp [15]. Le corresponde entonces a la selección natural, si las células que expresan transitoriamente P-gp tienen otra ventaja de supervivencia y se convierten en parte de la línea celular resistente a los fármacos. En algunos modelos resistentes al cisplatino que sobreexpresan P-gp, la P-gp no tiene ninguna ventaja en la supervivencia no es funcionalmente activa (SNU-601 /Cis10 - Tabla 4) [29]. Dentro de las líneas celulares que sobreexpresan P-gp resistentes al cisplatino también puede haber heterogeneidad; en SKOV3 /CEI P-gp poblaciones positivas y negativas se mantuvieron después del tratamiento con cisplatino, lo que indica que la P-gp no tiene ninguna ventaja de supervivencia para el tratamiento con cisplatino [27]. Sin embargo, la P-gp puede tener efectos anti-apoptóticos distintos de los relacionados con el transporte de fármacos citotóxicos, y algunos pueden ser mediada a través de flujo de salida de glucosilceramida pro-apoptótica [37], [38]. También es posible que algunos de los presentes de xenobióticos en el FCS utilizado para cultivar las células podrían ayudar en el mantenimiento de la expresión de P-gp en IGROVCDDP.
IGROVCDDP es el único modelo cisplatino resistente desarrollado a partir de IGROV-1 conocido para sobreexpresar P-gp y en consecuencia tienen un /fenotipo resistente a taxanos platino. modelos resistentes al cisplatino IGROV-1 /Pt0.5 y IGROV-1 /Pt1 [39] tienen el /fenotipo resistente a taxanos inversa platino. Otros modelos IGROV-1 resistentes al cisplatino se han desarrollado (IGROV-R10, IGROV-1 /CP), pero que no parecen haber sido examinados para la resistencia a los sustratos de P-gp o la expresión de P-gp. Sin embargo, la P-gp no ha sido identificado como diferencialmente expresadas por los perfiles genómicos o proteómicos [40] - [44].
resistencia de platino es multifactorial
resistencia de platino en las células IGROVCDDP es multifactorial y implica la vía de glutatión y la acumulación disminuida de drogas. Esto podría resultar de una vía de reglamentación compleja que controla muchos mecanismos diferentes para conferir resistencia al cisplatino, o podría reflejar el hecho de que se seleccionaron las células en varios pasos, por lo que podrían haber acumulado diferentes mecanismos en cada paso.
IGROVCDDP células son resistentes de bajo nivel para CuSO
4 que sugiere un papel del transporte de cobre en la resistencia de platino (Figura 2A).