Extracto
transcripción inversa - reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR) es una técnica estándar en la mayoría de los laboratorios. La selección de genes de referencia es esencial para la normalización de datos y la selección de genes de referencia adecuados sigue siendo crítica. Nuestro objetivo era 1) Revisar la literatura desde la implementación de las directrices MIQE con el fin de identificar el grado de aceptación; 2) comparar varios algoritmos en su estabilidad de expresión; 3) identificar un conjunto de genes de referencia adecuados y más confiables para una variedad de líneas celulares de cáncer humano. Una revisión base de datos PubMed se llevó a cabo y se seleccionaron las publicaciones desde 2009. Doce genes putativos de referencia fueron perfilados en las líneas normales y varios celulares de cáncer (n = 25) usando 2-etapa de RT-qPCR. referencia genes investigados fueron clasificados de acuerdo a su estabilidad de la expresión por cinco algoritmos (geNorm, NormFinder, BestKeeper, Ct comparativa y RefFinder). Nuestra revisión reveló 37 publicaciones, con dos tercios muestras de pacientes y uno líneas celulares terceros. eficiencia qPCR se da en el 68,4% de todas las publicaciones, pero sólo el 28,9% de todos los estudios proporcionan cantidad de ARN /ADNc y las curvas de calibración. GeNorm y NormFinder algoritmos se utilizaron en 60,5% en combinación. En nuestra selección de líneas celulares de cáncer de 25, se identificaron
HSPCB
,
RRN18S
, y
RPS13
como los genes de referencia expresada más estable. En el subgrupo de líneas celulares de cáncer de ovario, los genes de referencia fueron
ppia
,
RPS13
y
SDHA
, lo que demuestra claramente la necesidad de seleccionar los genes en función del enfoque de la investigación. Por otra parte, un grupo de al menos tres genes de referencia adecuados es necesario establecer de antemano a los experimentos, de acuerdo con las directrices. Para el establecimiento de un conjunto de genes de referencia para la normalización de genes se recomienda el uso de idealmente tres genes de referencia seleccionados por al menos tres algoritmos de estabilidad. La desafortunada falta de cumplimiento de las directrices MIQE refleja que estos deben ser establecido además en la comunidad de investigación
Visto:. Jacob M, R Guertler, Naim S, S Nixdorf, Fedier A, Hacker NF, y col . (2013) La selección cuidadosa de los genes de referencia es requerida para el funcionamiento confiable de la RT-qPCR en humanos normales y líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 8 (3): e59180. doi: 10.1371 /journal.pone.0059180
Editor: Sui Huang, Instituto de Biología de Sistemas, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Noviembre 2012; Aceptado: 12 de febrero de 2013; Publicado: 15 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Jacob et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Suiza (PBZHP3-133289 y -138,752 a FJ; 320.030 a 120.543 al VHS.); Instituto de Cáncer de Nueva Gales del Sur (09 /CRF /2-02 de VHS); Real de Australia y Nueva Zelanda Colegio de Obstetras y Ginecólogos (VHS); William Maxwell Trust (VHS) y el Royal Hospital for Women Foundation (VHS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Transcripción inversa (RT) - cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) se ha convertido en una técnica versátil para examinar los cambios de expresión de uno o más genes de interés en varios estados patológicos. Debido a su especificidad, sensibilidad, sencillez, coste y alto rendimiento, RT-qPCR ofrece una amplia gama de ventajas sobre los métodos estándar, tales como transferencia de Northern y PCR semicuantitativa. Por lo tanto, se ha convertido en la herramienta más emergente para la cuantificación absoluta y relativa de los niveles de ARNm de transcripción [1]. RT-qPCR es un ensayo robusto que utiliza el análisis de la química y de datos bien establecida y es por lo tanto superior a las técnicas como el sur de secuenciación blotting o ADN [2]. A pesar de su amplia aceptación, hay inconsistencias en el uso de los métodos de extracción de ARN total, la cantidad de ARN por reacción [3], evaluaciones de integridad del RNA [4], qPCR mezclas de reacción y en los diversos fabricantes de los kits de transcripción inversa. Además, el uso de métodos diferentes de detección de qPCR, como los sistemas basados en sondas de tinte o amplía el espectro de aplicaciones potenciales. Con el fin de superar las dificultades potenciales y lograr consenso en el rendimiento y análisis de experimentos de PCR cuantitativa, la MIQE (Información mínima para Publicación de experimentos cuantitativa en tiempo real PCR) directrices se introdujeron en 2009, mejorando el diseño experimental [5]. Además, la aplicación de estas directrices dará resultados mejores y reproducibles mediante la presentación de informes parámetros tales como la integridad del ARN, el volumen de reacción, la concentración de ADNc /ARN, o curvas de calibración [6].
se consigue generalmente Objetivo normalización de genes utilizando genes de referencia para compensar intra e inter-cinética RT-qPCR [7]. Varios enfoques matemáticos han sido publicados que ofrecen los genes de referencia adecuados con la variación más baja y con una alta estabilidad en las muestras biológicas. Los cuatro enfoques utilizados más comúnmente son: (1) algoritmo NormFinder [8], que es un modelo estadístico que estima la variación global de la expresión génica de cada gen candidato de referencia y entrega un valor de estabilidad. Este valor está relacionado con el error sistemático de cada gen candidato. (2) GeNorm [9] calcula una medida de la estabilidad de genes para cada gen candidato. El gen de referencia con la estabilidad más baja (M) se elimina de análisis, y los valores de M se calculan varias veces hasta que dejó el gen de referencia más estable. (3) BestKeeper, un Microsoft
® herramienta basada en Excel, utiliza por pares correlaciones [10]; y (4) el delta comparativa Ct (basado en las directrices de nomenclatura y MIQE: el ciclo de cuantificación (Cq) se prefiere el ciclo umbral (Ct), tanto que describe el ciclo de PCR fraccional utilizados en la cuantificación) método clasifica a la estabilidad de los genes candidatos de acuerdo con la repetibilidad de genes diferencias de expresión [11]. Ninguno de los algoritmos introducidos parece ser óptimo y el investigador siempre tiene que elegir qué gen de referencia a utilizar y cómo identificar. Esto también puede afectar a la interpretación de los resultados de RT-qPCR.
Numerosos genes putativos de referencia se ha informado de una amplia variedad de tejidos humanos, para las líneas celulares humanas, y para cultivos de células en diferentes condiciones experimentales, tales como los tratamientos con fármacos o factores ambientales. Sin embargo, no hay genes de referencia adecuados para el análisis de las líneas celulares de cáncer humanas se originaron a partir de los cánceres ginecológicos y los cánceres de colon aún no han sido descritos.
El objetivo principal de este estudio fue identificar los genes más estable de referencia adecuados para el estudio de las líneas normales y células de cáncer de ovario o de colon origen por un perfil de un conjunto de 12 genes putativos de referencia y por primera vez la aplicación de cinco algoritmos de estabilidad para estimar la influencia del análisis de datos bioinformatical. También estábamos interesados en ver cómo los diferentes fabricantes de kits de la transcriptasa inversa influyen en la variación de la expresión de genes de referencia. Además, una revisión de la literatura actual se llevó a cabo con el fin de evaluar el cumplimiento de las directrices MIQE en el desempeño de RT-qPCR informado desde su introducción.
Materiales y Métodos
Revisión de la literatura se llevó a cabo
Un PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) revisar la base de datos sobre el uso de los genes putativos de referencia en la RT-qPCR. Publicaciones disponibles entre enero de 2009 y abril de 2012 fueron consideradas e identificadas utilizando las palabras clave: "genes de referencia" o "genes de la casa 'y' RT-qPCR 'O' de PCR cuantitativa". las listas de referencias de las publicaciones seleccionadas también fueron considerados para la inclusión de los artículos potencialmente relevantes. Publicaciones no está escrito en Inglés y los que se informa RT-qPCR realizaron en menos de cinco genes de referencia fueron excluidos. Sólo se incluyeron publicaciones con muestras humanas. Publicaciones fueron evaluados de acuerdo con el año de publicación, el tipo y la cantidad de muestras, el número de genes de referencia, los métodos utilizados para determinar la integridad del ARN, la cantidad de ARN total inicialmente utilizado para RT y /o qPCR, el número de repeticiones en qPCR, los detalles de diluciones seriadas de la curva de calibración y la eficiencia, la química utilizada qPCR (SYBRgreen o TaqMan), y los métodos matemáticos (algoritmos informáticos) para la medición del gen de referencia estabilidad de la expresión.
Cell Culture
En este estudio se utilizaron 2 líneas normales y 23 celulares de cáncer de diversos orígenes. Las líneas celulares se obtuvieron a partir de ATCC (www.atcc.org) o eran un regalo del Instituto Garvan de Investigación Médica, Sydney, Australia. se otorgó el consentimiento informado por escrito ética (HREC 08/09/17 /3,02, al VHS.). Un listado detallado de las líneas de células y las condiciones de cultivo se dan como datos complementarios (Tabla S1). Todos los cultivos celulares se mantuvieron a 37 ° C en 5% de CO
2. Los cultivos estaban libres de micoplasma, según lo determinado por PCR cualitativa utilizando VenorGeM
® Kit de Detección de Mycoplasma (Biocene Pty Ltd, Rozelle, Australia).
La extracción de RNA y la Integridad
Para examinar la expresión de los 12 genes de referencia putativos en cada una de estas líneas celulares, 1 × 10
5 células se cultivaron en placas de 6 pocillos (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) a una confluencia del 70-90%. Las células fueron lavadas dos veces con solución salina estéril y el ARN total se extrajo usando el kit NucleoSpin ARNII (MACHEREY & amp; NAGEL, Scientifix Pty Ltd, Clayton, Australia). Para estas células se lisaron mediante la adición de tampón de lisis directamente sobre las células. La extracción de RNA incluyendo tratamiento con DNasa se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante. ARN se eluyó en 60 l de RNasa libre de agua y la concentración de ARN se mide utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca). La integridad de las muestras de ARN se confirmó por electroforesis en gel de agarosa en gel de agarosa al 1,0% que contiene GelRed ™ (Biotium, Inc., Hayward, CA, EE.UU.). Las muestras de ARN sin indicación de degradación se evaluaron adicionalmente en un chip Nano RNA 6000 utilizando el Agilent 2100 Bioanalyzer electroforesis (El Centro Ramaciotti para Gene Análisis Funcional, Universidad de Nueva Gales del Sur, Sydney, NSW, Australia).
Reverse la transcripción de ARNm
RTasa, basados en MMLV ARN total (1 g) fue transcrito de forma inversa con el iScript transcripción inversa Supermix para RT-qPCR (# 170-8840, RNasa H
+, Bio-Rad Laboratories (Pacífico) Pty Ltd, Gladesville, Australia) en un volumen total de 20 l de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El Supermix contenía tanto oligo dT y cebadores aleatorios para obtener un número máximo de transcripciones de ADNc. La mezcla de reacción se incubó a 25 ° C durante 5 min para el cebado, y luego a 42 ° C durante 30 min para la transcripción inversa, y finalmente a 85 ° C durante 5 min para la inactivación de la transcriptasa inversa. El ADN complementario (ADNc) se almacenó a -20 ° C hasta su uso posterior.
Además de BioRad, se incluyeron dos otros productos manufacturados (Takara y Bioline) para investigar su influencia en el rendimiento de la transcripción inversa. Estamos a transcripción inversa ARN total (1 mg) por seis transcripciones inversas (Takara y Bioline) de la siguiente manera: La mezcla de reacción se preparó usando BluePrint ™ 1
st kit de síntesis de cDNA (# 6115A, RTasa a base de MMLV, RNasa H
+, Takara Bio Inc., Scientifix Pty Ltd, Clayton, Australia) en un volumen total de 20 l que contenía 6 aleatorios mers, oligo dT o ambos en la misma molaridad. Un volumen final de 10 l que contenía el cebador, mezcla de dNTP y el ARN total se incubó a 65 ° C durante 5 min e inmediatamente se enfrió. A continuación, 5 × BluePrint
TM 1
buffer de cadena st, inhibidor de RNasa recombinante y BluePrint
TM RTasa se añadió a un volumen final de 20 l. transcripción inversa final se incubó a 30 ° C durante 10 min, luego a 42 ° C durante 60 min seguido de la inactivación a 95 ° C durante 5 min. La transcripción inversa utilizando el kit de síntesis Tetro cDNA de Bioline (# BIO-65042, RTase a base de MMLV, RNasa H
+, Bioline (Aust) Pty Ltd, Alexandria, Australia) se realizó como sigue: un volumen final de 10 l que contenía el cebador ( aleatorios 6 mers o oligo dT o ambos en la misma molaridad), mezcla de dNTP y el ARN se incubó a 70 ° C durante 5 min, seguido de la adición de 5 x tampón de RT y Ribosafe RNasa inhibidor de hasta 20 l. mezcla de reacción final se incubó a 45 ° C durante 30 min y se terminó en 85 ° C durante 5 min.
polimerasa cuantitativa Chain Reaction (qPCR)
PCR cuantitativa se realizó en 12 genes de referencia putativo . Sus características, incluyendo nombre, número de acceso, localización cromosómica, la longitud del producto, y el respectivo adelante y atrás primers se resumen en la Tabla 1. Los genes de referencia y secuencias de cebadores (adquirido de Sigma-Aldrich Pty. Ltd, Castle Hill, Australia) fueron seleccionados sobre la base de las bases de datos anteriores y en publicaciones de informes de los perfiles de expresión génica estable [8], [9], [12] - [15]. Primer secuencias también se cotejaron con el útil basada en la web
In silico-PCR
(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) en el navegador del genoma humano en la UCSC [16] en contra de genes genómicos y objetivos.
la expresión de los genes más estables se determinó en líneas celulares humanas de epitelio normal de la superficie del ovario (n = 2) y de origen canceroso, incluyendo ovario (n = 9 ), colon (n = 9), de mama (n = 1), cervical (n = 1), cáncer de útero (n = 1), y la leucemia (n = 2).
qPCR se realizó en el Stratagene Mx3005
® (Ciencias integradas Pty. Ltd, Chatswood, Australia) en placas de microtitulación de 96 pocillos (Bio-Rad Laboratories (Pacífico) Pty Ltd, Gladesville, Australia). condiciones de reacción óptimas se obtuvieron con 1 × SsoFast ™ EvaGreen
® Supermix con baja ROX como el colorante de referencia (Bio-Rad Laboratories (Pacífico) Pty Ltd, Gladesville, Australia), 400 nM de cebador sentido específico, 400 nM cebador antisentido específico, agua /DNasa libre de RNasa, y la plantilla de cDNA (previamente aislados y transcripción inversa del ARN de 1 ng /pocillo) hasta un volumen final de 10 l. Las amplificaciones se llevaron a cabo a partir de una activación de la enzima 30 seg a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 5 segundos, y después de recocido /extensión a 60 ° C durante 30 seg. Al final de cada ejecutar un análisis de curva de fusión se llevó a cabo 65 a 95 ° C. Todas las muestras y los controles negativos se amplificaron por triplicado, y a continuación, se utilizó el valor medio obtenido para su posterior análisis. Ciclo de valores de cuantificación (CQ) de & gt; 35 fueron excluidos de los nuevos cálculos matemáticos. Un "ninguna muestra de plantilla" (ARN de transcripción inversa y sin transcriptasa inversa) y una muestra sin ARN o ADNc fueron los controles negativos.
PCR Eficiencia (E)
La comparabilidad se garantizó mediante la investigación de la qPCR la eficiencia en todos los genes de referencia en un extracto de ARN línea celular seleccionada al azar. Para comparar los niveles de ARN de transcripción de los 12 genes putativos de referencia, los valores Cq fueron generados directamente en un umbral específico. El Cq se define como el número de ciclos necesarios para la señal de fluorescencia para llegar a un umbral específico de detección y, por tanto, está inversamente correlacionada con la cantidad de entrada de RNA total [17]. Para comparar las diferentes carreras qPCR realizadas en días diferentes, platos y carreras se ajustaron al umbral de 0,1 Cq. cDNA a transcripción inversa se diluyó a partir de 100 ng a 1 pg de ARN de entrada antes de RT en diluciones de 10 veces para cada gen de referencia por triplicado. señales de fluorescencia obtenido para la concentración de ARN definida se representaron gráficamente y se realizó la regresión lineal para identificar la mejor relación lineal que representa la curva estándar. Se aplicó la pendiente de la ecuación lineal para calcular la eficiencia de acuerdo con la ecuación E = (10
[- 1 /pendiente] -1). × 100
Análisis de Datos
Raw los datos incluyendo las curvas de fusión y de amplificación obtenidos por MxPro- Mx3000P v4.10 (Ciencias integradas Pty. Ltd, Chatswood, Australia) se extrajeron de Microsoft
® archivos de Excel (.xls), salvado como Microsoft
® archivos del editor (.txt), y después se carga para su posterior análisis de datos en la fuente abierta lenguaje de programación estadística R (http://CRAN.R-project.org/, versión 2.13.2). Para continuar con el modelado y análisis de los datos de RT-qPCR, se utilizó el paquete R "qPCR" (http://cran.r-project.org/web/packages/qpcR/index.html). La correlación de Pearson (r) se calculó para determinar la asociación entre los algoritmos aplicados.
Para comparar diferentes algoritmos para la selección de los genes más estable de referencia, se aplicó RefFinder (http://www.leonxie.com/referencegene.php), una completa herramienta basada en la web. Utiliza la algoritmos geNorm disponibles en la actualidad [9], NormFinder [8], BestKeeper [10] y los métodos? Ct comparativos [11], y asigna un peso adecuado a un gen individual y calcula la media geométrica para el ordenamiento general de todos los genes de referencia.
resultados
el cumplimiento de las directrices MIQE para el Establecimiento de genes de referencia
Desde su introducción en 2009 [5], la comunidad científica está aceptando de forma continua las directrices para las publicaciones y MIQE consideración de manuscritos científicos utilizando RT-qPCR. Para estudiar la aceptación de MIQE con más detalle, se realizó una revisión bibliográfica de las publicaciones que proponen un conjunto de genes de referencia putativos (N≥5) en muestras humanas para RT-qPCR. Se identificaron 37 publicaciones de Enero 2009 a Abril de 2012, el número de los cuales aumentó continuamente cada año (Figura 1A). La mayor parte de estos estudios investigaron muestras de los pacientes (63,2%), seguido de líneas celulares primarias e inmortales (31,6%). Una parte menor (5,3%) examinaron muestras de tejido y líneas celulares juntos. La integridad del RNA fue en la mayoría de los casos (68,4%) investigados con dos métodos independientes, tales como espectrofotometría (90,9%) y el número de la integridad RIN (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, EE.UU.). La cantidad de ARN total para la transcripción inversa o de ADNc para las reacciones de qPCR se informó en 78,9% de todas las publicaciones. SYBR
® Verde (57,9%), un colorante de unión a ADN de doble cadena fluorescente, se utiliza con más frecuencia de lo TaqMan (26,3%), una sonda específica de la diana marcada con fluorescencia. La eficiencia qPCR para todos los genes de referencia investigados se proporciona en el 68,4% de todas las publicaciones, pero sólo el 28,9% proporcionó detalles tales como la cantidad de ADNc y el intervalo de dilución de las curvas de calibración. Por último, se determinó cuál de los algoritmos conocidos (geNorm, NormFinder, BestKeeper, Ct comparativa) se aplicaron para identificar los genes expresados de referencia más estable. GeNorm y NormFinder algoritmos juntos se utilizaron en la mayoría de los estudios seguidos por geNorm solo y geNorm, NormFinder, y BestKeeper juntos (Figura 1B). Teniendo en cuenta que sólo se incluyeron publicaciones que realizan RT-qPCR para la identificación de genes de referencia, expresado de forma estable, estos datos demuestran que la información esencial, tal como la integridad del ARN, la cantidad de RNA total en la reacción, la eficiencia qPCR, y la cantidad de ADNc no se encuentra en una fracción sustancial de estas publicaciones.
(A). Gráfico de líneas de todas las publicaciones (n = 37) que investigaron los genes expresados de referencia más estable. (B) Porcentaje de algoritmos utilizados para identificar genes de referencia fiables entre todas las publicaciones.
calidad y la integridad de las muestras de ARN
El ARN total extraído de nuestro conjunto de líneas celulares se evaluó por la calidad e integridad. Una lista detallada de las líneas celulares y la información respectiva en la cantidad de ARN, la calidad y la integridad (razón de absorbancia 260/230 nm y 260/280 nm, número de la integridad del ARN RIN, y 28 Cociente de S /18 s) se presentan como datos complementarios ( S2 Tabla). Se encontró que las razones comprendidas, en promedio (media ± desviación estándar) durante las 25 líneas celulares, fueron 1,97 ± 0,23 (260/230 nm) y 2,11 ± 0,04 (260/280 nm). Estamos, además, que el RIN varió de 8.4 a 10, lo que indica una calidad suficiente de ARN total. El algoritmo RIN asigna una puntuación número RIN 1-10, donde un valor de 10 representa el ARN intacto y un valor de 1 representa RNA degradado. Además, la calidad de ARN total fue confirmado también por la relación de 28 s /18 s de ARN ribosomal, que varió desde 1,7 hasta 2,7
.
La posible presencia de contaminación de ADN (Figura S1) en cada experimento fue qPCR investigado por gráficas de amplificación, curvas de fusión, y electroforesis en gel de agarosa al 1%. La transcripción inversa reacciones de control negativo confirmaron la ausencia de contaminación de ADN. Sin embargo, hubo amplificaciones de PCR en los controles negativos de
ppia
,
GUSB
,
RPII
y
TBP
en una o dos repeticiones con valores Cq & gt; 35. Estos valores fueron sustancialmente mayores que los de las muestras que contienen plantilla de 1 ng de cDNA, lo que indica una amplificación insignificante de contaminación de ADN. No se detectaron amplificaciones de PCR en los controles negativos para los otros genes de referencia. Estos resultados indican que nuestras muestras de ARN total fueron de calidad suficiente y en gran parte libre de la contaminación de ADN.
Eficiencia qPCR, intra e inter-ensayo variabilidad
La eficiencia RT-qPCR de cada conjunto de cebadores se determinó mediante diluciones seriadas de molde de ADNc de la línea celular de epitelio de superficie de ovario humano HOSE17-1 (Tabla 2). Se utilizó ARN de una línea celular seleccionada de forma aleatoria en lugar de plásmidos porque RNA puede causar potencial variación no despreciable en la transcripción inversa [18], [19]. Sobre la base de los valores medios obtenidos Cq para todas las diluciones en una serie de dilución logarítmica de cDNA, se generó una curva estándar. La pendiente, intercepción, la eficiencia de amplificación PCR cuantitativa y coeficientes de correlación (R
2) de cada par de cebadores se calcularon a partir de la curva estándar (Figura S2). El rango de dilución inicial de 100 ng a 1 pg de ARN de entrada antes de la RT se adaptó a raíz de los amplificados no detectables en el rango inferior o la saturación de las reacciones de qPCR en cantidades mayores de ADNc, tanto la eficiencia influir en
RRN18S
,
RPII
y
B4GALT6 gratis (Tabla 2).
GUSB
mostró un intervalo de dilución lineal óptima de 10 pg a 10 ng. eficiencia de la PCR de genes de referencia estudiados varió de 87,1% a 106,6%, pendiente de -3,680 -3,157 a, intercepción de 11.10 a 27.30 y R
2 a partir de 0,994 a 0,999.
Para garantizar una el nivel de transcripción de ARN estable, la influencia de la variabilidad técnica, la variación intra e inter-ensayo fueron investigados utilizando el seleccionado de forma aleatoria
HSPCB
el ARN de las células SKOV3. variación inter-ensayo se determinó mediante la realización de RT-qPCR con muestras idénticas de cinco días diferentes, revelando un coeficiente de variación (CV) de 1,74%. La variación intra-ensayo fue de menos de CV 0,3% usando una cantidad de 0,5 ng y 2,0% utilizando 5 pg de RNA. Estos datos indican que la variabilidad técnica se encuentra en un rango aceptable y por lo tanto se considera como insignificante.
El uso del programa de instalación apropiada inversa de la transcriptasa
Para estudiar si el origen (fabricante) de las transcriptasas inversas influye en la calidad de la reacción, cuatro genes de referencia (
SDHA
,
HSPCB
,
GUSB
y
TBP
) fueron seleccionados al azar y se realizó qPCR después de la transcripción inversa. Para definir el rendimiento global de los cuatro genes de referencia seleccionados, las variaciones se calcularon para la los valores de CV Cq y (n = 7). La variación de Cq varió desde un mínimo de 1,14 (
TBP
) a un máximo de 2,83 (
GUSB
) (Figura 2A). La variación intra-ensayo dentro de los triplicados fue mayor en
SDHA gratis (CV = 2,51%) y menor en
GUSB gratis (CV = 0,04%) (Figura 2B). Estos datos indican que el origen de la transcriptasa inversa y diferentes configuraciones de cebador tiene sólo una influencia marginal en el rendimiento de estos cuatro genes de referencia
.
(A) Random 6 mer se utilizaron en 2 y 5, oligo dT cebador en 3 y 6, y los dos juntos en 1, 4 y 7 (abscisas); Cq en ordenada muestra las diferencias entre las condiciones de la transcriptasa inversa probadas. (B) Coeficiente de variación (CV). RT proveedores indicados con los números romanos: I) BioRad, II) Takara, y III) Bioline. El eje X con diferentes cebadores RT: oligo dT (oligo), al azar 6 meros (al azar), y ambos (dos)
Expresión Estabilidad de genes candidatos de referencia en líneas celulares humanas
con el fin de identificar los genes más estable de referencia a través de las líneas de células normales y cancerosas ensayadas, las estabilidades de expresión de los genes de referencia se examinaron mediante la realización de los cinco algoritmos (RefFinder, geNorm, BestKeeper, NormFinder, y Ct comparativa) y la clasificación de los genes de cada algoritmo individualmente. Estos rangos fueron resumidos, con la suma de rangos más bajo que representa el gen de referencia más estable expresado y el más alto rango suma que representa el gen de referencia menos estable expresado. En todas las líneas celulares estudiadas (Figura 3A) se identificaron
HSPCB
,
RRN18S
y
RPS13
como los 3 genes de referencia, expresado más estable.
B4GALT6
fue el gen de referencia menos estable. En el subgrupo de líneas celulares de cáncer de colon
HSPCB
, YWHAZ, y
RPS13
fueron los 3 genes de referencia, expresado más estable (Figura 3B). Por otra parte, en el subgrupo de líneas celulares de cáncer de ovario y normales, los genes respectivos fueron
ppia
,
RPS13
y
SDHA gratis (Figura 3C).
(A) Todas las líneas celulares investigadas (n = 25), las líneas (B) de células de cáncer de colon (n = 9), y (C) Las líneas celulares de cáncer de ovario normales y (n = 11). Los números ponen de relieve los tres primeros genes más estable de referencia en cada dispositivo experimental.
Estos resultados muestran que los genes de referencia más estable expresó varían entre los diferentes conjuntos de líneas celulares, con sólo el
RPS13
estar presente en los tres conjuntos de líneas celulares dentro de los 3 primeros genes de referencia superior. Curiosamente, el gen de referencia más utilizado
GAPDH
fue uno de los genes de referencia menos estable expresado en nuestra puesta a punto.
Además, investigó la correlación entre los cinco algoritmos aplicados que entregan los genes más estables . La correlación entre las cinco pruebas de estabilidad fue de moderada a alta entre los algoritmos aplicados. Se observó que la correlación más alta entre NormFinder y el método Ct delta comparativa (r = 0,99) (Figura 4), lo que indica que los 12 genes de referencia se clasificaron casi idéntica. La correlación más baja (r = 0,71) fue entre el Ct método delta y RefFinder, lo que indica una alta discrepancia en la clasificación.
Valor absoluto de correlación de Pearson y
p-valor
indica mediante asteriscos (0 ***, 0,01 **). Parte inferior de los gráficos de dispersión visualiza correlación bivariada entre los ensayos de estabilidad investigados, incluyendo una línea ajustada.
Discusión
1) se realiza una revisión de la literatura sobre el cumplimiento de las directrices MIQE en el desempeño de experimentos de RT-qPCR identificación de grupos de genes de referencia, 2) evaluaron el rendimiento de los algoritmos para la clasificación de los genes de referencia por su estabilidad expresión; y 3) identificado un conjunto de genes de referencia adecuados y fiables para nuestra selección de líneas celulares de cáncer humano de diferentes orígenes.
Nuestra revisión de la literatura reveló que el cumplimiento de las directrices MIQE fue sólo parcial. La información esencial [5], tales como la integridad del ARN, la cantidad de RNA total en la reacción, la cantidad de ADNc, el rango de dilución para las curvas de calibración, y la eficiencia de la qPCR con frecuencia no se encuentra en las publicaciones, que no está en conformidad con las directrices MIQE . Lo más cerca posible el cumplimiento con las directrices para la realización de RT-qPCR, así como a transmitir esa información en las publicaciones contribuye a la mejora del diseño del estudio experimental y asegura la reproducibilidad y fiabilidad de los resultados del estudio. De lo contrario, diferencias mínimas detectado en la expresión génica dirigida pueden ser el resultado potencial de las variaciones en la expresión de genes de referencia.
Hemos demostrado que las transcriptasas proporcionadas por diferentes fabricantes dar lugar a variaciones en los ciclos de cuantificación (Cq hasta 3) inversa. Por lo tanto, puede ser útil considerar diferentes RTs y para probar diferentes conjuntos de cebadores, oligo dT o al azar 6 mers o ambos en combinación antes de los experimentos empresa. Nuestros resultados también están en concordancia con estudios anteriores donde los rendimientos de transcripción variaron hasta 100 veces entre diferentes transcriptasas inversas en una forma dependiente gene- [20], [21]. Nos encontramos en la literatura y se confirmó en nuestro estudio que diferentes estrategias de cebado RT son cruciales para la medición cuantitativa de la expresión de genes [21]. Por otra parte, hemos observado en nuestros propios experimentos que no RT es superior a otras RTs y, por tanto, no se pudieron establecer conclusiones para la elección de RT cebado; es decir, no puede tomar la decisión en la que el cebador es mejor que el otro.
El uso de algoritmos estadísticos para medidas de estabilidad se examinó críticamente porque todos estos algoritmos se basan en el supuesto de que ninguno de los genes de referencia estudiados mostrar variación sistemática en el perfil de expresión a través de las muestras [22]. Además, nuestra revisión de la literatura mostró que en la mayoría de los estudios se han aplicado sólo uno o dos algoritmos. Nuestro estudio reveló una considerable variación en la correlación entre los algoritmos aplicados. Por otra parte, a pesar de la relativamente alta correlación (r = 0,9) entre la geNorm y los algoritmos NormFinder, la aplicación de estos dos algoritmos entregado clasificación idéntica en sólo 5 de los 12 genes de referencia investigados. Esto presenta una deficiencia que puede conducir a la falsa selección de genes de referencia, que pueden tener un impacto negativo en la calidad y fiabilidad de los datos. Por lo tanto, se recomienda que más de dos algoritmos deben ser aplicados para la selección de los genes de referencia.
Hemos utilizado previamente demostrada y publicada pares de cebadores para la detección de los niveles de transcripción de los genes putativos de referencia en una piscina de la normalidad y el cáncer líneas celulares. En general, casi todos los genes de referencia realizaron de una manera adecuada y podrían utilizarse para futuros estudios que utilizan líneas celulares. Además, sobre la base de los resultados sobre la variabilidad intra e inter-ensayo todos los genes de referencia investigados pueden ser utilizados para investigaciones posteriores. Sin embargo, entre probaron todas las líneas celulares, se encontró que
HSPCB
,
RRN18S
, y
RPS13 ¿Cuáles son los genes expresados más estable de lo que sugiere su idoneidad como genes de referencia para futuros estudios dentro de este montaje experimental. Las investigaciones sobre colon y normal, así como líneas celulares de cáncer de ovario revelaron discrepancias esperadas entre los genes de referencia seleccionados y por lo tanto deben ser considerados en futuros estudios. Se demuestra que los genes de referencia tienen que ser seleccionados cuidadosamente para cada dispositivo experimental.