Extracto
La terapia fotodinámica (PDT) ha emergido como un tratamiento efectivo para diversos tumores sólidos. El NRF2 factor de transcripción se conoce para proteger contra el estrés oxidativo y electrofílico; sin embargo, su actividad constitutiva en el cáncer confiere resistencia a fármacos contra el cáncer. En el presente estudio, se investigó la señalización NRF2 como determinante molecular potencial de un feofórbido (PBA) a base de PDT utilizando
NRF2
de carcinoma de mama -knockdown células MDA-MB-231. Las células con estables
NRF2
caída mostraron citotoxicidad y apoptosis la muerte celular /necrótico mejorado tras PDT junto con el aumento de los niveles de oxígeno singlete y especies reactivas de oxígeno (ROS). Una visualización microscópica confocal de fluorogénico Pba demostró que
NRF2
células -knockdown acumular más Pba que las células de control. Un análisis posterior de la expresión de transportadores de fármacos de membrana mostró que la expresión basal de
BCRP
es NRF2-dependiente. Entre transportadores de fármacos medidos, la expresión basal de proteína de resistencia del cáncer de mama (BCRP; ABCG2) solamente fue disminuida por
NRF2
-knockdown. Además, después de la incubación con el inhibidor específico BCRP, la acumulación celular diferencial Pba y ROS en dos líneas celulares fueron abolidos. Además,
NRF2
células -knockdown expresan bajo nivel de peroxiredoxin 3 en comparación con el control, lo que implica que la disminución de sistema de defensa ROS mitocondrial puede estar contribuyendo a PDT sensibilización. El papel de la vía Nrf2 BCRP en respuesta PBA-PDT se confirmó adicionalmente en células de carcinoma de colon HT29. En concreto,
NRF2
caída resultó en la muerte celular mejorada y aumento de oxígeno singlete y los niveles de ROS siguientes PDT a través de la disminución de expresión de BCRP. Del mismo modo, la generación de ROS inducida por la TFD se incrementó sustancialmente mediante el tratamiento con
NRF2
shRNA en células de carcinoma de mama MCF-7, células de carcinoma de colon HCT116 carcinoma de células A498, renales y células de glioblastoma A172. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la manipulación de NRF2 puede aumentar la sensibilidad PBA-PDT en múltiples células cancerosas
Visto:. Choi Bh, Ryoo Ig, Kang HC, Kwak MK (2014) La sensibilidad de las células del cáncer de feofórbido una basada en la terapia fotodinámica se ve reforzada por
NRF2
silenciamiento. PLoS ONE 9 (9): e107158. doi: 10.1371 /journal.pone.0107158
Editor: Michael Hamblin, MGH, MMS, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de mayo de 2014; Aceptado: 6 Agosto de 2014; Publicado: 16 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Choi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por la Fundación de Investigación Nacional (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación futura (NRF-2013R1A2A2A01015497). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la terapia fotodinámica (PDT) ha emergido como un tratamiento eficaz para varios tumores sólidos [1] - [3]. PDT requiere tres elementos: i) un fotosensibilizador que puede ser dirigido selectivamente a los tejidos tumorales, ii) una fuente de luz adecuada que emite bajo consumo de energía y la luz de penetración del tejido, y iii) el oxígeno molecular [4]. El primer paso de la TFD es la activación de un fotosensibilizador por la luz. Cuando el fotosensibilizador activado en su información en estado excitado a su estado fundamental, que transfiere su energía al oxígeno y genera oxígeno singlete (
1O
2), unas especies reactivas de oxígeno altamente reactivas y de corta duración (ROS), como un tipo II de reacción. Al mismo tiempo, el fotosensibilizador activado puede reaccionar directamente con los componentes celulares y las transferencias de un átomo de hidrógeno de formación de radicales, que finalmente produce productos de oxidación a través de la reacción con el oxígeno (reacción de tipo I) [5]. El oxígeno singlete y ROS son moléculas altamente oxidante; por lo tanto las células tratadas con PDT se someten a la muerte celular a través tanto de la necrosis y la apoptosis [6]. Además de su efecto directo sobre las células tumorales, PDT afecta microambiente del tumor mediante la destrucción de su microvasculatura y mediante la mejora de las respuestas inflamatorias y respuestas inmunes específicas de tumor [4], [7], [8].
feofórbido una (PBA) es un producto de degradación de la clorofila, que se aísla de los excrementos de gusanos de seda [9] y la hierba medicinal china
Scutellaria barbarta
[10]. PBA absorbe luz a longitudes de onda más largas que el fotosensibilizador Photofrin de primera generación. La longitud de onda máxima Pba es 666 nm, mientras que la de Photofrin es 630 nm [11]. Debido a la penetración del tejido se ve reforzada por longitudes de onda más largas, Pba ha sido considerado como un fotosensibilizador para el tratamiento de tumores grandes en la cavidad peritoneal [12]. Similar a Photofrin, Pba induce la apoptosis y la necrosis en el carcinoma de páncreas, leucemia y las células de carcinoma hepatocelular [13] - [15]. En las células de carcinoma de útero, el mecanismo subyacente de la apoptosis es la acumulación Pba en la mitocondria, lo que conduce a la generación de ROS y la liberación de citocromo c [16], [17]. Del mismo modo, Pba provoca apoptosis mitocondrias-dependiente en carcinoma de mama MCF-7 células [18]. Varios
in vivo
estudios en animales han apoyado la eficacia de PBA-PDT en la prevención de la tumorigénesis. Por ejemplo, una preparación liposomal de PBA-PDT retrasó el crecimiento tumoral en un xenoinjerto de carcinoma de colon HT29 [19]. La administración intravenosa de 0,3 mg /kg Pba seguido de irradiación de luz crecimiento del tumor inhibió significativamente en ratones desnudos portadores de un xenoinjerto de hepatoma humano [11]
.
Uno de los factores para determinar la eficacia de la TFD es la expresión de casete de unión a ATP ( ABC) transportadores en el tejido diana. Estos transportadores controlar la acumulación intracelular de sustancias químicas extrañas mediante el transporte de forma activa fuera de la célula [20]. La proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP o ABCG2) es un transportador ABC que se identificó originalmente en las células de cáncer de mama resistente a doxorrubicina [21]. La sobreexpresión de BCRP en los tumores confiere resistencia a la quimioterapia [22]. Además de los fármacos contra el cáncer, BCRP se ha demostrado que el transporte de los fotosensibilizadores de tipo porfirina. Específicamente, las células HEK que sobreexpresan BCRP presentaron resistencia a la citotoxicidad inducida por Pba [23]. Al mismo tiempo,
BCRP
-knockout ratones eran altamente susceptibles a la fototoxicidad de la piel inducida por la dieta Pba [24].
El factor de transcripción NF-E2 relacionada con el factor de 2 (NRF2) es una miembro de la familia de cap'n'collar básicos cremallera de leucina (CNC-bzip) factores de transcripción [25]. NRF2 actividad está regulada principalmente por la proteína citoplasmática Kelch-como la proteína asociada ECH-1 (KEAP1) [26], [27]. A través de la unión al dominio Neh2 de Nrf2 KEAP1 media ubiquitinylation y posterior degradación proteasomal de NRF2. En condiciones de estrés oxidativo como el electrófilo, NRF2 se libera de KEAP1 y se transloca al núcleo, lo que resulta en la transcripción de varios genes diana que codifican enzimas desintoxicantes, proteínas antioxidantes, proteínas de respuesta al estrés, y transportadores de fármacos [28] - [30] . Debido a sus genes diana tienen efectos citoprotectores, NRF2 se considera como un jugador crítico en el sistema de defensa contra el estrés oxidativo y electrofílica [31]. En consecuencia, varios estudios han demostrado que la eliminación genética de
nrf2
se asocia con una mayor susceptibilidad a daños en los tejidos y el daño resultante de los factores de estrés ambientales y endógenos [28], [31], [32]. Por otro lado, el aumento de la evidencia sugiere que las células de cáncer de explotar el sistema NRF2 para la supervivencia mediante la adaptación a la microambiente tumoral estresante [33]. señalización NRF2 es constitutivamente activado en varios tipos de tumores y líneas celulares de cáncer cultivadas, que se asocia con un aumento del crecimiento del tumor y resistencia a los agentes quimioterapéuticos. En las células cancerosas, la señalización NRF2 está regulado hasta después de la exposición a fármacos quimioterapéuticos, que confiere resistencia adquirida a la quimioterapia [34] - [36]. Del mismo modo, la TFD con la hipericina en células de carcinoma de vejiga humano dio como resultado una elevada expresión de la proteína Nrf2 nuclear y hemo oxigenasa-1 (HO-1) a través de p38
MAPK y las vías PI3K [37]. El tratamiento de células HepG2 con una concentración no tóxica de Pba seguido por la activación foto por 90 min dio lugar a una mayor expresión de BCRP y hemo oxigenasa-1 (HO-1) de una manera dependiente de NRF2 [38].
En el presente estudio, se investigó NRF2 como determinante molecular novedoso de la eficacia de PDT. Debido NRF2 regula la expresión de ROS-contrarrestar componentes y varios fármacos transportadores, la hipótesis de que la manipulación de la expresión NRF2 mejoraría la eficacia de la terapia fotodinámica. Para probar esta hipótesis, establecimos estable
NRF2
líneas celulares -knockdown utilizando de carcinoma de mama humano MDA-MB-231 células y células HT29 de carcinoma de colon, y la sensibilidad PDT medido. Nuestros resultados mostraron que
NRF2
caída aumenta la muerte celular inducida por PDT mediante el aumento de la producción de ROS. Como un mecanismo subyacente, la expresión de BCRP fue reprimida por
NRF2
desmontables, lo que aumenta la acumulación celular de Pba y el aumento de la producción de oxígeno singlete.
Materiales y Métodos
Materiales
Pba era de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). anticuerpo NRF2 se obtuvo de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.). Anticuerpos que reconocen AKR1C1 y BCRP se adquirieron de Abnova (Taipei, Taiwán) y Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.), respectivamente. anticuerpos PRDX3 y β-tubulina se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology. Ko143, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT), y puromicina se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EE.UU.). 5 (6) carboxi-2 ', diacetato (DCFDA), trans-1- (2'methoxyvinyl) pireno, y MitoGreen 7'-diclorofluoresceno se adquirieron de Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). El sistema lentiviral que contiene un pre-diseñado humana
NRF2
shRNA e inespecíficos revueltos ARN (scARN) fue comprado a Sigma-Aldrich.
Cultivo de células
La célula de cáncer de mama humano la línea MDA-MB-231 y MCF-7, línea celular de cáncer de colon HT29 y HCT116 y A498 carcinoma renal humano se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.). El A172 línea celular de glioblastoma humano se adquirió de la célula de Corea Línea de banco (Seúl, Corea del Sur). MDA-MB-231, MCF7, A498, A172, HCT116 y se mantuvieron en un medio que contiene medio Eagle modificado de Dulbecco y mezcla de nutrientes F-12 (Hyclone, Utah, EE.UU.) en la proporción de 01:01 suplementado con 10% de bovino fetal suero (Hyclone) y penicilina /estreptomicina (WelGene Inc., Daegu, Corea del Sur). HT29 se mantuvo en medio RPMI-1640 (Hyclone) con 10% de FBS y penicilina /estreptomicina. Las células fueron cultivadas a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 atmósfera.
Producción de partículas de lentivirus que contenían
NRF2
plásmido de expresión de shRNA
partículas lentivirales con shRNA se produce en las células HEK 293T después de la transfección de las células con
NRF2
shRNA plásmido de expresión y la mezcla de empaques (Sigma-Aldrich) como se ha descrito anteriormente [36]. Brevemente, las células HEK 293T se sembraron en placas de 60 mm a una densidad de 7 x 10
5 células por pocillo. Al día siguiente, el medio se reemplazó por OptiMEM (Life Technologies) y, posteriormente, 1,5 g pLKO.1-NRF2 shRNA, que contiene el humano
NRF2
específico de shRNA (5'-CCGGGCTCCTACTGTGATGTGAAATCTCGAGATTTCACATCACAGTAGGA-3 '), y la mezcla de empaque se transfectaron en las células utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies). El plásmido pLKO.1-scARN se utilizó como un ARN de control no específica. En el segundo día, después de la eliminación del complejo de la transfección, se añadió el medio completo en cada pocillo. Medios que contienen partículas lentiviral fueron cosechadas después de 4 días.
Establecimiento de
NRF
línea celular desmontables
células en placas de 6 pocillos se incubaron con partículas de lentivirus 231 MDA-MB- que contiene o bien scARN o plásmido de expresión NRF2 shRNA. Después de una h de incubación-48, se recuperaron las células en el medio completo y la puromicina (1 mg /ml) fue seguida de selección para un máximo de 4 semanas. El
NRF2
línea celular HT29 caída se estableció como se informó anteriormente [39].
caída transitoria de NRF2
MCF-7, HCT116, A172 y A498 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 células /pocillo y se cultivaron durante toda la noche. Al día siguiente, las células se incubaron con el colesterol para 15 min y luego, la partícula lentiviral que contiene scARN o shNRF2 se añadieron a cada pocillo. Después de 48 h de incubación, los medios que contienen partículas virales se retiraron y se recuperaron las células en el medio fresco durante la noche.
PDT y MTT análisis
MDA-MB-231 y HT29 se sembraron a una densidad de 7 x 10
placas /pocillo en 96 pocillos 3 células y se incubaron durante 20 h. Las células fueron tratadas con Pba (0-2,5 mg /ml) durante 6 h y luego se irradiaron con 0,3 (HT29) o
2 (MDA-MB-231) láser 0,6 J /cm en ausencia de Pba. Para la irradiación láser, el sistema 670 nm de la lámpara LED híbrido (Quantum Spectra vida, Barneveld, WI) se utilizó. Las células se recuperaron en medio completo durante 18 h y se incubaron con MTT durante 4 h. Después de la eliminación de la solución de MTT, se añadieron 100 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a cada pocillo y la absorbancia se midió a 570 nm usando un Spectro estrellas Nano lector de microplacas (BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemania).
La citotoxicidad de medición
La citotoxicidad con TFD se evaluó mediante sistema de ensayo CytoTox-Fluor (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Después de PDT, se mantuvieron las células durante 24 h y después se añadieron 50 l de sustrato bis-AAF-R110 a cada pocillo. Substrato solución que contiene se incubó durante otras 2 h con agitación orbital a 37 ° C. Las intensidades de fluorescencia se midieron usando un SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) en el 485 nm Ex /520 nm Em.
extracción total de ARN y PCR en tiempo real análisis
ARN totales fueron aisladas de las células usando un reactivo Trizol (Life Technologies). Para la síntesis de ADNc, la transcriptasa inversa (RT) las reacciones se realizaron mediante incubación de 200 ng de ARN total con una mezcla de reacción que contiene 0,5 g /l oligo dT
12 a 18 y 200 U /l Virus Moloney de la leucemia murina RT (Vida Technologies). Para el análisis de la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (PCR), Roche LightCycler (Mannheim, Alemania) se utilizó con el sistema de Premix ExTaq Takara SYBR (Otsu, Japón). Los cebadores fueron sintetizados por Bioneer (Daejeon, Corea del Sur) y el primer secuencias de los genes humanos son:
NRF2
, 5'-ATAGCTGAGCCCAGTATC-3 'y 5'-CATGCACGTGAGTGCTCT-3';
HO-1, España 5'-GCTGCTGACCCATGACACCAAGG-3 'y 5'-AAGGACCCATCGGAGAAGCG-GAG-3'; aldo-ceto reductasa 1C1 (
AKR1C1), Francia 5'-CGAGAAGAACCATGGGTGGA-3 'y 5'-GGCCACAAA-GGACTGGGTCC-3'; NAD (P) quinona oxidorreductasa-1 (
NQO1
), 5'-CAGTGGTTTGGAGTCCCTGCC-3 'y 5'-TCCCCGTGGATCCCTTGCAG-3'; las subunidades catalíticas de γ-glutamato cisteína ligasa (
GCLC
), 5'-TGAAGGGACACCAGGACAGCC-3 'y 5'-GCAGTGTGAACCCAGGACAGC-3'; epóxido hidrolasa-1 (
EPHX1
), 5'-GCCTGCACTTGAACATGGCT-3 'y 5'-ATGTGCATGTAGCCGCTCTC-3'; superóxido dismutasa 1 (
SOD1
), 5'-GATTCCATGTTCATGAGTTT-3 'y 5'-AGGATAACAGATGAGTTAAG-3';
SOD2
, 5'-3 'y 5' AACCTCACATCAACGCGCAGAT-TCAGTGCAGGCTGAAGAGCTAT-3 '; catalasa (
CAT
), 5'-GTGCATGCAGGACAATCAGG-3 'y 5'-GAATGCCCGCACCTGAGTAA-3'; peroxiredoxin 3 (
PRDX3
), 5'-GCCGTTGTCAATGGAGAGTTC-3 'y 5'-GCAAGATGGCTAAAGTGGGAA-3';
PRDX5
, 5'-GGTGGCCTGTCTGAGTGTTA-3 'y 5'-ACCACCATGGAGAACCTCTTG-3'; glutatión peroxidasa 1 (
GPX1
), 5'-TTCCCGTGCAACCAGTTTG-3 'y 5'-TTCACCTCGCACTTCTCGAA-3';
GPX4
, 5'-TCACCAAGTTCCTCATCGACA-3 'y 5'-GCCACACACTTGTGGAGCTA-3'; glutatión reductasa (
GSR
), 5'-ACCCCGATGTATCACGCAGTTA-3 'y 5'-TGTCAAAGTCTGCCTTCGTTGC-3'; glutaredoxina 2 (
GLRX2
), 5'-GTATTGCTCTCCATCCTCCTCG-3 'y 5'-CTGGGAGCCTTTATGAGCGT-3'. tiorredoxina-2 (
TXN2
), 5'-CACACCACTGTGCGTGGAAA-3 'y 5'-ACTGTAACACCCAACCCAGC-3'; proteína de resistencia del cáncer de mama (
BCRP /ABCG2
), 5'-CACAACCATTGCATCTTGGCTG-3 'y 5'-TGAGAGATCGATGCCCTGCTTT-3'; proteína de resistencia a múltiples fármacos 1 (
MDR1 /ABCB1
), 5'-CTATGCTGGATGTTTCCGGT-3 'y 5'-TCTTCACCTGGCTCAGT-3'; asociada a la resistencia a múltiples fármacos de proteína 1 (
MRP1 /ABCC1
), 5'-AGCTTTATGCCTGGGAGCTGGC-3 'y 5'-CGGCAAATGTG- CACAAGGCCAC-3';
MRP2 /ABCC2, España 5'-GCTGCCACACTTCAGGCTCT-3 'y 5'-GGCAGCCAGCAGTGAAAAGC-3';
MRP3 /ABCC3, España 5'-ATACGCTCGCCACAGT-CCTT-3 'y 5'-GCTGGCCATGATGACCACAA-3';
MRP4 /ABCC4
, 5'-CTTG- GATCGCAA-TACCCTTG-3 'y 5'-GACACCTCTCTTCTGCTTTG-3';
MRP5 /ABCC5, España 5'-CAGAGACCGTGAAGATTCCA-3 'y 5'-TTTGGAAGTAGTCCGGATGG-3';
MRP6 /ABCC6, España 5'-TGTGTGGCTCACCACGATG-3 'y 5'-CATAGGTAG- GTGGACAG-GTGG-3'; catión orgánico transportador novela 1 (
OCTN1;
SLC22A4), 5'-GCTGTATGTCTTCACTGCTG-3 'y 5'-GGTGAGGATTCCAATCAGGA-3';
OCTN2 gratis (
SLC22A5
), 5'-ATTGTTGTGCCTTCCACTATC-3 'y 5'-GGTCATCCACAGCATTATGG-3'; a múltiples fármacos y extrusión toxina transportador 2 (
MATE2
;
SLC47A2
), 5'-TTCATTCCAGGACTTCCGGTG-3 'y 5'-AGGTGTGAGTGAGATGGATGG-3'; hipoxantina fosforribosiltransferasa-1 (HPRT1), 5'-TGGCGTCGTGATTAGTGATG-3 'y 5'-GCTACAATGTG-ATGGCCTCC-3'.
Medición de oxígeno singlete
Las células se sembraron en una cubierta de vidrio plato (ciencias de la vida SPL, Gyeonggi-do, Corea del Sur) y se cultivaron durante toda la noche. Después de la irradiación PBA-láser, las células se lavaron con PBS y se incubaron con 50 mM 1- trans-pireno (2'methoxyvinyl) (Life Technologies) durante 30 min. Para la tinción de los núcleos, Hoechst 33342 (H342) se añadió a los platos por encima y se incubó durante 10 min. se detectó la fluorescencia verde de oxígeno singlete inmediatamente con un LSM 710 microscopio confocal (Carl Zeiss, Jena, Alemania) y las intensidades se cuantificaron usando un software ZEN2011 (Carl Zeiss).
Medición de ROS intracelulares
los niveles de ROS celular fueron examinadas usando una sonda fluorogénico permeable a las células, carboxi-H
2DCFDA. Las células se sembraron en una placa de fondo de cristal de cubierta (SPL ciencias de la vida) y se incubó adicionalmente durante toda la noche. Después de la terapia de PBA-láser, las células se lavaron con PBS y se incubaron con 30 M de carboxi-H
2DCFDA durante 30 min a 37 ° C. Para la tinción de los núcleos, H342 se incubó durante 10 min. A continuación, se obtuvieron imágenes confocal y las intensidades fluorescentes verdes se cuantificaron utilizando un microscopio confocal y ZEN2011 software LSM 710
Medición de la acumulación Pba
Pba es una sustancia fluorogénico.; por lo tanto, el nivel de acumulación intracelular de Pba se determinó midiendo la fluorescencia de color rojo en la célula. MDA-MB-231 y HT29 en portaobjetos de vidrio de cubierta se incubaron con Pba durante 6 h. Entonces, la PBA se retiró y se siguieron lavados con PBS. Las intensidades de fluorescencia roja Pba se cuantificaron en confocal de imágenes utilizando el software ZEN2011. Como una forma alternativa para la cuantificación, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos (BD Biosciences) y se incubaron con Pba durante 6 h. Después del lavado de células, se detectó fluorescencia roja Pba utilizando un generador de imágenes CellInsight celular personal (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) y las intensidades fueron cuantificados por el software CellInsight (Thermo Fisher Scientific).
determinación fluorométrica de intracelular Pba
Las células en placas de 96 pocillos se incubaron con Pba por 6 h y luego se lisaron usando 1% de SDS después de PBS de lavado. DMSO se añadió a los lisados celulares para disolver intensidad Pba y la fluorescencia celular se midió usando un SpectraMax M5 en el 415 nm Ex /673 nm Em.
análisis de transferencia de Western
Las células se lisaron con tampón RIPA (Tris 50 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, y 1% phenoxypolyethoxylethanol nonil 40) que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa (Sigma-Aldrich). Para la extracción de proteína BCRP, 0,1% SDS se añadió a un tampón de RIPA. La concentración de proteína se determinó usando un kit de ensayo de proteínas DC (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Las muestras de proteínas se separaron por electroforesis en 12% geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Whatman, Dassel, Alemania). A continuación, la membrana se bloqueó con leche desnatada 5% o 3% de albúmina de suero bovino durante 1 h y se incubaron con anticuerpos. Las imágenes fueron capturadas quimioluminiscencia utilizando una Fujifilm LAS-4000 Mini reproductor de imágenes (Fujifilm, Tokio, Japón) y las intensidades se cuantificaron con el software correspondiente.
citometría de flujo
Las células MDA-NRFi se sembraron en 60 cm
2 platos a una densidad de 1 × 10
5 células /pocillo y se cultivaron durante la noche. Después de la irradiación PBA-láser, se tripsinizaron las células y se centrifugaron a 15.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Entonces, 2 × 10
5 células se transfirieron a 1,5 ml tubo de centrifugación a 8000
g
durante 5 min a 4 ° C. A continuación, 5 l de fluorocromo conjugado de Anexina V (BioLegend, San Diego, CA, EE.UU.) y 10 l de yoduro de propidio (PI, BioLegend) se añadieron solución en cada tubo y se incubaron con vórtice suave. Las células se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad y luego, se añadió tampón de 400 ul de Anexina V vinculante (BioLegend) a cada tubo. Se analizaron las células teñidas utilizando un Becton-Dickinson FACS Canto (San Jose, CA, EE.UU.) y con los datos fueron analizados con el software FACSDiva (BD).
El análisis estadístico
La significación estadística se determinó por una prueba t de Student apareado seguida o un solo sentido el análisis de varianza (ANOVA de una vía) seguido de la prueba de Student Newman-Keuls para comparaciones múltiples utilizando el software GraphPad Prism (la Jolla CA, EE.UU.).
resultados
Pba citotoxicidad se ve reforzada por
NRF2
caída en 231-MDA-MB células de cáncer de mama
con el fin de investigar la participación de NRF2 en la eficacia de PBA-TFD para cáncer de mama, se estableció un
NRF2
línea celular de carcinoma de mama MDA-MB en -knockdown-231 células. Las líneas celulares estables que expresan el ARN codificado no específica (sc-MDA) o
NRF2
específico de shRNA (NRF2i-MDA), se alcanzaron a partir de la selección de puromicina durante 4 semanas. Los niveles de expresión de NRF2 y sus genes diana se evaluaron en estas líneas celulares. NRF2i células MDA-mostraron una reducción del 85% en
NRF2
ARNm y disminuciones sustanciales en la expresión de la NRF2 objetivos
AKR1C1
y
HO-1 | (fig. 1A). Western blot mostró que los niveles de proteínas y NRF2 AKR1C se reducen considerablemente en desmontables células (fig. 1B). Estos confirman la inhibición exitosa de NRF2 señalización en la línea celular estable comprobado. A continuación, se analizó la sensibilidad de
NRF2
-knockdown MDA-MB-231 células a PBA y la terapia de combinación de láser. Sin irradiación con láser, la incubación de sc-MDA y las células NRF2i-MDA con Pba (0,025 a 2,5 mg /ml, 24 h) no afectó significativamente la viabilidad celular (Fig. 1C). Del mismo modo, la irradiación con láser sin Pba incubación no afectó la viabilidad celular (Fig. 1D). Para evaluar la sensibilidad PDT, las células fueron irradiadas con un /cm
2 laser 0,6-J después de la incubación con el análisis Pba y MTT se realizó después de 18 h de recuperación. Inicialmente, efecto de la PDT se evaluó con diversos tiempos de incubación de Pba. La incubación de Pba (0,125 g /ml) durante 2, 6, y 18 h mostró citotoxicidad similar en las células de control sc (Fig. 1E). Sobre la base de este resultado, el 6 h de incubación-PBA se mantuvo en este estudio.
(A) Los niveles de transcripción de
NRF2
,
AKR1C1
, y
HO-1
se midieron en el control (SC-MDA) y
NRF2
células -knockdown (NRF2i-MDA) usando la cuantificación relativa de PCR en tiempo real. HPRT1 se utilizó como gen de control de limpieza. Los datos representan proporciones con respecto a sc-MDA y se presentan como media ± desviación estándar (DE) de 3 experimentos. los niveles de (B) de proteína de NRF2 y AKR1C1 se determinaron por análisis de transferencia Western en el control sc y células NRF2i-MDA. (C) Las células sc-MDA y NRF2i-MDA se incubaron con Pba (0-2,5 mg /ml) durante 6 h, y las células viables se cuantificaron usando un ensayo MTT después de una recuperación de 18 h. (D) Las células fueron irradiadas mediante un láser en ausencia de Pba, y las células viables se cuantificaron usando un ensayo MTT después de una recuperación de 18 h. (E) El sc-MDA se incubó con Pba para 2, 6, o 18 h y se determinó el número de células viables después de la irradiación láser. Los datos representan porcentajes con respecto al grupo del vehículo para cada línea celular y se presentan como la media ± desviación estándar de 8 pocillos.
En el análisis MTT, las células Nrf2 MDA fueron relativamente más sensible a Pba -basado PDT: número de células viables después de PDT fue menor en las células MDA-NRF2i que la de las células control (Fig 2A.). Del mismo modo, cuando la actividad de peptidasa derivada de células muertas se midió en el medio utilizando un sustrato CytoTox
NRF2
desmontables células mostraron una citotoxicidad significativamente alta en comparación con el control sc (Fig. 2B)
.
( a) El control sc y células NRF2i-MDA fueron pre-incubadas con Pba (0-2,5 mg /ml) durante 6 h y luego se irradiaron por 0,6 J /cm
2 láser. A continuación, se realizó un análisis MTT después de una recuperación de 18 h. Los datos representan porcentajes con respecto al grupo de vehículo para cada línea celular y se presentan como la media ± SD de 8 pocillos.
aP & lt; 0,05 en comparación con el control sc-MDA en cada concentración de Pba. citotoxicidad inducida por PDT (B) se evaluó midiendo la actividad de la proteasa de células muertas en un medio de cultivo celular. Las células se incubaron con Pba (0,125 y 0,25 g /ml) durante 6 h seguido de la irradiación con láser, y se incubaron durante 18 h. actividad de la proteasa celular derivada muertos se determinó utilizando el sustrato fluorogénico AAF-R110. Los datos representan la citotoxicidad relativa con respecto al grupo del vehículo para cada línea celular y se presentan como la media ± SD de 8 pocillos.
AP & lt; 0,05 en comparación con los controles sc-MDA. Análisis de citometría de (C) Un flujo de células apoptóticas y necróticas se realizó en células MDA-NRF2i después del tratamiento PBA-láser. Las células se incubaron con PI y Anexina V, y se evaluaron las poblaciones de células. (D) El gráfico de barras que representa la población de células de Anexina V (AV) + /PI +, AV + /PI, o AV /PI + fase a partir de tres experimentos separados.
AP & lt; 0,05 en comparación con el control sin láser. las células (E) NRF2i-MDA fueron co-incubaron con Z-VAD-FMK (10 M) o necrostatin (Nec-1, 50 M) y Pba (0,125 g /ml) durante 6 h; a continuación, las células se lavaron con PBS y se irradiaron con un láser. Después de 18 h de incubación, las células viables se cuantificaron usando un ensayo MTT. Los datos son porcentajes con respecto al control (sin PDT y el vehículo de tratamiento) y se presentan como la media ± SD de 8 pocillos.
aP. & Lt; 0,05 en comparación con el control
PDT induce la muerte celular a través de vías apoptóticas y necróticas [6], [40]. A continuación, con el fin de identificar el mecanismo de la muerte celular implicado en PDT tratada
se realizó NRF2
células de cáncer de mama caída, análisis FACS con anexina V y PI doble tinción. Las células MDA-NRF2i fueron tratados con PDT; inmediatamente después, las células se trataron con tripsina y se tiñeron con Anexina V (marcador de apoptosis temprana) y PI (apoptosis tardía y marcadores de necrosis). Después de tratamiento de combinación PBA-láser, la población de células mayoría desplaza a la fase de apoptosis-necrótico (Fig. 2C). Cuantificación de repeticiones experimentales mostró que 16,7% de las células estaban en la fase temprana de apoptosis (anexina V + /PI-) y 61,3% de las células estaban en la fase tardía de apoptosis /necrosis (anexina V + /PI +). Sólo 15,7% de las células estaban en la fase no apoptótica y no necrótico (Fig. 2D). Estos muestran claramente que la TFD induce la muerte celular que implica el proceso de apoptosis y necrosis. Como confirmación, cuando las células se co-incubaron con un pan-inhibidor de caspasa Z-VAD-FMK (10 M) y PDT (Pba 0,125 g /ml) porcentaje del número de células viables aumentó de 63% a 80,1% (Fig. 2E ). Además, la incubación con necrostatin (50 mM), un inhibidor potente de la muerte celular necrótica programado, el número de células viables elevada a 78,2%. Tomados en conjunto, los resultados obtenidos indican que
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desmontables células sensibilizadas cáncer de mama MDA-MB-231 a PDT basada en Pba, lo que resulta en la muerte celular mejorada.
generación de ROS estimulada por la TFD es elevado en
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células MDA desmontables
comunicados de la terapia de combinación PBA-láser singlete de oxígeno dentro de la célula, y el ROS resultante es un importante contribuyente a la citotoxicidad del PDT [5]. Por lo tanto, monitoreamos los niveles de oxígeno singlete derivados de la TFD en ambas líneas celulares. Las células pre-tratadas con Pba (2,5 mg /ml de 6 h) fueron irradiados por una /cm
2 laser 0,6-J, y los niveles de oxígeno singlete se determinaron utilizando 1- trans-pireno (2'methoxyvinyl), un colorante fluorescente, que es específico para el oxígeno singlete. En comparación con el tratamiento con Pba Sólo o láser de la irradiación, la trans-1- (2'methoxyvinyl) método basado en pireno mostró que grupo de combinación PBA-láser muestra una señal fluorescente mejorada dentro de la célula (datos no presentados), lo que confirma el aumento de la oxígeno singlete por PDT. En nuestra evaluación inicial, la incubación de pireno trans-1- (2'methoxyvinyl) durante 5 min, 30 min y 50 min mostró aumentar los niveles similares de singlete intensidad pireno fluorogénico derivados del oxígeno (Fig. 3A). Esto confirma que singlete fluorescencia pireno derivados del oxígeno puede ser detectable con fiabilidad durante estos tiempos incubaciones; Por lo tanto, una determinación confocal se realizó después de 30 minutos de incubación de 1- trans-pireno (2'methoxyvinyl) en nuestro estudio. La medición comparativa de oxígeno singlete demostró que
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-knockdown células MDA-MB-231 generan mayores niveles de oxígeno singlete que las células control (Fig. 3B). Las señales fluorescentes se distribuyeron en el citoplasma así como el núcleo, y la intensidad total de fluorescencia fue 1,5 veces mayor en las células desmontables que en las células de control. De acuerdo con ello, el nivel total de ROS, que se controló usando DCFDA, se elevó sustancialmente después del tratamiento con la combinación PBA-láser en ambas líneas celulares; Sin embargo, el aumento fue mayor en las células MDA-NRF2i. En concreto, después del tratamiento con 2,5 mg /ml Pba y la irradiación láser, el aumento de ROS fue 4,6 veces mayor en el
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línea celular -knockdown que en la línea celular de control (Fig. 3C). Del mismo modo, después del tratamiento con la baja concentración de Pba (0,125 g /ml) y la irradiación con láser, el aumento de ROS fue 3,5 veces mayor en células MDA-NRF2i (Fig. 3D). Estos resultados sugieren que la elevación de oxígeno singlete y ROS aumenta la sensibilidad de
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-knockdown células de cáncer de mama a la TFD.
(A) La sc control de las células fueron incubadas con Pba durante 6 hy irradiado por un 0,6 J /cm
2 láser. Justo después de PDT, se añadió una sensible trans-1- (2'methoxyvinyl) pireno oxígeno singlete y las células se incubaron adicionalmente durante 5, 30, o 50 min en presencia de 1- trans-pireno (2'methoxyvinyl). A continuación, se realizó la observación confocal para detectar la formación de colorante fluorogénico, que se formó por la reacción con oxígeno singlete.