PLOS ONE: La secreción de Novela SEL1L Endógeno variantes es promovido por el estrés ER /UPR vía endosomas y Shed vesículas en Cáncer Humano Cells

Extracto

Se describe aquí dos variantes endógenos novedosos del retículo endoplásmico humana (ER) SEL1LA receptor de carga, p38 y p28 designado. Los estudios bioquímicos y de interferencia de ARN en las células tumorigénicas y no tumorigénicas indican que p38 y p28 son N-terminal, ER-anclas y más estable con respecto a la SEL1LA transmembrana canónica. P38 se expresa constitutivamente y secreta, con el aumento después de estrés ER, en la línea de mieloma KMS11 y en las líneas de cáncer de mama MCF7 y SKBR3 pero no en la línea epiteliales de mama MCF10A no tumorigénicos. P28 sólo se detecta en la línea celular SKBr3 pobremente diferenciado, donde se secreta después de estrés ER. Consistentemente con la presencia de p38 y p28 en medios de cultivo, los estudios morfológicos de las células SKBR3 y KMS11 detectan immunolabeling SEL1L N-terminal en secretoras /compartimentos degradativos y vesículas de la membrana libera extracelularmente. Nuestros hallazgos sugieren que las dos nuevas variantes SEL1L están involucrados en el tráfico endosomal y la secreción a través de vesículas, lo que podría contribuir a aliviar el estrés ER en las células oncogénicas. Por lo tanto, P38 y P28 podrían ser relevantes como marcadores de diagnóstico y /o dianas terapéuticas en el cáncer

Visto:. Cattaneo M, Lotti LV, Martino S, Alessio M, Conti A, Bachi A, et al. (2011) La secreción de Novela SEL1L Endógeno variantes es promovido por el estrés ER /UPR vía endosomas y Shed vesículas en las células cancerosas humanas. PLoS ONE 6 (2): e17206. doi: 10.1371 /journal.pone.0017206

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: 26 Octubre, 2010; Aceptado 22 de enero de 2011; Publicado: 17 Febrero 2011

Derechos de Autor © 2011 Cattaneo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de MIUR-FIRB nRBIP064CRT Ministero Università e Ricerca (MIUR), y MAPLOMBARDIA, Grant 7/193 ar 3 a IB, MIUR 60% becas de la Universidad la Sapienza de LVL, MIUR 60% de G subvenciones 2008-2010 . d'Annunzio Universidad de RMC, y con una donación de 2009 de la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) de RMC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

múltiples mecanismos homeostáticos que controlan el plegamiento de proteínas y de reunión y promueven la eliminación de las proteínas defectuosas operar en compartimentos celulares distintos para proporcionar protección contra el estrés proteotoxic endógena [1] - [4]. El retículo endoplásmico (ER) es el sitio de plegado y montaje para las proteínas estructurales y enzimas residentes, así como para las proteínas de secreción y de membrana plasmática [5]. Esta notable carga de trabajo es administrado por eficiente y de alta fidelidad plegamiento de proteínas y misfold de corrección de sistemas, sobre la base de chaperones y disulfuro isomerasas dependiente de ATP, en paralelo con mecanismos de control de calidad que permiten Golgi tránsito sólo las proteínas a correctamente plegadas [6]. Además, el aclaramiento de proteínas aberrantes retenidos en el ER está mediada a través de la vía de degradación de ER-asociado (ERAD) [7], un proceso de múltiples pasos que requiere el reconocimiento de proteínas defectuosas, retro-translocación al lado citosólico de la membrana del ER, ubiquitinación y la degradación por el proteasoma 26S [8].

No obstante, la capacidad de plegamiento de proteínas celulares y de la vía ERAD puede verse afectada y /o sobrecargado por una variedad de condiciones patológicas que perturban la energía y calcio homeostasis, aumento la síntesis de proteínas de secreción y /o interferir con la formación de la glicosilación de proteínas y enlace disulfuro [6], [9]. En tales casos la acumulación intraluminal de proteínas desplegadas /malfolded determina estrés ER, que a su vez activa una compleja cascada de señalización de las vías de supervivencia, colectivamente denominado respuesta de la proteína desplegada (UPR). Esto tiene como objetivo aliviar el estrés ER mediante la atenuación de la tasa de síntesis de proteínas y por hasta la regulación de las enzimas plegamiento de proteínas, la maquinaria ERAD y la capacidad secretora [6], [10], [11]. Si los mecanismos de la homeostasis no se puede restaurar, activa-UPR pueden desencadenar la muerte programas /senescencia [12].

Cada vez es más evidente que la UPR tiene un papel importante en el cáncer, en el que se requiere para mantener el fenotipo maligno y a desarrollar resistencia a la quimioterapia [13]. De hecho las células cancerosas deben adaptarse al hambre de nutrientes y la hipoxia, que afectan el estado redox celular y la disponibilidad de energía a partir de la hidrólisis de ATP. Se espera que esto comprometa su capacidad de plegamiento de proteínas, lo que predispone al estrés ER [14] - [16]. Por lo tanto, la regulación de las vías ERAD-EPU puede contribuir sustancialmente a las adaptaciones celulares complejas necesarias para la progresión del cáncer [17], [18]. En este sentido, se sabe que muchas proteínas ER-residentes están desreguladas, después de la traducción modificada, de manera anormal secretada y /o de la superficie celular de re-localizados en diversos tipos de cáncer [13], [19] - [21].

El gen ERAD multifacético
SEL1L gratis (sel-1 supresor de lin-12,
C.elegans
similares a) codifica por lo menos tres diferentes isoformas de la proteína,
es decir,
, la canónica SEL1LA ER-residente, un receptor de carga que se asocia con la ligasa de ubiquitina-proteína E3 HRD1 [22] - [25], y el más pequeño, recientemente clonado SEL1LB y -C, que carecen de la membrana SEL1LA C-terminal que abarca la región para su inserción en el ER [26]. Varios informes han demostrado que la expresión de la proteína SEL1L varía en tumores humanos relativos a los tejidos normales emparejados, que sugiere una participación en la progresión del cáncer [27] - [32].

Presentamos aquí la identificación, caracterización y localizaciones subcelulares de dos Anchorless novedosas variantes endógenos SEL1L, p38 y p28, que estudia en las líneas celulares de cáncer de mama SKBR3 y MCF7, la línea de mieloma múltiple KMS11 y las líneas no tumorigénicas MCF10A (mama) y 293FT (riñón embrionario). Se encontró que:
i
p38 y p28 son codificados por el extremo 5 'de la
SEL1L
gen;.
ii
. p38 está regulado y constitutivamente secretada en las células cancerosas, a diferencia de la línea MCF10A no cancerigeno .
iii
p28 se expresa sólo en la línea de cáncer de mama SKBr3 pobremente diferenciado; .
iv estrés
ER /UPR mejorar fuertemente la secreción de p38 en las células cancerosas;
v
. SEL1L N-terminal está presente en compartimentos secretores y de degradación de las células SKBR3 y KMS11, y en vesículas libera en el espacio extracelular. En general, la evidencia bioquímica y morfológica apoya la opinión de que p38 y p28 SEL1L están implicadas en vías de vinculación de estrés ER /UPR con el tráfico endosomal y para la secreción a través de vesículas arrojar extracelularmente. Además, la expresión de p38 y p28 y su liberación en el medio de cultivo está regulada positivamente en tumorigénico con relación a las células no tumorigénicas, lo que sugiere funciones relacionadas con el cáncer.

Materiales y Métodos

Las líneas celulares, la cultura condiciones, transfecciones

mieloma múltiple humano KMS11, MCF7 cáncer de mama, SKBr3, MDAMB453, linfoma Namalwa, cáncer cervical HeLa y G144 glioblastoma, las células se mantuvieron G166 y G179 en medio RPMI que contenía suero bovino fetal 10% (Euroclone, Celbio, Pero, Italia). embrión células 293 FT riñón humano se cultivaron en DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal (Euroclone, Celbio, Pero, Italia). MCF10A células de mama no tumorigénicas [33] se mantuvieron en MEBM (Lonza, Treviglio, Italia), suplementado con EGF, 20 ng /ml; bFGF, 20 ng /ml; insulina, 10 mg /ml; y hidrocortisona, 0,5 g /ml. células fetales humanos no tumorigénicos CB660 cerebro, obtenidos a partir de Prof. Austin Smith (Cambridge, Reino Unido), se mantuvieron en medio de células madre neural humana en los platos recubiertas con laminina. Las células fueron transfectadas transitoriamente con los plásmidos y siRNAs indicados por Lipofectamine 2000 (Invitrogen, S.Giuliano M.se, Italia) y se recogieron después de la hora indicada. Las células se trataron con DTT (2 mM) durante 3 hrs, MG132 (10 mM) durante 3 o 22 horas, cicloheximida (200 mg /ml) durante 3, 6, 18 horas, como se indica.

Construye

Tagged TPD52 isoforma 1 construcciones se generaron mediante la clonación de la secuencia de longitud completa TPD52 isoforma 1 de codificación, fusionado con una etiqueta myc o GFP en el extremo 3 ', en pCDNA3.1myc-Hys (-) a o vectores peGFPN3 , respectivamente (Invitrogen, San Giuliano M.se, Italia). Los Myc-etiquetados
SEL1LB
construcciones fueron descritos anteriormente [26].

RT-PCR

El ARN total fue extraído por medio de la solución de reactivo TRI (Applied Biosystems, Monza Italia) . El ARN se transcribe inversa con superíndice TM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las amplificaciones por PCR semi-cuantitativos se realizaron con 2 l de producto RT por reacción y 0,15 unidades de Platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italia), utilizando un instrumento Mastercycler (Eppendorf, Milán, Italia). condiciones de PCR para todos los experimentos aquí descritos fueron: desnaturalización a 95 ° C durante 3 min, seguido de 22 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, luego a 60 ° C durante 72 segundos. Se utilizaron los siguientes cebadores específicos:


SEL1LA
: sentido: 5'-ctcgctaacaggaggctcagtagtac-3 '; antisentido: 5'-gccactggcatgcatctgagc-3 '


HRD
1: sentido: 5'-ggccagggcaatgttccgc-3'; antisentido: 5'-gtccattgcctggagctcc-3 '


BIP
: sentido:. tgcagcaggacatcaagttc 5'-3'; antisentido: 5'-cgctggtcaaagtcttctcc-3 '


ATF6
: sentido: 5'-ctgatggctgttcaatacac-3'; antisentido: 5'-aatgactcagggatggtgct-3 '


CHOP
: sentido: 5'-gatggcagctgagtcattgc-3'; antisentido: 5'-atgcttggtgcagattcacc-3 '


XBP-1 |: sentido: 5'-ccttgtagttgagaaccagg-3; antisentido: 5'-ggggcttggtatatatgtgg-3 '


GADD45β
: sentido: 5'-ggaagagctcgtggcgtgcg-3'; antisentido: 5'-gtctcgggcctcggtggtgc-3 '


SEL1LB
: sentido: 5'-ccggccccgagaggaggatgcgggtc-3'; antisentido: 5'-ggggaaacatagataccatg-3 '


SEL1LC
: sentido: 5'-ccggccccgagaggaggatgcgggtc-3'; antisentido: 5'-ggggcaatcagccaaactaatca-3 '


HPRT
: sentido: 5'-aattatggacaggactgaacgtc-3' antisentido: 5'-cgtggggtccttttcaccagcaag-3 '

Western Blot, inmunoprecipitación, análisis de sobrenadantes de cultivo, N-glucosidasa F y la digestión con endoglicosidasa H

el anticuerpo monoclonal SEL1L se planteó contra el péptido N-terminal de SEL1L humana [34]. Purificado por afinidad anticuerpo policlonal a la SEL1L N-terminal fue proporcionado amablemente por el Dr. H. L. Ploegh [35]. anticuerpo SEL1L C-terminal policlonal purificado por afinidad se elevó contra un expresada por bacterias aminoácidos fragmento que codifica recombinantes 575-738 de SEL1L humana (Primm, Milán, Italia). anticuerpos monoclonales anti-vinculina y anti-myc se adquirieron de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Milán, Italia). Policlonal anti-TPD52 fue proporcionado amablemente por el Prof. J. Byrne (Universidad de Sydney, Sydney, NSW, Australia). Las células fueron lisadas en 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 150 mM, 1% de NP40, que contiene inhibidores de la proteasa (Pierce, Celbio, Pero, Italia). Las concentraciones de proteína se determinaron por el ensayo de Bradford; muestras se resolvieron en geles de SDS-poliacrilamida, se transfirieron a membranas de PVDF, se sondaron con anticuerpos específicos y se desarrolló con ECL (GENESpin, Milán, Italia). Para la inmunoprecipitación de lisados ​​de células se pre-aclararon y se incubaron con anticuerpos inmovilizados en proteína G-Sepharose (Invitrogen S. Giuliano M.se, Italia). Los inmunoprecipitados se lavaron dos veces con 10 mM Tris-HCl pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,25% de NP40, una vez con 5 mM Tris-HCl, y se eluyeron con tampón de muestra antes de la electroforesis en gel. Para el análisis de las células sobrenadantes se lavaron y se incubaron con OPTIMEM (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Italia) durante 16 hrs. Los sobrenadantes se recuperaron, se centrifuga, se precipitó con TCA al 10%, se resuspendió con 1 M Tris-HCl pH 7,4 y se resolvieron en geles de poliacrilamida SDS. Todas las transferencias de Western se realizaron con el X-blot Cámara (www.isenet.it).

Para la digestión por
N
-glycosidase F (PNGasa F) o endoglicosidasa H (endo H), lisados ​​de células se desnaturalizaron por calentamiento a 95 ° C en 0,05% de SDS, 0,1% mercaptoetanol durante 10 min y después se incubaron a 37 ° C durante 1 h con o sin PNGasa F o endo h (New England Biolabs, Celbio, Pero, Italia) , de acuerdo a las indicaciones del proveedor.

inmunofluorescencia microscopía

células SKBR3, cultivadas en cubreobjetos, no tratados o tratados con TDT como se describió anteriormente, se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 30 min, se lavaron en 0,1 M de glicina durante 20 min, y se permeabilizaron en 0,1% de Triton X-100 para adicional 5 min. Para investigar las localizaciones subcelulares de SEL1L, las células se incubaron con el anticuerpo anti-SEL1L monoclonal N-terminal [34] y con anticuerpos policlonales contra la calreticulin marcador ER (Affinity Bioreagents, Breda, Países Bajos) y el aparato de Golgi marcador Giantin (Covance , Princeton, NJ, EE.UU.). Los núcleos se tiñeron con 4,6-diamido-2-fenilindol (DAPI, Sigma-Aldrich, Milán, Italia). Los anticuerpos primarios se visualizaron utilizando isotiocianato de fluoresceína conjugado de cabra anti-IgG de ratón (Cappel Research Products) o IgG de cabra anti-conejo de Texas-Red-conjugado (Jackson ImmunoResearch Laboratories) durante 30 min a temperatura ambiente. Las células se analizaron usando un microscopio invertido Apotome Axio Observador Z1 (Zeiss, Oberkochen, Alemania), equipado con un AxioCam MRM Rev.3 a 40X aumentos. Colocalización de las señales de fluorescencia se analizó con software AxioVision 4.6.3. El análisis de imágenes se realizó usando Adobe Photoshop.

Cryoimmunoelectron microscopía

células procesadas para microscopía cryoimmunoelectron se cultivaron como anteriormente y se fijaron en paraformaldehído al 2%, 0,2% glutaraldehído en tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,4, durante 2 horas a 25 ° C. Las células se rasparon los cubreobjetos, se centrifugó, incrustadas en 10% de gelatina (Sigma-Aldrich) en 0,1 M PBS, pH 7,4 y se solidifica en hielo. Después de la infusión en sacarosa 2,3 M durante la noche a 4 ° C, los bloques de celdas fueron montados en las patas de aluminio y se congelaron en nitrógeno líquido. Ultrathin secciones criogénicas (60 nm) fueron cortadas a -120 ° C usando un cryoultramicrotome Ultracut EM FC 6 (Leica Microsystems, Viena, Austria), recogidos con 1% de metilcelulosa en 1,15 M de sacarosa y sencilla o doble immunolabelled con anticuerpos primarios. Los anticuerpos unidos se visualizaron utilizando cabra anti-ratón conjugado con 5 ó 15 nm de oro coloidal (British BioCell International, Cardiff, Reino Unido) o por la proteína-A conjugada con oro coloidal 10 nm (suministrado por G.Posthuma y J. Slot , Utrecht, Países Bajos). Immunolabeling se realizó con los siguientes anticuerpos primarios: monoclonal anti-SEL1L N-terminal [34], anticuerpos policlonales anti-SEL1L N-terminal [35], policlonal anti SEL1L-C terminal, policlonal anti-calreticulina (Affinity Bioreagents), anti-CD63 monoclonal H5C6, desarrollado por JT Agosto y J.E.K. Hildreth, obtenido a partir del hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de Biología (Iowa City, IA 52242), y el anticuerpo monoclonal anti-c-Myc (Sigma-Aldrich) para
SEL1LBmyc
transfectadas las células 293 pies [26]. immunolabeling simple y doble se realizaron como se describe anteriormente [23], [36]. Cryosections se analizaron con un microscopio electrónico de transmisión Philips CM10.

Off-gel de proteínas fraccionamiento

fraccionamiento isoelectroenfoque fase semi-líquido se realizó en un aparato de 3100 Off-Gel (Agilent Technologies, Cernusco, IT ) usando una tira de 24 cm con geles de gradiente de pH inmovilizado en el rango de 4-7. Total de muestras de lisados ​​de células (360 l, que corresponden a 1,300 g de proteínas) se mezclaron con 3240 l de tampón de enfoque isoeléctrico (Agilent Technologies) y se cargaron en el aparato. fraccionamiento de proteínas se realizó durante 26 horas con máximo 8.000 voltios para un total de 60.000 V /h, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se recogieron las fracciones líquidas resultantes (150 l) con 0,25 intervalo de pH y las alícuotas de las proteínas resueltas más en 10% de acrilamida SDS-PAGE para Western blot de sondeo.

Identificación de proteínas por MALDI-TOF espectrometría de masas (MS) análisis

bandas de interés a partir de SDS-PAGE se escindieron de los geles, reducida, alquilada y digerida durante la noche con tripsina bovina (Roche, Milán, Italia), como se describe anteriormente [37]. Una l (1 l) partes alícuotas de sobrenadante se utilizaron para el análisis de masas mediante la técnica de gota se seca y ácido α-ciano-4-hidroxicinámico como matriz. Los espectros de masas se obtuvieron en un espectrómetro de masas MALDI-TOF Voyager-DE STR (Applied Biosystem, Foster City, CA). Alternativamente, ácido y básico de extracción de péptido de trozos de gel después de la digestión tríptica se llevó a cabo y las mezclas de péptidos resultantes se sometió a una sola etapa de desalado /concentración antes del análisis MS sobre Zip-TipC18 (Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.). Los espectros se calibra internamente usando productos de autolisis de tripsina y procesada a través de software Data Explorer. Las proteínas se identificaron mediante búsquedas de forma inequívoca una base de datos de proteínas no redundante integral del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y la espectrometría de masas secuencia de la proteína base de datos (datos MSDB, http: //msdn.microsoft.com/en-us/library/ms187112.aspx), seleccionado por defecto utilizando en la casa de los programas de software v4.10.5 profundo y v1.9.00 la mascota, respectivamente [38], [39]. Uno de menos fue permitido por la escisión del péptido, y se utilizó una tolerancia de masa inicial de 50 ppm en todas las búsquedas.

Resultados

Novel SEL1L ER-anclas variantes

Un anticuerpo monoclonal generado contra el N-terminal de la proteína SEL1L [34] se utilizó para rastrear un panel de lisados ​​enteros de cinco líneas celulares humanas, incluyendo MCF7 y SKBr3 (cáncer de mama), KMS11 (Ig-K secretoras de mieloma múltiple), 293FT ( de riñón de embrión) y la línea celular epitelial de mama MCF10A no tumorigénicos. Además de la proteína de 95 KDa SEL1LA bien conocido, dos bandas de aditivos, designados como p38 y p28, se visualizaron en aproximadamente 38 KDa y 28 KDa (Figura 1A). Mientras que p28 se detectó exclusivamente en la línea de SKBr3, se expresó fuertemente p38, a niveles superiores a SEL1LA, en todas las líneas celulares de cáncer analizadas, con niveles más bajos en MCF10A, donde también fue menor expresión SEL1LA (proteínas y ARN) (Figura 1A- SEGUNDO). Un anticuerpo policlonal generado contra la SEL1L C-terminal, que abarca el ancla cola SEL1LA para la inserción en la membrana del ER, que se detectó la proteína de 95 KDa SEL1LA, pero no p38 y p28, aunque una banda adicional se evidenció en alrededor de 55 KDa, lo que podría indicar el fragmento carboxi-terminal resultante de la escisión de la proteína nativa (Figura S1A). Cabe destacar que la variante de p38 se expresó fuertemente también en otras líneas celulares de cáncer probadas, incluyendo Namalwa (linfoma), MDAMB453 (cáncer de mama), HeLa (cáncer cervical), y G144, G166, G179 (glioblastoma), todo lo cual resultó negativa para p28 (Figura S1B). Análisis de SEL1L perfil de proteínas en la línea de no tumorigénicos fetal humano de las células cerebrales CB660 en comparación con las tres líneas celulares de glioblastoma (Figura S1B) proporcionó más
in vitro
evidencia de que p38 se expresa en efecto en los niveles más altos en las células tumorales.

A. El análisis de transferencia Western: Los lisados ​​(50 ug) de diferentes líneas celulares, incluyendo 293FT (embrión de riñón), MCF10A (mama no tumorigénicos), MCF7, SKBr3 (cáncer de mama) y KMS11 (mieloma múltiple), se resolvieron por SDS-PAGE ( 10%) y se sondaron con anticuerpos monoclonales a SEL1L N-terminal. Vinculina se utilizó como control de carga. Además de SEL1LA (95 KDa), el anticuerpo SEL1L N-terminal reconoció dos más pequeños productos codificados, aproximadamente a las 38 y 28 kDa (p38 y p28 designado). P38 fue más abundante que SEL1LA y ambos eran hasta modulada en las líneas celulares de cáncer en relación con MCF10A. P28 fue detectable solamente en SKBr3. Bandas por encima de p38, que corresponde probablemente a la inmadurez de los precursores o productos modificados después de la traducción, se ven ocasionalmente en las líneas celulares ensayadas. La mancha es representativos de cuatro experimentos independientes. B. RT-PCR análisis: RNAs de KMS11, MCF10A y células SKBR3 se analizaron por RT-PCR usando cebadores específicos para
SEL1LA
. Las señales que se muestran se obtuvieron con 27 ciclos de
SEL1LA
.
HPRT
se utilizó como control de carga.
SEL1LA
fue hasta modulada en las líneas celulares de cáncer en relación con la línea de MCF10A no tumorigénicos. La imagen puede no coincidir tres ensayos diferentes en función de los tratamientos independientes. C.
intra /inter
-molecular análisis de enlaces disulfuro de la p38. lisados ​​celulares 293FT se resolvieron mediante SDS-PAGE (10%) en condiciones reductoras (R) y condiciones no reductoras (NR) y se transfirieron con monoclonal anti-SEL1L N-terminal. P38 migra como un doblete en condiciones no reductoras (los carriles de la comparación de la migración de p38 en condiciones reductoras y no reductoras son del mismo gel). células SKBR3 (3 × 10
5) fueron tratados con siRNA codificado o siRNA a SEL1L (siRNA SEL1L) de 48: D. abajo de la modulación de SEL1LA, p28 y p38 por SEL1L pequeños ARN de interferencia (siRNA): Panel izquierdo hrs, seguido de un segundo tratamiento siRNA para otras 48 hrs. silenciando la eficiencia se verificó mediante Western blot. SEL1LA, los niveles de p28 y p38 de la proteína disminuyó cerca de 55%, 30% y 16% respectivamente, en comparación con las células tratadas con ARNsi revueltos. Vinculina se utilizó como control de carga. Panel derecho: 293FT células (6 × 10
5) fueron tratados con siRNA codificado o siRNA-SEL1L durante 48 horas. los niveles de proteína p38 SEL1LA y disminuyeron cerca de 45% y 23% respectivamente, en comparación con las células tratadas con ARNsi revueltos. Vinculina se utilizó como control de carga. Los histogramas muestran los valores normalizados con respecto a las señales de limpieza y se expresaron como la modulación veces en relación con los controles, se determinó el análisis densitométrico utilizando el programa de formación de imágenes Scion. (Www.scioncorp.com). Los datos son los promedios de tres experimentos independientes, ± SD; Se utilizó la prueba t de Student para determinar la significación estadística *
p Hotel & lt; 0,1; **
p Hotel & lt; 0,05. E. Análisis de p38 y SEL1LA estabilidad: células 293 pies (6 × 10
5) se trataron durante 3, 6 y 18 horas con cicloheximida (CHX, 200 g /ml). Alícuotas de los lisados ​​(50 g) se resolvieron mediante SDS-PAGE (10%) y se sondaron con monoclonal anti-SEL1L y los anticuerpos anti-vinculina. A diferencia de SEL1LA, que disminuyó progresivamente durante la exposición cicloheximida hasta aproximadamente 90%, los niveles de p38 no cambiaron significativamente. El histograma muestra las cuantificaciones densitométricos obtenidos a través del programa de formación de imágenes Scion (www.scioncorp.com). Los valores se normalizaron con respecto a las señales de limpieza y se expresaron como la modulación veces en relación con las muestras sin tratar. Los datos son promedios de dos experimentos independientes, ± SD.

Cuando se analizó en 293FT células por SDS-PAGE y de inmunotransferencia en condiciones reductoras, p38 migra como un monómero, mientras que parecía como un doblete en condiciones no -Reducción de condiciones (Figura 1C). Por lo tanto, mientras que muchas proteínas que contienen enlaces disulfuro intramoleculares migran más rápidamente bajo condiciones no reductoras debido a la estructura nativa más compacto [40], p38 migró más rápido en reducida que en estado oxidado, un fenómeno que sugiere que la forma de migrar más lentamente podría participar en enlaces disulfuro intermoleculares [41] - [43]. La señal de p28 apareció como una sola banda, tanto en condiciones reductoras y no reductoras (datos no mostrados).

Para cerciorarse de que p38 y p28 eran
de buena fe
endógena de
SEL1L
proteínas codificados con, SKBr3 y 293FT células fueron transfectadas con siRNAs dirigidos el SEL1L N-terminal. Los niveles de las tres señales SEL1L fueron significativamente menores en las células tratadas con
SEL1L
frente siRNAs revueltos, con descensos del 55% y el 45% para SEL1LA y de 16% y 23% para p38 en células SKBr3 y 293FT respectivamente, y de 30% para p28 en SKBr3 (Figura 1D). En 293FT células, la inhibición de la síntesis de proteínas por la cicloheximida durante 3 y 6 horas, las ventanas de tiempo que no dan lugar a la muerte celular, disminución del nivel SEL1LA en alrededor de 50%, pero casi no tenía efecto sobre p38 (Figura 1E). A las 18 horas, cicloheximida causó la muerte celular, concomitante a una drástica reducción de SEL1LA (aproximadamente 90%), pero no modificó el nivel de p38. Esto indica que p38 es más estable que SEL1LA, lo que puede explicar el agotamiento p38 modesta por siRNAs a la SEL1L N-terminal.

En conjunto, estos datos indican que p38 y p28 son variantes de proteínas codificadas por el SEL1L 5 'final de la
SEL1L
gen. Mientras p38 dio como resultado se expresa en todas las líneas celulares ensayadas, con niveles más altos en las líneas de cáncer, p28 se detectó sólo en la línea de cáncer de mama metastásico pobremente diferenciado SKBR3 [44].

Las variantes de p38 y p28 poseen propiedades secretoras

Para explorar el comportamiento y la secreción de p38 y p28 en las células sometidas a estrés ER /UPR, se analizaron por SDS-PAGE y de inmunotransferencia de células lisados ​​y sobrenadantes de cultivo de MCF10A, SKBr3 y células KMS11 en condiciones normales y después del tratamiento con DTT, lo que provoca el mal plegamiento de proteínas mediante la reducción de los enlaces disulfuro [45] (Figura 2A-C). En todas las células de la prueba TDT desencadena el estrés ER /UPR, evaluada por
empalme XBP-1 | combinado con
BIP
,
ATF6
y
CHOP
hasta -modulation, e impulsado
SEL1LA
la expresión de ARNm (Figura 2A1, C1; Figura S2A-C), mientras que el nivel de proteína SEL1LA no aumentó significativamente (Figura 2A-C, C2). P38, pero no SEL1LA, era fácilmente detectable en SKBr3 y KMS11 sobrenadantes, aumentando cerca de tres y cinco veces, respectivamente después de la TDT (Figura 2B-C). No se detectó ninguna evidencia de p38 en el sobrenadante de MCF10A, tanto en condiciones normales como de tensión-TDT (Figura 2A). P28 se encuentra exclusivamente después del tratamiento con DTT y sólo en el sobrenadante de la línea de células SKBR3 que expresa esta variante (Figura 2B).

A. El análisis de transferencia Western de las células MCF10A tratados y tratados con TDT: células MCF10A se expusieron a DTT (2 mM) durante 3 horas y se mantienen sucesivamente durante 24 hrs en OPTIMEM. proteína secretada (50 g) se extrajo del medio de cultivo por precipitación con TCA, y alícuotas de lisados ​​celulares (50 g) se resolvieron mediante SDS-PAGE (10%) y se transfirieron con monoclonal anti-SEL1L y los anticuerpos anti-vinculina. P38 no era detectable en el medio de cultivo, tanto en presencia y en ausencia de la TDT. Además de p38, las células MCF10A mostraron una banda superior, probablemente correspondiente a un precursor inmaduro o producto después de la traducción modificada. La imagen puede no coincidir dos experimentos independientes. A1. análisis RT-PCR de células MCF10A tratados y tratados con TDT: Se extrajo ARN de las muestras descritas en el panel A y analizados por RT-PCR para la respuesta UPR. El histograma muestra la expresión relativa normalizada valora a las señales de limpieza y se expresó como la modulación veces en relación con las muestras no tratadas; análisis densitométrico se realizó mediante el programa de imágenes Scion. la activación de la UPR en el tratamiento de la TDT se indica mediante la modulación de arriba-
BIP
y
CHOP
y
XBP-1 | empalme, concomitantemente
SEL1LA
se incrementa ( barra gris). Las imágenes correspondientes se muestran en la Figura S2A. Los datos son los promedios de dos ensayos diferentes en función de los tratamientos independientes, ± SD. Se evaluó la secreción de p38 y p28 en las células SKBR3 tratadas y no tratadas-TDT: análisis de transferencia de Western de B. células SKBR3 tratados y tratados con TDT. Las células expuestas a la TDT (2 mM) durante 3 horas o no expuestos se mantuvieron durante 24 horas en OPTIMEM. proteína secretada (50 g) se extrajo del medio de cultivo por precipitación con TCA, y alícuotas de lisados ​​celulares (50 g) se resolvieron mediante SDS-PAGE (12%) y se transfirieron con anti-SEL1L y los anticuerpos anti-vinculina. estrés ER /UPR promueve fuertemente la secreción de p38 y, en menor medida, p28 en el medio de cultivo. La imagen puede no coincidir cinco experimentos independientes. El análisis de transferencia Western de las células C. KMS11 tratados con DTT y MG132: KMS11 células fueron expuestas a DTT (2 mM) o MG132 (10 mM) durante 3 horas y se mantuvo sucesivamente durante 24 hrs en OPTIMEM. proteína secretada (30 g), se extrajo del medio de cultivo por precipitación con TCA, y alícuotas de lisados ​​celulares (50 g) se resolvieron mediante SDS-PAGE (10%) y se transfirieron con anti-SEL1L y los anticuerpos anti-vinculina. Ambos tratamientos marcadamente inducidos secreción de p38 en el medio de cultivo. La imagen puede no coincidir cinco experimentos independientes. C1. análisis RT-PCR de células KMS11 tratados con DTT y MG132: Se extrajo ARN de las mismas muestras que se describen en el panel C y analizados por RT-PCR para la respuesta UPR. El histograma muestra la expresión relativa normalizada valora a las señales de limpieza y se expresó como la modulación veces en relación con las muestras no tratadas; análisis densitométrico se determinó por el programa de formación de imágenes Scion. la activación de la UPR en el tratamiento de la TDT se indica por la sobre-modulación de
ATF6
,
BIP
, y
CHOP Opiniones y por
XBP-1 | empalme ( véase la Figura S2C), concomitantemente la expresión de
SEL1LA
,
HRD1 Opiniones y se incrementa
GADD45β gratis (barra gris). Las imágenes correspondientes se muestran en la Figura S2C. MG132 tratamiento no provocó la activación de la UPR, como se indica por la ausencia de
ATF6
y
BIP
ONU-modulación y la falta de
XBP-1 | empalme (véase la Figura S2C) No obstante,
CHOP
y
GADD45β
fueron notablemente hasta modulada y
SEL1LA
y
HRD1
abajo modulada (barras negras). Los datos son promedios de cuatro ensayos diferentes en función de los tratamientos independientes, ± SD. C2. expresión de la proteína en las células SEL1LA KMS11 tratados con DTT y MG132: El histograma muestra los valores de expresión de proteínas SEL1LA obtenidos de las muestras descritas en el panel C, relativa normalizada a las señales de limpieza y se expresó como la modulación veces en relación con la muestra no tratada; análisis densitométrico se realizó mediante el programa de imágenes Scion. MG132 determinó SEL1LA acumulación de proteínas hasta 2 veces en relación con el nivel de control (barra de color negro). Los datos son los promedios de cuatro experimentos independientes, ± SD.

MG132, que determina el estrés ER a través del bloqueo ERAD por la inhibición del proteasoma [46], se puso a prueba en la línea de mieloma KMS11, se sabe que la líneas celulares de cáncer de mama son bastante resistentes a tal tratamiento [47]. Un aumento de aproximadamente cinco veces mayor de p38 en el medio KMS11 se produjo después de tres horas de exposición MG132, concomitante a un aumento significativo en
CHOP
y
GADD45β
expresión, indicativo de estrés ER activación /UPR, incluso si, en ausencia de
XBP-1 | empalme y
BIP
y
ATF6
arriba-modulación (Figura 2C-C1; Figura S2C). tratamiento MG132 también aumentó el nivel de proteína SEL1LA (Figura 2C, C2), que es consistente con la evidencia informó que SEL1LA se degrada a través de proteasoma [22].