Extracto
Antecedentes
toxina de la difteria (DT) se ha utilizado como un agente anti-cáncer de prospectiva para la ejecución selectiva de la terapia citotóxica a la neoplasia de otra manera intratable. DT es una toxina extremadamente potente para el que la entrada de una sola molécula en una célula puede ser letal. DT se ha dirigido a las células cancerosas mediante la supresión del dominio de células de unión al receptor y la combinación de la porción catalítica restante con la orientación proteínas que se unen selectivamente a la superficie de las células cancerosas. Se ha supuesto que "receptorless" DT no se puede unir a y matar a las células. En el presente estudio, mostramos que "receptorless" DT385 recombinante es, de hecho citotóxico a una variedad de líneas celulares de cáncer.
Métodos
in vitro
citotoxicidad de DT385 era medida por la proliferación celular, la tinción de células y ensayos de apoptosis. Para
in vivo
estudios, se utilizó el sistema de membrana corioalantoidea de pollo (CAM) para evaluar el efecto de DT385 sobre la angiogénesis. El sistema de CAM y modelo de ratón se utilizó para evaluar el efecto de DT385 en HEp3 y carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) el crecimiento del tumor, respectivamente.
Resultados
De 18 líneas celulares de cáncer humano a prueba, 15 se vieron afectados por DT385 con IC
50 que van desde 0.12-2.8 M. Además, altas concentraciones de DT385 fallaron a afectar a las células de crecimiento detenido. La toxicidad celular de DT385 era debido a la inhibición de la síntesis proteica y la inducción de apoptosis.
In vivo
, DT385 disminuido la angiogénesis y la disminución del crecimiento de tumores en el sistema CAM, e inhibió el crecimiento de los tumores subcutáneos LLC en ratones.
Conclusión
posee DT385 antiangiogénico y la actividad anti-tumor y puede tener potencial como agente terapéutico
Visto:. Zhang y, Schulte W, Rosa D, Phipps K, Zijlstra a, Lewis JD, et al. (2010) La sensibilidad de las células cancerosas para truncado la toxina diftérica. PLoS ONE 5 (5): e10498. doi: 10.1371 /journal.pone.0010498
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Noviembre, 2009; Aceptado: 14 de abril de 2010; Publicado: 5 Mayo 2010
Derechos de Autor © 2010 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación de Investigación de la Salud de Nueva Escocia (NSHRF). YZ es apoyado por una beca del Programa de Formación de Investigación del Cáncer de la Universidad de Dalhousie. JDL es apoyada por la concesión#018176 de la Fundación NCIC /Terry Fox. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
toxina de la difteria (DT) se sintetiza en
Corynebacterium diphtheriae
como una enzima de una sola cadena de 535 aminoácidos con un peso molecular de 63.000 [1], [2]. DT consiste en tres dominios principales: el amino terminal C, o catalíticos, de dominio (residuos 1-186); la T intermedio, o transmembrana, dominio (residuos 202-381); y el carboxilo-terminal R, o de unión al receptor, de dominio (residuos 391-535). El dominio catalítico está conectado al dominio T por un bucle rico en arginina y un puente disulfuro fácilmente reducible (que une C186 a C201). DT se ha demostrado que entrar en las células de mamífero sensible a la toxina mediante endocitosis mediada por receptor que implica la interacción del dominio de unión al receptor de la proteína con un precursor de la superficie celular de transmembrana del factor de crecimiento similar al factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina [3] , [4]. Después de la unión a este receptor de superficie celular, DT se endocitosis y el tráfico de un compartimiento vesicular ácido, donde se somete a un pH-dependiente conformacional cambio, la escisión y liberación del dominio catalítico. El dominio T se inserta en la membrana vesicular y el canal resultante se utiliza para la translocación del dominio catalítico al citosol. Allí, la subunidad catalítica cataliza la ribosilación de ADP del factor de elongación 2, dando como resultado la inhibición de la síntesis de proteínas y la muerte celular (revisado en [5]).
se han producido una serie de proteínas truncadas, recombinantes DT en el que el dominio de unión al receptor ha sido genéticamente sustituidos por ligandos que pueden dirigirse selectivamente a las células malignas. Estas proteínas de fusión representan una nueva clase de agentes citotóxicos que, a diferencia chemotherapeuticDT se ha demostrado que entrar en las células de mamífero sensible a la toxina mediante endocitosis mediada por receptor que implica la interacción del dominio de unión al receptor de la proteína con fármacos, matar las células diana mediante la inhibición síntesis de proteínas y de ese modo la inducción de la apoptosis [6]. Estas proteínas de fusión incluyen DT508-MSF [7], DT486-IL-2 [8], DT486-GM-CSF [9], DT390-IL3 [10], DT388-GM-CSF [11] - [13], DT388 -IL-3 [14], [15], DT385-VEGF [16], [17] y DT388 combinada con el dominio ATF de UPA [18]. Entre los fármacos resultantes, DT388IL-3 ha mostrado alguna promesa en ensayos clínicos [19], [20], mientras que el DT389-IL-2 recombinante de la toxina (DAB389-IL-2, Diftitox Denileukin-Ontak) ha sido aprobado por la FDA para uso clínico en el linfoma de células T cutáneo etapa avanzada (revisado en [21] - [23]
es ampliamente aceptado que la eficacia de las proteínas de fusión DT reside en la capacidad del componente de ligando de direccionamiento a. dirigir la DT a las células cancerosas que resultan en la toxicidad celular selectiva. por otra parte, se espera que la eliminación del dominio de unión al receptor de la DT para dar lugar a una DT truncado que no es capaz de interactuar con su receptor en la superficie de las células eucariotas y, por tanto, incapaz de unirse y para matar las células. Este concepto ha sido reforzada por el informe que el DT truncada (DT385) no es citotóxica [16].
En el presente estudio, mostramos que, contrariamente a los informes anteriores, el DT truncada recombinante , DT385 es citotóxico para muchas células cancerosas. también se observó que DT385 inhibe el crecimiento de tumores humanos y de ratón. Nuestros resultados establecen la eficacia de DT385 como agente antitumoral potencial.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares
Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se obtuvieron de Aplicaciones Móviles, Inc. y se cultivan en un medio de crecimiento de células endoteliales con suplementos completos de crecimiento (Cell Applications, Inc.). Se obtuvieron células de la arteria pulmonar bovina endoteliales (BPAEC) y células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC) de Lonza y se cultivaron en un medio EBM más EGM SingleQuots de suplementos de crecimiento y EBM-2 medio más EGM-2 SingleQuots de suplementos de crecimiento (Lonza) , respectivamente. líneas celulares de glioma U-87 MG y U251 fueron amablemente ofrecen por el Dr. V. Wee Yong (Universidad de Calgary, Calgary, Alberta, Canadá). La línea celular de carcinoma epidermoide humano HEp3 fue un generoso regalo del Dr. Andries Zijlstra (Universidad de Vanderbilt, EE.UU.). Se aislaron células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) de embriones de ratón y se utilizaron a sus primeros pasajes (menos de paso 4). U-87 células MG, U251, HEp3 y MEF se cultivaron en DMEM que contiene 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS, Invitrogen) y 1% de penicilina-estreptomicina mezclas (Invitrogen). Todas las demás líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) y se cultivaron en DMEM, MEM o RPMI (Invitrogen) que contiene mezclas de penicilina-estreptomicina 10% (v /v) de suero bovino fetal y 1% de acuerdo con las instrucciones de la ATCC. Todas las células se cultivaron en una incubadora a 37 ° C que contiene 5% de CO2. Todas las células endoteliales y células de fibroblastos primarios fueron mantenidos y utilizados antes del noveno paso.
Inducción y purificación de proteínas recombinantes
El plásmido pET17b-DT385 expresando "receptorless" DT385 fue proporcionado generosamente por el Dr. Sundaram Ramakrishnan (Departamento de Farmacología de la Universidad de Minnesota Medical School, Minneapolis, MN). El plásmido pET17b-p22 se construyó por clonación p22 fragmento de plasminógeno humano en pET17b (Merck Biosciences) en los sitios de restricción NdeI y BamHI. El plásmido pLIC-DT385-p22 se construyó por clonación del plasminógeno fragmento p22 humano en el plásmido pLIC-DT385 en los sitios de restricción NcoI y HindIII, mientras que el plásmido pLIC-DT385 se construyó insertando el ADN que codifica DT385 pero que carecen del codón de parada en el pET -30 EK /vector LIC siguiendo el protocolo del fabricante (Novagen). El pSUMO plásmido que codifica el ADNc para SUMO (pequeño modificador relacionados con ubiquitina, Saccharomyces cerevisiae, el gen Smt3) fue proporcionado amablemente por el Dr. Kaisong Zhou (Universidad de Dalhousie). Todas las construcciones de plásmidos se confirmaron por secuenciación de ADN (DalGEN, la instalación de secuenciación de ADN Dalhousie University). p22 recombinante, SUMO, DT385, y DT-p22 se expresaron en
E. coli
y se purificó por columna de afinidad Ni-NTA (Qiagen), se agruparon y se dializaron durante la noche frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS). Todas las proteínas recombinantes se purificaron como una única banda como se revela por análisis de SDS-PAGE. LPS fue retirado de proteínas purificadas usando perlas de polimixina B (Detoxi-Gel Gel Extracción de endotoxina, Pierce) según las instrucciones del fabricante. Múltiples pasos a través de la columna se llevaron a cabo hasta que el nivel de LPS fue de menos de 30 UE
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se evaluó por la célula Titer96 acuoso Una célula de soluciones Ensayo de proliferación (ensayo de MTS /mg. -Promega) usando el protocolo del fabricante. El IC
50 valores se calcularon mediante ajuste no lineal de las curvas de dosis-respuesta utilizando el código abierto programa de ordenador PARCELA QTI mínimos cuadrados. Los datos fueron analizados con el de cuatro parámetros logísticos ecuación f = (a - d) /[1 + (x /c) b] + d, donde
a
es la máxima asintótica,
b
es un parámetro de la pendiente,
c
es el valor en el punto de inflexión (IC
50) y
d
es el mínimo asintótica. Para un control, 0,4 M o 1,2 M DT385 se añadió al medio de cultivo de tejidos en ausencia de las células seguido de incubación con el reactivo MTS /PMS. La reducción de MTS no se observó en estas condiciones, lo que confirma que DT385 no interfirió con este ensayo.
Crystal violeta mancha
La proliferación celular también se evaluó con tinción con cristal violeta. Al final del tratamiento con DT385, las células se fijaron con metanol al 100%, y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta en metanol al 20% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células teñidas se fotografiaron a 25 × magnificación en un Zeiss Axiover 200 microscopio invertido (Carl Zeiss, Alemania).
apoptosis y necrosis Ensayo
apoptóticas y células necróticas se visualizaron con el ensayo de apoptosis y necrosis kit (Biotium, Inc) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células teñidas se fotografiaron en un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan II (Carl Zeiss, Alemania), con ajustes de filtro apropiados para isotiocianato de fluoresceína (FITC) y la fluorescencia de Texas Red. Las imágenes digitales fueron procesadas en Adobe Photoshop (Adobe Inc.).
Proteína Ensayo de síntesis de
U-87 células MG o Hela se sembraron en una relación de 1:10 en 1 ml de DMEM más 10% de FBS por pocillo en una placa de 12 pocillos durante la noche. Las células se trataron con 1 M DT385 durante el tiempo indicado, se incubaron durante 15 minutos a 37 ° C con 0,5 ml de medio de etiquetado (DMEM libre de metionina, 10% de FBS dializado y 50 a 100 Ci Pro-Mix L - [
35 -S] - (Amersham)) y los lisados celulares se analizaron por SDS-PAGE. bandas radiactivas se visualizaron mediante radiografía usando un PhosphorImager después de la exposición durante toda la noche en una pantalla de fósforo. Para la cuantificación, [
35S] incorporación se midió por recuento de centelleo líquido.
membrana corioalantoidea de pollo (CAM) ensayo de angiogénesis
La actividad antiangiogénica de proteínas fue probado en el CAM se describe [24]. Al analizar la vascularización inducida por tumor, 50.000 células HEp3 reemplazados bFGF /VEGF como el estímulo angiogénico [25]. Cuatro implantes se colocaron en cada CAM y diez embriones se utilizaron para cada compuesto experimental.
CAM crecimiento tumoral ensayo
células tumorales
HEp3-GFP (100.000 células /10 l medio DMEM) se aplicaron directamente a una zona erosionada filtro de disco de la CAM de 9 días de edad embriones de pollo como se detalla por [26]. Los pollos fueron incubadas en condiciones normales hasta el día 15 cuando los tumores se obtuvieron imágenes y clasifican para la distribución al azar para el control y grupos de tratamiento. Diarias inyecciones intravenosas sistémicas de DT385 (2 g en 50 l de PBS) o PBS (50 l) se realizaron en días 15, 16 y 17. El día 18, los tumores se extirparon, se limpian de la CAM y posteriormente se pesa. Como alternativa, se obtuvieron imágenes fluorescentes tumores (GFP) HEP3
in vivo
utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia Zeiss Lumar. El contorno del tumor se determinó utilizando la señal de fluorescencia de las células tumorales (canal GFP (EX470 /em525)). Específicamente, software Volocity se calibró para seleccionar zonas con intensidad de fluorescencia correspondiente a 1 o más desviaciones estándar por encima de fondo. El área del tumor se definió y se calculó utilizando el software Improvisación Volocity (Perkin Elmer, Inc.) (Versión 5.3.0 Build 0). Una unidad de medida (1 mm) se calibró usando la cuadrícula de un hemocitómetro. La determinación del volumen del tumor asume la forma de ser hemiellipsoidal y la ecuación para el volumen del tumor es: V = π /6 • (longitud) • (ancho) • (altura) donde la altura = 1.63√ (Longitud • Anchura). Los datos fueron analizados mediante t de Student.
Ratón modelo de tumor
Todo el trabajo con animales se llevó a cabo en las instalaciones de animales de la Universidad de Dalhousie en conformidad con las directrices establecidas en el cuidado y uso de Animales de laboratorio de la Universidad de Dalhousie. Todas las investigaciones fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación de Animales de Dalhousie. Se han usado Mujer 6 a 8 semanas de edad ratones C57BL6 /J (Jackson Laboratories). Los tumores se indujeron por inyección subcutánea de células LLC (10
6 células) en 100 l de PBS estéril. tumores palpables se establecieron tres a cuatro días después de la inyección, momento en el que los ratones se asignaron aleatoriamente a dos grupos experimentales, los que recibieron SUMO recombinante (control) y los que recibieron tratamiento DT385 recombinante. SUMO y DT385 se administraron a los ratones, peritumoralmente en días 5 (25 g en 100 l de PBS), y al día 9, 12 y 15 (10 g en 100 l de PBS cada inyección).
Labeling proteína con FITC
DT385 y BSA fueron marcados con FITC usando el EZ-marcador FITC kit de marcaje de proteínas siguiendo el protocolo del fabricante (Pierce).
se incubaron los estudios de lavado cloruro de amonio
células U87 en ausencia o presencia de DT385 (2 M) solo o en combinación con cloruro de amonio 10 mM. Se retiró el medio en diversos puntos temporales y se reemplaza con medio fresco. Treinta y seis horas después de la adición de compuestos de ensayo, la viabilidad celular se midió mediante el ensayo de MTS.
Análisis estadístico
Se determinó la significación de los datos mediante la prueba t de Student (de una cola ). Los valores de p & lt; 0,05 se considera como significativa
Resultados
Caracterización de DT385
Estudios recientes de nuestro laboratorio identificado y caracterizado un nuevo fragmento de plasminógeno antiangiogénico llamado p22 [. ,,,0],27]. Desde p22 era un inhibidor potente y específico de células endoteliales capilares, se prevé que esta proteína podría ser utilizada para combatir DT a la vasculatura de formación reciente. Hemos expresado una proteína de fusión en
E. coli
en el que p22 fue sustituido por el dominio de unión al receptor de DT (DT385-p22). La actividad de esta proteína de fusión se comparó con DT385 recombinante y p22 recombinante. Para determinar el impacto de estos compuestos sobre la viabilidad celular, ensayos de MTS se realizaron en células bovinas pulmonares endoteliales de la arteria (BPAEC) después de un tratamiento de tres días. Curiosamente, se observó que a diferencia de la p22 preparado por la digestión proteolítica de plasminógeno humano [27], el p22 recombinante no inhibir la viabilidad de la BPAEC (Figura 1A). Por desgracia no hemos sido capaces de producir p22 recombinante activa en
E. coli
o levadura (datos no mostrados). De particular interés fue nuestra observación de que tanto el constructo DT385-p22 recombinante y DT385 recombinante disminuyó drásticamente el número de BPAEC viable. Se determinó una IC
50 valor de 0,21 M y 0,14 M para DT385-p22 y DT385 respectivamente (Tabla 1).
p22 recombinante, (expresada a partir de pET17b-p22), DT385 (expresada a partir de pET17b- DT385), DT385-p22 (expresada a partir de pLIC-DT385-p22), (ver Materiales y Métodos) o un volumen equivalente de PBS (control) se incubaron con (A) BPAEC, (B) Hela y las células HT1080, y (C ) las células HUVEC y HDMEC en medios de cultivo durante tres días. Después de la incubación de tres días, el número de células viables se cuantificaron mediante el ensayo de MTS. El control del vehículo PBS se consideró como 100% viable. Los resultados se expresan como porcentajes de células tratadas con PBS. Los resultados son la media ± S. D. de 3 experimentos independientes realizados por triplicado (n = 9).
Dado que la actividad de p22 recombinante se inactiva la actividad mientras que DT385-p22 retenido, no estaba claro a partir de estos resultados si p22 podría haber retenido cuando se expresa como la proteína de fusión, DT385-p22. Teniendo en cuenta la especificidad de p22 de plasminógeno derivado de células endoteliales, esperábamos que si el componente p22 de la proteína de fusión DT385-p22, a continuación, DT385-p22 sólo debe dirigirse a las células endoteliales y no las células de cáncer, como se ha demostrado para p22 de plasminógeno derivado de [27]. Por lo tanto, a prueba la actividad citotóxica de DT385-p22 y DT385 con líneas celulares de cáncer. Para estos experimentos se probó inicialmente dos líneas celulares de cáncer humano de uso común, la célula de fibrosarcoma HT1080 y la célula de carcinoma cervical HeLa. Inesperadamente, encontramos que DT385 causó una pérdida dramática de la viabilidad celular de las líneas celulares de cáncer de una manera dependiente de la dosis (Figura 1B). A la dosis más alta ensayada (2,4 mM), 10% de las células Hela viables se mantuvo, mientras que alrededor del 50% de las células HT1080 viables se mantuvo. DT385-p22 también causaron una pérdida de la viabilidad celular, pero fue menos potente que DT385. Para determinar si la viabilidad de las células endoteliales humanas se vio afectada por DT385-p22, se incubaron HUVEC y HDMEC con estas proteínas (Figura 1C). Sorprendentemente, la viabilidad de las dos líneas celulares no se vio afectada por DT385, D385-p22 o p22 en la concentración de hasta 2,5 M. Hemos ampliado el tiempo de incubación de 7 días con 2,4 M de estas proteínas recombinantes, y no se observó pérdida de viabilidad celular (Figura S1, A). Sin embargo, con concentraciones muy altas de DT385, la pérdida de viabilidad de las HUVEC y HDMEC se observó (Figura S1, B). Se determinó un IC
50 de alrededor de 5,77 y 7,54 M para el DT385 HUVEC y HDMEC, respectivamente. Estos resultados sugieren que la actividad citotóxica de DT385-p22 era debido a la actividad del dominio DT385 de la proteína de fusión y no el dominio p22. También concluimos que DT385 puede matar las células cancerosas humanas en una concentración que no afecta a las líneas de células endoteliales primarias. La observación de que DT385 tenía actividad citotóxica fue novedosa e inesperada. Por ello, investigó la posibilidad de que DT385 podría matar a otras células cancerosas.
Los efectos citotóxicos de DT385 en líneas celulares de cáncer de
Hemos extendido el ensayo de citotoxicidad de 18 líneas celulares de cáncer humano (Tabla 1). Quince líneas celulares de cáncer se vieron afectados por DT385 y eficacia de DT385 variaron entre las células cancerosas. líneas celulares de cáncer con mayor sensibilidad a DT385 (IC
50 menos de 0,5 M DT385), incluidas las células U-87 MG, U251, 293T, HEK293, Hela y Calu-3. El grupo con sensibilidad intermedia a DT385 (IC
50 entre 0,5 a 1,5 M) incluye COLO201, Colo205, LNCaP, PC-3, HT1080, y las células MDA-MB-231. Débilmente líneas celulares de cáncer sensibles con CI
50 superior a 1,5 M incluyen MCF7, HCT116, BT-20, NB4, HL-60, y las células HEp3. Por el contrario, p22 recombinante no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular a concentraciones tan altas como 2,4 M (datos no mostrados). Las tres líneas celulares de cáncer humano no afectadas por DT385 a la dosis más alta probada (2,4 M) fueron las líneas celulares de leucemia promielocítica (HL-60 y NB4) y la línea celular de carcinoma epidemoid (HEp3).
El DT385 pérdida mediada de la viabilidad celular también se confirmó mediante tinción con cristal violeta (Figura 2). Por ejemplo, menos de 10% de glioma U-87 MG células permaneció tras el tratamiento DT385. Para confirmar la sensibilidad de las especies cruzadas para DT385, probamos la piel de melanoma de ratón (B16-F10), carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) y las células de ratón fibroblastos embrionarios (MEF). Mientras que la B16-F10 y MEF fueron altamente sensibles a la DT385, la LLC fueron sólo débilmente sensible (Tabla 1). En conjunto, los datos de los ensayos de MTS y tinción con cristal violeta indican que el "receptorless" DT, DT385, de hecho puede ser citotóxicas para muchas líneas de células tumorales. El mecanismo molecular que da cuenta de la amplia gama de sensibilidad a DT385 está actualmente bajo investigación.
Varias líneas celulares de cáncer fueron cultivadas con DT385 2 M o p22 recombinante (RP22) durante 3 días. Las células fueron teñidas con cristal violeta como se describe en Materiales y Métodos y se obtuvieron imágenes a 25 × magnificación con un Zeiss Axiover 200 microscopio invertido (Carl Zeiss, Alemania).
Los efectos citotóxicos de DT385 sobre otra líneas de células primarias
Para evaluar la citotoxicidad de DT385 en otras líneas celulares primarios, los cultivos primarios de tres líneas celulares de fibroblastos humanos (CCD-1064Sk, BJ, y IMR-90) y una línea celular de monocitos (SC) eran incubaron con concentraciones crecientes de DT385 y la viabilidad celular se determinó por el ensayo de MTS. CCD-1064Sk y fibroblastos BJ tenían un CI
50 de 2,22 M y 2,37 M DT385, respectivamente. Los fibroblastos de pulmón (IMR-90) tenían un IC
50 de 1,44 M y la viabilidad de los monocitos (SC) no fue afectado por DT385 a concentraciones de hasta 2,4 M (Tabla 1). Una vez más, p22 recombinante no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular a concentraciones de hasta 2,4 M (datos no mostrados). En contraste, cuando confluente CCD-1064Sk, BJ y IMR-90 fibroblastos fueron tratados durante 3 días con 2 M DT385, se observó ninguna pérdida significativa de la viabilidad celular (Figura S2). Estos datos indican que incluso cuando DT385 es eficaz en la disminución de la viabilidad de la proliferación de células primarias, falla para matar estas células cuando están en reposo /confluente. Tomados en conjunto, estos datos apoyan nuestra conclusión anterior de que DT385 único que tiene el potencial para matar las células de cáncer con efectos mínimos sobre las células primarias.
Para determinar si la resistencia a DT385 podría superarse mediante incubación continua, las células con débil o no detectable sensibilidad recibió una segunda dosis, 48 horas después del primer tratamiento y la viabilidad celular se midió 2 días más tarde. La línea celular de carcinoma epidermoide humano, HEp3 y línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 ambos mostraron una sensibilidad mejorada con incubación continua con DT385. En comparación con una sola aplicación de DT385, que no afecta a las células HEp3 significativamente, dos aplicaciones de DT385 disminuyó la viabilidad celular (IC
50 de 2,07 M (Figura S3). Del mismo modo, la IC
50 para el cáncer de mama línea celular, MDA-MB-231 se redujo de 1,02 M a 0,66 M en una segunda incubación con DT385 (Tabla 1). En contraste, una segunda incubación con DT385 fue sin efecto para las células endoteliales primarias, HUVEC o HDMEC (Figura S3) . Tomados en conjunto, los resultados muestran que receptorless DT en forma de DT385 es citotóxico a un gran número de células tumorales. Mientras que la sensibilidad a la DT385 varía, la exposición continua disminuye la viabilidad de incluso las líneas de células de cáncer más resistentes.
mecanismo de acción de DT385
DT mata a las células por un mecanismo que implica la apoptosis celular. también se observó aumento de la apoptosis en las células tratadas DT385 (Figura 3). La incubación de culta T-87 con DT385 dio lugar a una dramática aumento de la apoptosis celular, medida por un aumento en la tinción de anexina V (85%) y la captación de homodímero de etidio (87%).
(a), U-87 MG células creciendo en una cámara de 8- bien diapositivas fueron tratados con 1,2 M DT385, o control (PBS), respectivamente, durante 3 días. Después de los tratamientos, se tiñeron las células para la apoptosis se evaluó con integridad de la membrana de la célula anexina V. marcado con FITC con homodímero de etidio III (ETD-III). se muestran imágenes representativas (100 × aumentos). El
flecha
indica células que fueron etiquetados con ambos tintes fluorescentes. (B), representación gráfica de (A). El número de células por campo de alta potencia (HPF, × 400) fue la media del número de células obtenido a partir de 5 HPF azar. células separadas, que se tiñeron con tanto anexina V y ETD-III positivo, también se incluyeron en la determinación del número de células. Los resultados son la media ± S. D. de 3 experimentos.
DT se ha demostrado que entrar en las células de mamífero sensible a la toxina mediante endocitosis mediada por receptor que implica la interacción del dominio de unión al receptor de la proteína con su receptor extracelular. Desde DT385 no posee un dominio de unión al receptor, debería ser incapaz de unirse a las células y ser internalizada. Para investigar si DT385 se internaliza, nos devolvió la etiqueta fluorescente DT385 con microscopía confocal. Las células tumorales sensibles a DT385 se incubaron con FITC-DT385 y la imagen con el microscopio confocal. Como se muestra en la figura 4A, la incubación de las células con DT385 dio como resultado la internalización de la toxina, que era detectable en vesículas perinuclear. En contraste, la incubación de las células con concentraciones similares de albúmina de suero bovino FITC-no dio como resultado la internalización de la proteína (Figura S4). Este experimento sugirió que la absorción de DT385 por las células no fue debido a la captación celular no específica de la proteína.
(A), se cultivaron células de cáncer en un porta con cámara de 8 pocillos. Se añadió marcado con FITC DT385 (1 M) a la cultura. Se observaron las células y se fotografiaron bajo un Zeiss LSM 510 microscopio de fluorescencia confocal (Carl Zeiss, Alemania) después de 36 h. lados superior y derecho de las imágenes demuestra la vista ortogonal del conjunto de datos confocal se muestra en la x y el eje Y de imágenes. Aumentos se indican debajo de las imágenes. (B), las células U87 se incubaron con 2 DT385 mu M solo o en combinación con 10 mM NH
4Cl durante los tiempos indicados. a continuación, se sustituyó el medio y las células se cultivaron durante un tiempo total de 36 horas después de lo cual se accedió a la viabilidad celular con el ensayo MTS. El control del vehículo PBS se consideró como 100% viable. Los resultados se expresan como porcentajes de células tratadas con PBS. Los resultados mostrados son representativos de 2 experimentos independientes realizados por triplicado.
El cloruro de amonio es una base débil que se difunde en el endosoma y sirve como un depósito de protones, inhibiendo así la acidificación del endosoma. Hemos utilizado el tratamiento de cloruro de amonio de las células para investigar si DT385 entró en la célula por endocitosis. Hemos observado que la incubación de células U87 con DT385 para tan poco como 2 horas, produjo una muerte celular significativa (Figura 4B). Sin embargo, la adición simultánea de cloruro de amonio y DT385 abrogada la actividad citotóxica de DT385. La observación de que el cloruro de amonio bloqueó la actividad citotóxica de DT385 sugiere que DT-385 entra en las células a través de una vía endocítica ácido.
toxina de la difteria mata a las células por la catálisis de la ADP-ribosilación de EF-2, lo que lleva a la inhibición de proteínas la síntesis de [5], [28]. Para investigar si el DT385 disminución de la viabilidad celular mediante la inhibición de la síntesis de proteínas, de glioma U-87 MG células se trataron con 1 M DT385 durante 36 horas seguido de marcaje con metionina [35S
] durante 15 minutos. Como se muestra en la Figura 5A, el análisis SDS-PAGE de lisado de células mostró que la síntesis de proteínas se redujo severamente en células DT385 tratados. Esta inhibición se produjo dentro de las 24 horas de tratamiento y persistió durante la duración del ensayo (48 hr) (Figura 5B). El tratamiento de 36 h dio la mayor disminución en el etiquetado de proteínas. Estos datos sugieren que, mecánicamente, DT385 disminuye la viabilidad celular mediante el bloqueo de la síntesis de proteínas. Se obtuvieron resultados similares para las células HeLa (datos no mostrados).
(A), U-87 MG células se trataron con DT385 1 M o control (ya sea RP22, SUMO o PBS) durante 24, 36 h y 48 h, respectivamente, y luego marcadas con [
35S] metionina durante 15 minutos. Los lisados celulares (10 g) se separaron por SDS-PAGE (12% gel) y los geles se tiñeron con azul Coomassie (izquierda), se secaron sobre papel Whatman y se visualizaron por radiografía usando un PhosphorImager (derecha). se muestran imágenes representativas de 36 h de tratamiento. (B), la cuantificación de (A). La radiactividad de los lisados de células se determinó por recuento de centelleo líquido. Los datos se expresan como porcentaje de control. La media de CPM de proteína irrelevante, RP22 o SUMO recombinante o el tratamiento de PBS se consideró como el valor de control de la RPC. Los resultados son la media ± S. D. (N = 6, 2 experimentos independientes). La viabilidad celular se midió también como se describe en la leyenda de la Figura 1. Los resultados son la media ± S. D. de tres experimentos independientes realizados por triplicado.
Chick ensayo de membrana corioalantoidea
La progresión y la metástasis de la enfermedad neoplásica requiere una amplia vascularización del tumor para sostener las demandas nutricionales y oxígeno de la proliferación Células cancerígenas. Esto se logra generalmente a través de un proceso llamado angiogénesis [29]. El ensayo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM) es un
sistema útil in vivo
modelo para investigar los efectos de las toxinas en la angiogénesis. Como se muestra en la Figura 6A, DT385 a una concentración de 40 nM (1,2 pmol en 30 l) causada inhibición completa de la inducida por HEp3 germinación vascular (angiogénico). Esta concentración es muy por debajo de la IC
50 de las células tumorales y por lo tanto un efecto directo de DT385 en HEp3 viabilidad es poco probable.
(A), se utilizaron células HEp3 para estimular la angiogénesis en la CAM. control de PBS sin células HEp3 indica el nivel básico de la angiogénesis. La angiogénesis, en la presencia de células HEp3 y en ausencia o presencia de DT385 recombinante o proteína de control recombinante (SUMO) se analizó. Los resultados son la media ± S. E. de 80 puntos de datos de dos ensayos replicados * P & lt; 0,05 (t de Student). (B), DT385 disminuyó significativamente el crecimiento del tumor. el crecimiento del tumor HEp3 en el sistema de CAM se evaluó como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados son la media ± S. E. Los valores medios de los tumores para los tratamientos DT385 o de control fueron 13,88 ± 1,56 mg (media ± S.E .; n = 23) y 23,33 ± 4,3 mg, (media ± S.E .; n = 12), respectivamente, p = 0,012. (C), DT385 disminuyó significativamente el volumen del tumor. el volumen del tumor HEp3 en el sistema de CAM se evaluó como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados son la media ± S. E. Los valores promedio de tamaño del tumor para tratamientos DT385 o de control fueron 8,86 × 10
9 ± 2,42 m
3 (media ± SE, n = 18) y 2,97 × 10
9 ± 0,49 m
3 (media ± sE, n = 8). respectivamente, p = 0,02
Para investigar si DT385 podría reducir el crecimiento del tumor, tumores HEp3 se hicieron crecer en la CAM y los tumores de edad de 6 días fueron tratados a continuación, con 2 g de DT385 inyectaron por vía intravenosa diariamente durante tres días.