Extracto
Las células tumorales iniciadoras son una subpoblación de cánceres agresivos que presentan rasgos compartidos con células madre, incluyendo la capacidad de auto-renovarse y diferenciarse, comúnmente referidos como stemness. Además, tales células son resistentes a la quimioterapia y la terapia de radiación que presenta un reto terapéutico. Para descubrir las funciones stemness-asociado en las células de glioma iniciadoras (GIC), perfiles de transcriptoma se compararon con células madre neurales (NSC) y el análisis de genes ontología identificaron un enriquecimiento de Ca
2 + genes de señalización en las células madre neurales y el más parecido a frenar (NSC-proximal) GICs. Análisis funcional de un conjunto de diferentes líneas GIC respecto a la sensibilidad a la homeostasis alterada usando A23187 y tapsigargina, reveló que los CIV NSC-proximales eran más sensibles, lo que corrobora los datos del transcriptoma. Por otra parte, Ca
2 + sensibilidad a los fármacos se redujo en los CIV después de la diferenciación, con mayor efecto potente en el GIC NSC-proximal, el apoyo a un Ca stemness asociada
2 + sensibilidad. NSC y la línea GIC NSC-proximal expresan un mayor número de canales iónicos permeables al potasio, sodio y Ca
2 +. Por el contrario, un mayor número de y más altos niveles de expresión de Ca
2 + genes de unión que pueden amortiguar Ca
2 +, se expresaron en GICs NSC-distal. En particular, la expresión de la AMPA glutamato GRIA1 subunidad del receptor, se encontró que asociar con Ca
2 + GICs NSC-proximales sensibles, y disminuyó a medida que GICs diferenciadas junto con reducida Ca
2 + sensibilidad a los fármacos. La correlación entre la alta expresión de Ca
2 + canales (como los GRIA1) y la sensibilidad a Ca
2 + medicamentos se confirmó en un nueve novedosas líneas adicionales GIC. sensibilidad a los fármacos de calcio también se correlacionó con la expresión de los marcadores nestin NSC (NES) y FABP7 (BLBP, proteína de unión de lípidos del cerebro) en este análisis extendida. NES En resumen, asociada a la NSC
+ /FABP7
+ /GRIA1
+ GICs fueron selectivamente sensibles a las perturbaciones en Ca
2 + homeostasis, proporcionando un mecanismo objetivo potencial para la erradicación de una población de inmaduros células malignas
Visto: Wee. S, M Niklasson, Marinescu VD, Segerman A, L Schmidt, Hermansson A, et al. (2014) La sensibilidad selectiva de calcio en las células madre inmaduras cáncer glioma. PLoS ONE 9 (12): e115698. doi: 10.1371 /journal.pone.0115698
Editor: Alfredo Quiñones-Hinojosa, la Universidad Johns Hopkins, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Julio, 2014; Aceptado: November 26, 2014; Publicado: December 22, 2014
Derechos de Autor © 2014 Wee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel y archivos de información de apoyo
Financiación:. Sueca del Cáncer Infantil fundación PR2013-0084 (www.barncancerfonden.se), Fundación de Cáncer de Suecia CAN 2011/783 (www.cancerfonden.se), Consejo Sueco de Investigación 2011-4567 (vr.se), Instituto Karolinska (www.ki.se), centro de Linnaeus en Biología del Desarrollo de Medicina Regenerativa (www.dbrm.se). SW fue financiado en parte por el programa de becas de doctorado del Instituto Karolinska. MN fue financiada por una beca postdoctoral de la Fundación de Cáncer de Suecia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el glioblastoma multiforme (GBM) es una forma altamente maligno de cáncer cerebral con un mal pronóstico para los individuos afectados. A pesar de la combinación de cirugía, quimioterapia y radioterapia, más de 90% de los pacientes muestran recurrencia [1], y la mediana de supervivencia se mantiene tan bajo como 14-16 meses [2]. Aunque los tumores de glioma maligno son altamente heterogénea, una subpoblación de células inmaduras, denominado glioma iniciar células (GIC) [2] - [6] coexisten con las poblaciones de células más diferenciadas. Los CIV han demostrado ser resistentes a radio y quimioterapia, y se cree que son responsables de la recaída del tumor [7]. Reflejando la inmadurez del GIC y su capacidad de diferenciarse [8], estas células se ha demostrado que compartir una célula madre (stemness) la expresión de genes -asociado con poblaciones de células madre, tales como células madre embrionarias normales de formación de teratoma-[9] - [ ,,,0],11], y se propone que los CIV vuelvan a suministrar de forma continua las células tumorales a granel a través de auto-renovación y diferenciación [11], [12]. Gran parte de la investigación para el desarrollo de medicamentos para el tratamiento de GBM se ha centrado en atacar a las células a granel, la mayoría de los cuales carecen de capacidad iniciadoras del tumor. Un reto importante que queda está aumentando la eficacia del tratamiento del cáncer de orientación GICs ya que estas células presentan resistencia a la quimio y radioterapia usando estrategias actuales.
Aunque varias vías de señalización tales como Notch, Hedgehog-Gli, RTK-Akt, BMP /TGF-β, WNT-β-catenina y STAT3 se han demostrado para apoyar la auto-renovación de las células madre y las células cancerosas inmaduras [13], potenciales dianas terapéuticas que puedan erradicar de forma selectiva los GIC son pocos [14]. Una estrategia alternativa para hacer GICs menos agresivos se demostró por la terapia de diferenciación inducida BMP [8]. También antagonistas de los receptores D2 de la dopamina se han identificado para impulsar la diferenciación de las células leucémicas y de tumores de mama iniciar relativamente diferenciación resistente [15].
Los canales iónicos mucho tiempo se ha asignado el papel de gobernar procesos celulares básicos, además de excitabilidad eléctrica y, por ejemplo potasio y Ca
2 + canal de señalización de control de diversas funciones como la proliferación y la migración en las células madre y líneas de células de cáncer [16], [17]. Ca
2 + también se ha implicado en la supervivencia de células de cáncer [18]. Recientemente, también se demostró que la interferencia con un Ca
2 + subunidad del canal fue capaz de conducir las células iniciadoras de tumores hepáticos en la apoptosis [19].
En este estudio, nos propusimos investigar los mecanismos únicos para las funciones stemness asociada en células de glioma y la conclusión de que las células madre similares son más sensibles a Ca
2 + perturbaciones en comparación con los tipos de células más maduras.
Materiales y Métodos
cultivo celular
GliNS1, G179NS y G166NS GIC líneas se hicieron crecer en cultivo como se describe anteriormente [6], [11]. Brevemente, las células se cultivaron primero como esferas en la primera semana antes de la transferencia a los platos recubiertas con laminina, en las que se cultivaron como monocapas adherentes en Neurocult NS-A media basal humano libre de suero (StemCell Technologies) suplementado con Glutamax, Hepes, N2 , B27 (Invitrogen), EGF (10 ng /ml) y bFGF (10 ng /ml) (R & amp; D Systems). GIC se hicieron crecer hasta la subconfluencia, disociarse utilizando TrypLExpress (Invitrogen), y luego se separaron 01:02-01:04. 2/3 de medio se reemplazó con medio fresco cada 3-4 días. Para la diferenciación, las células se cultivaron en medio DMEM /F12 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS; Gibco, Life Technologies)) durante dos semanas
celular de glioblastoma maligno iniciar humano (GIC) culturas Novel (U3NNN-MG serie de líneas GIC) utilizados en este estudio son parte de la colección de la Universidad de Uppsala de glioma humano de cultivos celulares (HGCC), que comprende las culturas bien caracterizado derivados de GBM cáncer iniciar celulares (Xie et al 2014, manuscrito en preparación). Este trabajo fue aprobado por el comité de revisión ética de Uppsala (2007/353). Se utilizaron todas las líneas GIC entre los pasajes 15 y 30.
ensayos de células
líneas
GliNS1, G179NS y G166NS GIC, tanto indiferenciadas y diferenciadas, se sembraron en el día 1 a una densidad de 20% en laminina recubierto 96 o 384 pocillos negro, microplacas de fondo plano (Corning). Los compuestos se añadieron a las placas en día 2, seguido de incubación durante 48 horas. FBS células diferenciadas recibido medio libre de suero (50% Neurocult NS-A media basal humano, 50% de medio Neurobasal (Gibco, Life Technologies), suplementado con Glutamax, Hepes, B27, ¼ N2, no hay factores de crecimiento) durante el tratamiento compuesto químico. DMSO se utilizó como control negativo. ensayo de viabilidad se realizó utilizando el ensayo de CellTiterGlo (Promega, Madison, WI) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se añadió tampón de reacción de ensayo a los pocillos usando un multipipeta automatizado, seguido de agitación la microplaca durante 30 segundos y 7 minutos de incubación en la oscuridad. a continuación, la lectura de intensidad de la luciferasa fue tomada usando Victor2 (Perkin Elmer) con un valor de 1 s de lectura de luminiscencia por pocillo. Z-factor se calculó para cada experimento. Por cada línea celular (GliNS1, G179NS, G166NS y hf5205NS), se analizaron al menos 3 repeticiones. Los cálculos estadísticos se realizaron con GraphPadPrism (GraphPad Software, Inc. de San Diego, CA, EE.UU.). Los datos de dosis-respuesta fueron procesados mediante interpolación lineal logarítmica para obtener log IC
50 valores.
ensayos de drogas en nuevas líneas GIC (serie U3NNN-MG) se sembraron en microplacas de 384 pocillos (BD Falcon Optilux Cat.#353962) 24 horas antes del tratamiento utilizando un dispensador de líquido Multidrop 384 (ThermoScientific, Suecia). Para asegurar la fase de crecimiento en el extremo del ensayo de células (~ 70% de confluencia) se sembraron a una densidad que varía entre 2000-4000 células /pocillo. Los fármacos se transfieren por medio de la no-contacto dispensador de líquido ECHO550 (Labcyte, EE.UU.) a una placa de polipropileno de fondo en V 384. Los fármacos se diluyeron en medio y se transfieren por medio de la cabeza MDT 384 en una estación de trabajo automatizado Janus (PerkinElmer, EE.UU.) a las placas de células. Las drogas fueron probados en 11 puntos dosis serie de dilución y se analizó la viabilidad después de 72 horas de tratamiento en un lector de EnVision Multilabel (PerkinElmer, EE.UU.) utilizando resazurina (R7017, Sigma-Aldrich, Estocolmo, Suecia), en la excitación /emisión de longitud de onda 560 /590 nm [20]. Como control positivo, el fármaco doxorubicina se rastreó con el mismo ajuste de la curva dosis-respuesta, y los pozos que contienen los controles negativos DMSO a 4 concentraciones diferentes se ensayaron también. El efecto sobre la viabilidad de cada dosis de fármaco se calculó como una proporción de viabilidad W = Ytreated /Ycontrol, donde Y representa la media de la señal de fluorescencia.
extracción de RNA, transcriptoma y análisis de datos
Dos repeticiones eran analizadas para las líneas de células indiferenciadas y diferenciadas GliNS1, G166NS y G179NS, mientras que tres repeticiones fueron analizados para DMSO, A23187 y tapsigargina tratados GliNS1 y G166NS. El ARN total se extrajo de las células cultivadas a subconfluency usando el kit RNeasy Mini (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. cuantificación fluorométrica de la concentración de ARN y la calidad se realizó utilizando el kit de ensayo de ARN Qubit (Invitrogen). Se utilizó 300 ng de ARN total en la preparación de la biblioteca TruSeq, para lo cual se utilizó el protocolo del kit de preparación de la muestra Illumina Low-Throughput TruSeq ARN resultante en ADNc de código de barras. 50 ng de productos TruSeq con código de barras se utiliza para RNA Illumina secuenciación. Las muestras fueron secuenciados en un secuenciador de Illumina HiSeq 2000 como single-end 51-nucleótido se lee de acuerdo con el protocolo de manufacturas. Raw lecturas fueron asignadas a la referencia del genoma humano y de datos normalizado se generó para cada característica genómico utilizando software STRT [21]. En pocas palabras, de bajo nivel Lee fueron alineados utilizando Bowtie [22]. Mapeado lee se normalizaron usando lecturas por KB por millón lee método (RPKM) la normalización [23] mientras que sin asignar lecturas fueron retirados. análisis de la expresión diferencial de genes se realizó en R-Studio utilizando el paquete DESeq [24] y una secuencia de comandos adoptado de un trabajo previo [25]. p-valores ajustados Benjamini se utilizaron para el análisis de datos. El análisis de datos se realizó utilizando Qlucore ómicas Explorer 2.0 (Qlucore AB), 6 PRISM (GraphPad Software), DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov) y GeneVenn (http://genevenn.sourceforge.net).
Las líneas celulares Uppsala U3NNN-mG no se analizaron en réplicas. Para cada línea celular de ARN total fue extraído a partir de células cultivadas utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen) y se marcó y se hibridó en vectores Affymetrix GeneChip Human exón 1,0 ST siguiendo las instrucciones del fabricante. Los valores de expresión se RMAnormalized utilizando el software de Affymetrix Expresión de la consola.
Inmunofluorescencia tinción
Las células cultivadas pegarlas sobre cristal cubierta se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA) seguido de incubación de anticuerpo a 4 ° C durante la noche. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: fibrilar de conejo anti-proteína ácida glial (GFAP) (DAKO Cytomation) y el ratón anti-beta tubulina III (Tuj1) (Millipore). Las células fueron incubadas con marcado con fluorescencia secundaria de anticuerpos anti-conejo de Alexa Fluor 555 y Alexa Fluor 488 (Invitrogen) durante 1 hora a RT. Los núcleos se counterstained con DAPI y montado utilizando Immumount (DAKO). Imágenes de células teñidas fueron adquiridas con un microscopio confocal Olympus FV1000 y se procesaron con el software Adobe Photoshop CS5.1.
análisis de transferencia de Western
Las células se lisaron en tampón RIPA y la concentración de proteína se cuantificó usando el del ácido bicinconínico Kit (BCA) de ensayo de proteínas (Sigma-Aldrich; Pierce, Rockford, EE.UU.). Cantidades iguales de muestras de proteína se separaron por electroforesis utilizando geles de 10% Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad) o gel de Bis-Tris gradiente de poliacrilamida al 4-12% (NuPAGE, Invitrogen) en condiciones reductoras y se transfirieron a una membrana de PVDF (Bio- rad) o membrana de nitrocelulosa (Hybond-ECL, GE Healthcare, Suecia). Las membranas se bloquearon en 5% de leche durante 1 hora y se incubaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo de conejo anti-GRIA1 (Abcam), de conejo anti-S100 alpha 6 de anticuerpos (Abcam), anticuerpo anti-BLBP ratón (Millipore ) y anticuerpo de ratón anti-beta actina (Abcam). Las membranas fueron incubadas con la peroxidasa de rábano picante marcada con anticuerpo secundario apropiado (Sigma-Aldrich; GE Healthcare) antes de ser revelado por quimioluminiscencia (ECL Western Claridad sustrato, Bio-Rad; SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Pierce, Rockford, EE.UU.)). Las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando ImageJ (NIH, EE.UU.).
Resultados
perfiles de transcriptoma identifica relacionados stemness-Ca
2 + expresión génica en los CIV
Para determinar la relación entre las líneas GIC humanos y células madre neurales fetales humanos (NSC), que volvió a analizar los datos de microarrays de un estudio previo de Pollard
et al
[11]. Mientras que el primer componente principal segregado normal del cerebro de células madre neurales y los CIV (ver [11]), el segundo componente principal GICs clasificados en función de su similitud con células madre neurales, potencialmente reflejan aspectos de la troncalidad (fig. 1A). El SOX2 stemness asociada del gen, la BLBP marcador NSC (proteína de lípidos de unión a cerebro, codificada por el gen FABP7), así como la TUBB3 marcador neuronal (tubulina beta III), lo que puede reflejar de alta potencia para la diferenciación neuronal concomitante, se expresaron la más alto de células madre neurales, y los niveles de expresión se redujo en el orden del grupo GliNS1 & gt; G179NS & gt; G166NS (Fig. 1B). Mientras que la línea GliNS1 se transcripcionalmente relaciona con células madre neurales (NSC-proximales), la línea G166NS, constituyó el extremo distal de la relativa clasificación de células madre neurales (NSC-distal), que expresan marcadores compartidos con microglia y astrocitos reactivos y asociados con la inflamación, por ejemplo, IL-6, CXCL2 (MIP-2), y CCL20 (fig. 1B).
líneas (a) GIC ordenaron en relación con las líneas NSC (segundo componente en un análisis de componentes principales de los microarrays de expresión de ARNm basado datos de Pollard et al [11], donde el primer componente segrega NSCs y GICs de tejido cerebral normal). GliNS1 se deriva de la línea de G144ED en el estudio Pollard et al. (B) El nuevo análisis de los perfiles de transcriptoma en Pollard et al comparar los GIC de células madre neurales que indican una agrupación NSC-proximal de los GIC madre-como con una alta similitud con NSC, por ejemplo, compartir Sox2 y expresión BLBP. NSC-distales líneas GIC en contraste expresan marcadores microglia, como CXCL2, CXCL5 y CCL20. (C) De novo análisis de secuenciación de ARN y comparaciones por pares de NSCs y tres líneas GIC individuales (GliNS1, G179NS y G166NS) mostraron que NSCs expresa un mayor número de genes con 10 veces la expresión génica mayor en comparación con todas las líneas GIC. (D) Las comparaciones por pares de células madre neurales a las líneas GIC GliNS1, G179NS y G166NS, de forma individual. el enriquecimiento de genes y el análisis de genes ontología de perfiles basados transcriptoma de secuenciación, identificaron un enriquecimiento de Ca
2 + señalización de genes en células madre neurales, que aumentaron con distal orden de rango de NSC en las comparaciones por pares. (E) Las comparaciones por pares de la NSC-proximal (GliNS1) y los CIV NSC-distales (G166NS). el enriquecimiento de genes y el análisis de genes ontología sugieren un cambio en el Ca
2 + canales permeables a Ca
2 + genes en el NSC-distal línea GIC (cajas superiores) de unión. En volcán parcela, los nombres de genes en los genes relacionados canal iónico denotan /bomba /transportadoras verdes, mientras que los nombres de genes, de color morado denotan Ca
2 + vinculante genes de proteínas. El volcán parcela de la comparación de NSC-proximales y distales GICs NSC-reveló un mayor número de canales iónicos expresados en el NSC-proximal GIC (GliNS1).
A la secuenciación de novo de ARN profunda de tres de las líneas GIC utilizados en el Pollard
et al
estudio (GliNS1, G179NS y G166NS) y una línea NSC (hf5205NS) mostraron que más genes se expresaron en células madre neurales que las líneas GIC (figura 1C;. S1), potencialmente refleja su plasticidad y capacidad de diferenciarse. Por parejas NSC-GIC enriquecimiento de genes y anotación funcional (ontología de genes) mostró inesperadamente que el Ca
2 + iones de unión era la categoría más significativamente alterados en las tres líneas celulares - una diferencia que aumentó en más líneas GIC NSC-distal (Fig . 1D).
expresión diferencial de Ca
2 + provocadores y tampones se refiere a stemness
citosólica de Ca
2 + señalización se equilibra con varios jugadores, tales como Ca
2 + canales iónicos permeables que aumentan intracelular de Ca
2 + (por ejemplo, tensión cerrada Ca
2 + canales y receptores de glutamato, aquí denominado Ca
2 + provocadores) por un lado, y Ca
2 + aglutinantes que reducen libre intracelular de Ca
2 + en el otro (aquí denominadas Ca
2 + buffers) [26]. comparaciones directas por pares entre las diferentes líneas GIC mostraron que la línea GIC NSC-proximal (GliNS1) expresa un mayor número de genes de canales iónicos que incluyen Ca
2 + provocadores en comparación con la línea GIC NSC-distal (G166NS). Estos van desde Ca
2 + canales iónicos permeables (por ejemplo, receptores de glutamato: GRIA1, GRIA2, GRIK3 y subunidades reguladoras GRIN2B y GRIN2D), dependiente de voltaje Ca
2 + canales iónicos (CACNA1C /-E /-H) y Ca
2 + activados por los canales de potasio (por ejemplo KCNN3) (Fig. 1E). Por el contrario, la línea NSC-distal GIC (G166NS) expresaron niveles más altos de sensores de intracelular de Ca
2 + tampones (por ejemplo, genes de la familia S100 y CALB1).
Para definir con mayor precisión las diferencias en Ca
2+ expresión génica entre las líneas GIC probados y NSCs, expresión de Ca
2 + provocadores y tampones se analizó con más detalle en las tres líneas GIC (S1 Fig.). Como se sugiere en las comparaciones por parejas anteriores, la expresión de los receptores de glutamato disminuyó en líneas GIC NSC-distal (Fig. 2A). El GRIA1 receptor AMPA (Ca
2 + permeables receptores ionotrópicos de glutamato), que mostró la más alta expresión de los receptores de glutamato, clasificados en las líneas GIC de forma idéntica a la orden GliNS1 & gt; G179NS & gt; G166NS visto en el análisis de componentes principales (fig. 1A), basado en la comparación con la expresión de genes NSC. Por el contrario, la expresión de Ca
2 + buffers /efectores aumentó con un orden de clasificación inversa de GliNS1 & lt; & lt G179NS; G166NS (figura 2B.). Esto fue especialmente llamativo para el gen S100A6 que se expresa abundantemente en la mayoría G166NS. De manera similar a los datos de ARNm, análisis de transferencia Western de GRIA1 reveló un 70% y más del 95% menor expresión en G179NS y G166NS respectivamente, en comparación con la línea de GliNS1 NSC-proximal (Fig. 2B y 2E). El análisis de transferencia Western de S100A6 mostró una expresión un 45% y un 90% menor en G179NS y GliNS1, respectivamente, en comparación con la línea G166NS NSC-distal (Fig. 2C, 2D y 2E).
Análisis de la expresión de Ca
2 + provocadores como una de las subunidades del receptor de glutamato permeables GRIA1 (A) o Ca
2 + tampón S100A6 (B), clasificado las 3 líneas GIC (GliNS1 y G166NS, n = 5 cada uno. G179NS , n = 2.) de acuerdo con Ca
2 + sensibilidad a los fármacos, con canales de glutamato, tales como GRIA1, la predicción de mayor sensibilidad y amortiguar la expresión predicción de menor sensibilidad (*** p & lt; 0,001; prueba t no pareada de dos colas) . (C) Análisis de transferencia Western mostraron expresión de la proteína GRIA1 y S100A6, con β-actina como control de carga. (D) los niveles de expresión de la proteína de GRIA1 se expresaron como porcentaje de cambio veces en comparación contra a GliNS1 (n = 3) y de la proteína (E) S100A6 niveles de expresión se expresaron como porcentaje de cambio veces en comparación contra G166NS (n = 3) (** * p & lt; 0,001; ** p & lt; 0,01, * p & lt;. 0,05 ANOVA de una vía) guía empresas
GIC Ca
2 + sensibilidad a los fármacos se correlaciona con transcriptoma proximidad a NSC
Además Ca
2 + provocadores y tampones, membrana plasmática localizada Ca
2 + transportadores, tales como intercambiadores de sodio-calcio (NCX) que pertenecen a la familia SLC8 y la SERCA (sarco /retículo endoplasmático Ca
2 + ATPasa) de la bomba localizada en la membrana del retículo endoplásmico (ER), eliminar activamente citosólica de Ca
2 + para mantener la homeostasis [27] - [30]. Para explorar las posibles implicaciones funcionales de una expresión diferencial de Ca
2 + canales iónicos y Ca
2 + vinculante genes, A continuación realizó un desafío mediada por fármaco de Ca
2 + homeostasis y la señalización, en el GIC líneas. Las células se expusieron a al catión independiente de destino (Ca
2 +) ionóforo A23187 o el inhibidor de la bomba SERCA tapsigargina (Fig. 3), que aumentan citosólica de Ca
2 + niveles por dos mecanismos diferentes: A23187 permitiendo Ca
2 + para cruzar la membrana celular normalmente impermeable, y tapsigargina mediante el bloqueo de importación de Ca
2 + en la sala de emergencias. Las líneas GIC mostraron diferencias en la sensibilidad para ambos A23187 y tapsigargina (Fig. 3A y 3B, respectivamente), notablemente con un orden de rango entre las líneas idénticas a la de la orden de rango transcriptoma de raíces NSC, con el NSC-proximal GliNS1 ser cada sensible que G179NS, mientras que los G166NS NSC-distales fue menos sensible a ambos fármacos. Funcional análisis tanto muestran que los CIV NSC-proximales con una mayor expresión de Ca
2 + provocadores, son más sensibles a las alteraciones en Ca citosólico
2 + regulación de GIC en un fenotipo NSC-distal que expresan niveles elevados de Ca
2 + tampones.
(A) dosis análisis de la respuesta (0,01-40 mM) del Ca
2 + ionóforo A23187 y (B) la SERCA Ca
2 + inhibidor de la bomba tapsigargina mostró que el Ca
2 + rango de sensibilidad a los fármacos pedir con transcriptoma similitud con células madre neurales, con mayor sensibilidad en los GIC NSC-proximales. NSC proximal GIC fue más sensible a (C) 40 M A23187 y (D) 0.156 M tapsigargina tratamientos en comparación con las líneas distales NSC (* P & lt; 0,05; prueba t no pareada de dos colas). Los CIV NSC-proximales n = 3 y NSC-distales GICs n = 4.
Reducción de Ca
2 + sensibilidad a los fármacos sobre la diferenciación GIC
A medida que la sensibilidad a Ca
2+ drogas se asoció con una expresión NSC-como perfil la cuestión de si la diferenciación de los GIC afectaría Ca
2 + se investigó la sensibilidad. Con este fin, tres líneas GIC se sometieron a un protocolo de diferenciación utilizando suero bovino fetal (FBS). Validación de la diferenciación se realizó mediante análisis del transcriptoma de las líneas GIC y su progenie mediante secuenciación de RNA diferenciada (S1 Tabla). Análisis de componentes principales del conjunto global de datos mostró que los cambios en el transcriptoma eran distintos y separados de manera significativa entre los CIV indiferenciadas y diferenciadas (CIV de diffGICs) (Fig. 4A). Curiosamente, la expresión GRIA1 que se correlaciona con Ca
2 + sensibilidad a los fármacos, disminuyó en todas las líneas GIC durante la diferenciación (Fig. 4B), lo que sugiere que el estado de diferenciación podría afectar Ca
2 + sensibilidad. Ca funcional
2 + por lo tanto, la sensibilidad fue ensayada mediante A23187 (10 uM, 48 horas) en los CIV diferenciadas y se compara con los CIV indiferenciadas que revelan un claro efecto reducido sobre la viabilidad celular en todas las líneas GIC sobre la diferenciación y con el efecto más fuerte de la droga sensibles NSC-proximal línea GIC (GliNS1) (Fig. 4C). Estos resultados apoyan aún más los datos que Ca
2 + sensibilidad se asocia con inmaduras GICs NSC-como.
(A) mapeo transcriptoma secuenciación de ARN seguido de un análisis de componentes principales verificada la segregación entre los CIV indiferenciadas y diferenciadas (GliNS1 , G179NS y G166NS). panel derecho muestra tinciones inmunofluorescentes de la diferenciación Marcadores de GFAP (rojo) y Tuj1 (verde) en el tratamiento de FBS. (B) Comparación de los niveles de expresión en GRIA1 GICs indiferenciadas y diferenciadas (n = 6) reveló una reducción en el cambio veces en la expresión GRIA1 a la diferenciación inducida por el suero en todas las líneas GIC. (*** P & lt; 0,001; prueba t no pareada de dos colas). (C) Análisis de viabilidad de las células de la sensibilidad con respecto al Ca
2 + ionóforo A23187 después de la diferenciación mostró mayor viabilidad a la diferenciación de la línea GIC NSC-proximal GliNS1 (* p & lt; 0,05; pareada de dos colas t-test).
la expresión de genes se correlaciona con Ca
2 + sensibilidad a los fármacos
Para explorar posibles genes adicionales que correlacionan con Ca
2 + sensibilidad, los datos del transcriptoma de nueve nuevas líneas GIC (deriva en un laboratorio independiente) se comparó con Ca
2 + datos de sensibilidad de la exposición a tapsigargina (72 h de exposición) (Fig. 5A y el cuadro S2). 7 de las 9 líneas se ha demostrado que recapitular el tumor padre (S3 Tabla). El análisis de correlación (Pearson) entre NSC-marcadores y la sensibilidad a tapsigargina (1 M) reveló una correlación significativa para nestina (NES) (Fig. 5B, valor atípico marcado en rojo fue excluido del análisis) y la proteína de lípidos-Bindig cerebro (BLBP /FABP7) (Fig. 5C) la expresión de ARNm, mientras que no se encontró correlación para SOX2 (datos no mostrados). El análisis de transferencia Western verificó además que las líneas sensibles a fármacos de calcio (U3017 y U3084-MG-MG) expresaron más proteínas BLBP que las líneas menos sensibles (U3013 y U3035-MG-MG) (Fig. 5D). El análisis de correlación también confirmó una correlación entre la sensibilidad a la tapsigargina y expresión GRIA1 (Fig. 5E), lo que fue corroborado por el análisis de los niveles de proteína por transferencia de western, como expresión de la proteína GRIA1 sólo se detectó en los CIV sensibles (Fig. 5F). El enriquecimiento de genes y la ontología de genes análisis de los genes implicados en la regulación del ciclo celular, el oxígeno, el ARN y el metabolismo macromolécula implícita, y como era de esperar Ca
2 + señalización mediada como correlacionar con Ca
2 + sensibilidad a los fármacos (Fig. 6A) .
(a) Nueve nuevas líneas GIC fueron sometidos a análisis de respuesta a la dosis tapsigargina (0,1-100 M), que muestra la respuesta a diferentes dosis moderadas de drogas. (B, C) Parcela de correlación entre la viabilidad celular después de Ca
2 + exposición al fármaco (tapsigargina, 1 M) y NES (B) y (C) FABP7 /BLBP expresión de ARNm. U3047-MG se consideró un valor atípico en el gráfico de NES (marcado en rojo) y la forma excluidos del análisis. (D) Análisis de transferencia Western que muestra BLBP (FABP7) expresión de proteínas en tapsigargina seleccionado sensible (U3017 y U3084-MG-MG) y menos sensible (U3013 y U3035-MG-MG) líneas celulares, con β-actina como control de carga. (E) Parcela de correlación entre la viabilidad de las células después de la expresión Ca
2 + exposición al fármaco (tapsigargina, 1 M) y el ARNm GRIA1. (F) la expresión Western blot que muestra el análisis de proteínas en GRIA1 seleccionado tapsigargina sensible (U3017 y U3084-MG-MG) y menos sensible (U3013 y U3035-MG-MG) líneas celulares. β-actina se utilizó como control de carga.
(A) Un análisis de correlación de la expresión del genoma amplia ARNm (análisis de microarrays) y la sensibilidad a tapsigargina (1 uM) en 9 líneas GIC adicionales, recuperada 785 genes correlacionar con Ca
2 + sensibilidad a los fármacos. el enriquecimiento de genes y la ontología análisis de la implicación de los genes identificados que afectan a la proliferación, el oxígeno y el metabolismo del RNA, el catabolismo y Ca
2 + señalización mediada. (B) 385 genes que correlacionan positivamente con una alta sensibilidad fueron filtradas por primera vez para los genes también expresó más alto en la línea GIC NSC-proximal GliNS1 y, posteriormente, también está regulado por disminución en esta línea en la diferenciación, que fue encontrado para reducir Ca
2 + sensibilidad a los fármacos , la recuperación de un conjunto de nueve genes, incluyendo el GRIA1 codifica el receptor de AMPA.
para identificar los genes en este conjunto de datos que también se asocia con una firma stemness NSC-proximal de los GIC, el conjunto se filtró más de genes, que también (1) tenían una expresión más elevada en comparación con GliNS1 G166NS y (2) se downregulated a la diferenciación (Fig. 6B). Este sacó una lista corta de nueve genes, dos de los cuales codifican para los canales iónicos que pueden aumentar citosólica de Ca
2 + (Ca
2 + provocadores), es decir, GRIA1 y el rectificador interno K
+ canal KCNJ4 , que puede participar en el mantenimiento de un potencial de membrana despolarizada requerida para activar voltaje Ca
2 + canales y Ca
2 + receptores de glutamato permeables. En resumen, la correlación entre Ca funcional
2 + sensibilidad a los fármacos y la expresión génica sugiere la participación dirigida a la sensibilidad a Ca
2 + sobrecarga, por una red de genes implicados en el mantenimiento de Ca
2 + homeostasis y provocada por fármacos el potencial de membrana.
análisis de Drogas Reactome identifica Ca
2 + inducida por la expresión de genes en el transcriptoma mundial
para identificar respuestas intracelulares de Ca
2 + subyacente a la diferencia de nivel de Ca
2 + sensibilidad en GICs, los G166NS GliNS1 NSC-proximal y NSC-distales fueron expuestos a A23187 durante 7 horas, seguido por el análisis del transcriptoma de la secuenciación de ARN ( "mapeo Reactome fármaco") (S4 Tabla). En la mayoría de Ca
2 + drogas sensibles línea GIC GliNS1, los genes con expresión alterada significativamente (Benjamini ajustado valor de p & lt; 0,05) fueron analizados mediante el enriquecimiento de genes y la ontología de genes, lo que demuestra que el ciclo celular relacionadas con los genes fueron alterados (Fig . 7B y S2 Fig.), lo que sugiere la detención del ciclo celular antes de la muerte celular. Como era de esperar, también se enriquecieron genes implicados en la respuesta al estrés ER, al igual que los genes en los procesos metabólicos de ARN. genes Curiosamente, proceso metabólico ARN implicadas también se correlaciona con la sensibilidad tapsigargina en el experimento anterior (Fig. 6A).
respuesta transcripcional a una mayor citosólica de Ca
2 + (A23187), se investigó mediante secuenciación de RNA después de 7 horas de exposición al fármaco en el NSC-proximal GIC línea GliiNS1 y la línea NSC-distal G166NS. parcelas volcán de forma significativa (P & lt; 0,05) alterados de la expresión génica en GliNS1 (A) y G166NS (C) con los genes inducidos compartidos marcados en rojo y verde (Ca
2 + activado factor de transcripción NFATc2). Tenga en cuenta las diferencias en el eje x indican una mayor inducción de todas global de la expresión génica en GliNS1. (B) el enriquecimiento de genes y análisis de genes ontología de genes con un cambio significativo en la expresión (p & lt; 0,05) en GliNS1, genes identificados que participan en la progresión del ciclo celular, así como ER funciones /Golgi asociada y la respuesta al estrés celular. (D) el análisis de genes de enriquecimiento de los genes regulados negativamente al menos 3 veces en GliNS1 y regula positivamente al menos 1,5 veces en G166NS.
Los genes con expresión alterada después de la exposición al fármaco se representaron frente a la expresión de valor medio (antes