Extracto
El gen regulador mundial especial rica en AT secuencia de unión que se ha informado de inducir cambios EMT-like y estar asociada con un mal resultado clínico en varios tipos de cáncer proteína-1 (SATB1). Este estudio tiene como objetivo evaluar si SATB1 afecta a los comportamientos biológicos de carcinoma de células transicionales de vejiga (BTCC) y dilucidar si este efecto funciona a través de una vía de transición (EMT) epitelio-mesenquimal. La expresión de SATB1, E-cadherina (marcadores epiteliales), vimentina (marcadores mesenquimales) en los tejidos BTCC y tejidos no cancerosos adyacentes, así como en dos líneas celulares de cáncer de vejiga se investigaron. Si la expresión SATB1 se asocia con factores clínico-patológicos o no se analizó estadísticamente. invasión y migración celular, el ciclo celular, la proliferación celular y la apoptosis se evaluaron en SATB1 desmontables y líneas celulares sobreexpresados. Nuestros resultados mostraron que la expresión de SATB1 fue notablemente regulada up-tanto en tejidos BTCC y en líneas celulares de cáncer de vejiga con un alto potencial de metástasis. Los resultados también se asociaron con marcadores de EMT y mal pronóstico de los pacientes BTCC. Por otra parte, SATB1 inducida por los procesos de regulación a la baja de la EMT a través de E-cadherina, la regulación positiva de represores E-cadherina (caracol, barra y vimentina). SATB1 también promovió la progresión del ciclo celular, la proliferación celular, la invasión celular y la migración celular, pero no alteró la supervivencia celular. En conclusión, nuestros resultados sugieren que SATB1 juega un papel crucial en la progresión del cáncer de vejiga mediante la regulación de los genes que controlan los procesos de EMT. Además, puede ser una diana terapéutica novedosa para los cánceres de vejiga agresivos
Visto:. Wan F, Cheng C, Wang Z, Xiao X, Zeng H, Xing S, et al. (2015) La sobreexpresión SATB1 regula el desarrollo y la progresión de cáncer de vejiga a través de la EMT. PLoS ONE 10 (2): e0117518. doi: 10.1371 /journal.pone.0117518
Editor Académico: Neil A. Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 7 Agosto, 2014; Aceptado: December 26, 2014; Publicado: 23 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Wan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
financiación:.. los autores no recibieron ninguna financiación específica para este trabajo
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga (BC) es una de las neoplasias malignas más comunes que afectan a la mucosa de la vejiga urinaria, con un estimado de 386,300 nuevos casos y 150.200 muertes por la enfermedad en todo el mundo, por año [1]. En China, se ha informado de que BC es la neoplasia maligna más común genitourinario, y la incidencia de esta enfermedad se ha aumentado en las últimas décadas [2]. Debido a la alta recurrencia local del tumor, la progresión y metástasis a distancia, los pobres resultados clínicos se ha demostrado en los pacientes antes de Cristo, a pesar de las grandes mejoras en las técnicas quirúrgicas y terapias adyuvantes [3-6]. Mientras tanto, las vías complicadas durante la oncogénesis y el comportamiento biológico impredecible de cáncer son aún poco conocidos y están afectadas por factores ambientales y genéticos [7]. Por lo tanto, es necesaria la identificación de nuevos marcadores moleculares que podrían servir como factores pronósticos estándar para el diagnóstico precoz y para el desarrollo de un tratamiento más eficaz para pacientes con CM.
Ha sido generalmente reconocido que mal pronóstico de los tumores malignos se asocia con la agresividad del tumor. Esto se produce cuando las células no invasivas se convierten en invasoras a través de varios pasos metastásicos, tales como las células epiteliales perder polaridad y aún más la invasión vascular y compartimentos linfáticos [8]. La transición epitelio mesenquimal (EMT) es el proceso clave que se produce inicialmente durante las fases críticas del desarrollo embrionario en el que las células pierden sus características epiteliales y los contactos célula-célula, y adquirir de forma concomitante propiedades migratorias e invasivas de las células mesenquimales [9-11]. Además, los procesos de EMT-como similares podrían producirse durante la progresión del tumor en carcinomas y tienen un papel en la prevención de la promoción de la apoptosis y senescencia de las células tumorales, lo que contribuye a la inmunosupresión [12]. La pérdida de expresión de E-cadherina es un sello distintivo del proceso de EMT [9]. Una vez más, en los últimos estudios, los factores de transcripción tales como caracoles y babosas se han identificado como represores directos de E-cadherina e inductores de la EMT, que provoca más técnicos de emergencias médicas completas, tanto a nivel morfológicas y de comportamiento cuando se sobreexpresa en las células epiteliales [13-15] . Además, un creciente cuerpo de evidencia sugiere que la EMT juega un papel fundamental en el inicio y desarrollo de metástasis durante la invasión tumoral y la progresión del cáncer de vejiga
in vivo
y
in vitro
[16 -18].
especial rica en AT proteína de unión 1 (SATB1) es una región de unión de la matriz nuclear (MAR) de unión a ADN de proteína que actúa como un organizador de genoma y el regulador de genes a través de la modulación de la conformación espacial de la cromatina. También participa en una variedad de procesos biológicamente importantes, tales como la proliferación, la diferenciación, la apoptosis y la reprogramación de los perfiles de expresión [19-21]. En estudios recientes, la regulación al alza de SATB1 se ha encontrado que se correlaciona con la invasión y la metástasis de muchos tipos de lesiones malignas, incluyendo cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer rectal, cáncer de hígado, y cáncer de próstata. Estos hallazgos sugieren que SATB1 es un factor pronóstico independiente y una posible diana terapéutica en los cánceres humanos [21-26]. Por ejemplo, Han et al encontró que SATB1 agotamiento podría revertir el proceso de EMT a través de la baja regulación de represores E-cadherina como Caracol y SIPI y la regulación al alza de E-cadherina en (MDA-MB-231) células de cáncer muy agresivo [21] . Otro estudio informó que la supresión quimioterapéutico de miR-448 aumenta los niveles de mRNA de SATB1 y promueve la EMT. Estos resultados proporcionan nuevos enfoques terapéuticos potenciales para el cáncer de vejiga.
Mientras carcinoma de células transicionales de vejiga (BTCC) es uno de los subtipos más comunes de AC, el conocimiento actual sobre el mecanismo específico de BTCC invasión y metástasis es todavía limitada. En un estudio reciente, Bin Han et al encontró que SATB1 se sobreexpresa en el cáncer de vejiga humana y se asocia con el grado del tumor y el estadio. Además, también encontraron que SATB1 agotamiento disminución de la proliferación celular y el aumento de la apoptosis celular en 5637 y las células T24 [27]. Sin embargo, la forma en la expresión de SATB1 afecta el comportamiento biológico del BTCC y si SATB1 induce la EMT en el cáncer de vejiga es todavía sin explorar. En este estudio, se evaluó la expresión de SATB1 en muestras de BTCC y líneas celulares de cáncer de vejiga, aunque la tinción inmunohistoquímica, Real-Time RT-PCR ensayos y análisis Western Blot y encontró que su expresión se correlaciona con las características clínico patológicas. En líneas celulares de cáncer de vejiga humana establecidos, hemos demostrado, además, que sobreexpresa o silenciada SATB1 regula la migración celular, invasión y proliferación, junto con el ciclo celular.
Materiales y Métodos
Materiales
los especímenes de cáncer de vejiga primaria y tejidos no cancerosos emparejados se obtuvieron de 126 pacientes (edad media de 65,2 años, rango 45-78) con diagnóstico de cáncer de vejiga que fueron sometidos a resección quirúrgica para los ensayos de inmunohistoquímica en el hospital de la Unión en el Departamento de Urología (Wuhan , china) entre abril de 2007 y octubre de 2012. Las partes de las muestras de tejido fueron fijadas en formalina y embebidos en parafina. Todos los pacientes no recibieron tratamiento preoperatorio, como la quimioterapia o la radiación. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio, y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Unión, Tongji Medical College, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología (HUST). La información clínica y patológica se obtuvo a partir de una revisión retrospectiva de los registros médicos bien documentados. Los tumores se clasifican histológicamente como el cáncer no invasivo del músculo de la vejiga (CVNMI) (PTA etapa) o cáncer de vejiga invasivo muscular (MIBC) (pT3 etapa) de acuerdo con tumores linfáticos-metástasis clasificación (TNM) para la etapa [28]. Grado fue asignado de acuerdo con la clasificación de los tumores del sistema urinario y Male órganos genitales (2004) [28] de la Organización Mundial de la Salud. Todas las muertes se debieron a cáncer de vejiga. Características de los pacientes se detallan en la Tabla 1. Las líneas celulares de cáncer de vejiga humano BIU-87 y T24 se mantuvieron en nuestro laboratorio (Laboratorio Central del Hospital de Unión, Tongji Medical College, HUST, Wuhan, China). células BIU-87 se obtuvieron a partir de un grado II, no músculo-invasivo (pT1) BTCC humana de la vejiga urinaria. las células T24, que son pobremente diferenciado y poseen un alto potencial de metástasis y muestran una morfología fibroblástica típico microscópicamente fueron derivadas de un carcinoma de vejiga de grado III [29]. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100μg /ml de penicilina-estreptomicina (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.), y se incubaron con una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2 a 37 ° C.
la tinción inmunohistoquímica análisis
la expresión de proteínas se determinó mediante tinción inmunohistoquímica para SATB1, e-caderin y vimentina, con el método del complejo estreptavidina biotina-peroxidasa utilizando SABC kits (Boster Ltd., Wuhan, china) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las muestras de tejido se fijaron en 10% de formalina tamponada neutra, deshidratados e incluidos en parafina. A continuación, las secciones se deparaffinized y rehidratada. El peróxido de hidrógeno se aplicó a bloquear la actividad de peróxido endógeno para 10 min. Después de la recuperación de antígenos usando un horno de microondas, las secciones se trataron con suero normal de cabra 10% durante 10 min a temperatura ambiente para reducir la capacidad de unión no específica. Las secciones fueron incubadas con anticuerpo policlonal de conejo SATB1, E-caderin y vimentina (Abcam Inc., Cambridge, MA, EE.UU.) a la dilución de 1:70. Estos se dejaron en una cámara humidificada durante la noche a 4 ° C. Después de lavar tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min cada vez, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario durante 40 min y luego con estreptavidina complejo biotina-peroxidasa durante 40 minutos a 37 ° C. Después de enjuagar, diaminobencidina (DAB; Abcam Inc., Cambridge, MA, EE.UU.) se utilizó como cromógeno y las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Las muestras se incubaron con PBS en lugar del anticuerpo primario sirven como controles negativos. SATB1staining de armas nucleares se definió como inmunorreacciones detectables y E-caderin y tinción con vimentina en plasmalema o el citoplasma se definió como inmunorreacciones detectables. La tinción positiva se obtuvo en base a la intensidad y el porcentaje de células con tinción nuclear SATB1. De acuerdo con la intensidad predominante, la intensidad de tinción se indica en la siguiente escala: puntuación 0, la tinción nuclear negativo para todas las células tumorales; una puntuación de 1, débil tinción nuclear; Resultado 2, la tinción nuclear moderada; puntuación 3, fuerte tinción nuclear. De acuerdo con el porcentaje de células teñidas positivamente, la puntuación de la densidad de tinción se da como sigue: 0, menos de 5%; 1, 5 a 25%; 2, de 25 a 50%; 3, más de 50%. La puntuación final se calcula sumando las dos puntuaciones por encima. Las puntuaciones de 0 a 2 se definieron como expresión puntuaciones bajas, y 3-6 se definieron puntuaciones como altas.
extracción de RNA y los ensayos cuantitativos de PCR en tiempo real
ARN total fue extraído y purificado a partir de cada muestra de tejido y líneas celulares utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó usando el kit de transcripción inversa (Takara Biotecnología Dalian, China) con las siguientes condiciones: la transcripción inversa a 37 ° C durante 25 min, seguido de incubación a 85 ° C durante 5 s en 20 l de volumen de reacción. A continuación, el ADNc se prepara y se usa como molde para la reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real (PT-PCR) realizarse de Real-Time System ABI StepOnePlus PCR (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) utilizando el SYBR Green Real- tiempo de PCR Master Mix (Takara Clontech, Kyoto, Japón). Esto se hizo con las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 ° C durante 30 segundos, seguido de 40 ciclos de amplificación (95 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 30 segundos). Los cebadores se diseñaron utilizando NCBI BLAST Primer-de la siguiente manera: SATB1 (adelante, 5'-GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3 '; inversa, 5'-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3'), E-cadherina (adelante, 5'-CTG GACGCTCGGCCTGAAGT-3 '; inversa , 5'-GGGTCAGTATCAGCCGCTTT-3 '), vimentina (adelante, 5'-ACAGGCTTTAG CGAGTTATT-3'; revertir, 5'-GGGCTCCTAGCGGTTTAG-3 '), Twist (hacia adelante, 5'-CAGCGCACCCAGTCGCTGAA-3'; reversa, 5 ' -CCAGGCCCCCTCCATCCTCC-3 '), Caracol (adelante, 5'-ATCCGAAGCCACACGCTGCC-3'; inversa, 5'-CACGGCTGCAGTGGGGACAG-3 '), Slug (adelante, 5'-CGCTCCTTCCTGGTCAAGA-3'; retroceso, 5'-3-TTGCGTCACTCAGTGTGC '), ZEB1: (adelante, 5'-TGCTCCCTGTGCAGTTACACCTT-3'; inversa, 5'-CCAGACTGCGTCACATGTCTTTGA-3 '), ZEB2: (adelante, 5'-ATACCGCGGTGCCATCCTTGTACAGTGGTT-3'; inversa, 5'-GCGCTGCAGAGTAATTGGAAAAAAACAAA-3 ') , GAPDH (adelante, 5'-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 '; inversa, 5'-TGCCATGGGTGGAATCATATTGGA-3'). Los cebadores fueron diseñados para ser intrón-que abarca. Los valores de ciclo umbral (CT) fueron normalizados a valores CT de GAPDH. Los niveles relativos de mRNA individual en cada transcripción muestra en comparación con el control de GAPDH se calcularon utilizando la 2
-ΔΔCt método.
análisis de transferencia de Western
proteína total se extrajo de cada muestra de tejido y línea celular utilizando tampón RIPA (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de proteínas se determinaron con un kit de ensayo de proteína BCA (Boster Ltd., Wuhan, China). Cantidades iguales de muestras de proteína cosechadas se resolvieron en un electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore Corporation, Billerica, MA, EE.UU.), seguido de bloqueo con tampón TBST compuesto por Tris 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, y 0,05% de Tween suplementado con 5% de leche sin grasa en 4 ° C durante 2 horas. Las membranas fueron borrados incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo policlonal de conejo SATB1, E-cadherina, vimentina (Abcam Inc., Cambridge, CA, EE.UU.) (1: 800), ZEB1, ZEB2, caracoles y babosas (Santa Cruz Biotechnology Inc ., Santa Cruz, CA, EE.UU.) (1: 500). Se utilizó GAPDH (Boster Ltd., Wuhan, China) como control de carga. La unión del anticuerpo se detectó usando anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Boster Ltd., Wuhan, China) durante 2 h más a temperatura ambiente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron por una mayor Western Blot sistema de detección ECL (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE.UU.) y la intensidad de las bandas detectadas se analizó utilizando un programa J Imagen.
desmontables células-SATB1
se utilizó
Uno validado previamente shRNA [21]. La secuencia del shRNA fue el siguiente: 5'-GGATTTGGAAGAGAGTGTC-3 '. El shRNA se sintetizó y se clonó en el vector pGenesil2 (GenePharma Co., Ltd. Shanghai, China) y después se transfectaron en la línea celular T24 -confluent 50% junto con un vector de control pGenesil2 usando Lipofectamine 2000 reactivo (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante . poblaciones combinadas de desmontables células se obtuvieron después de dos semanas de selección de fármacos con G418 400 microgramos /ml, después de la incubación durante 24 h. A continuación, las líneas celulares desmontables-SATB1 mediadas por la interferencia del ARN estables fueron designados como pGenesil2-SATB1-shRNA y se cultivaron adicionalmente para los experimentos posteriores. Se utilizaron células T24 tratadas con revueltos-pGenesil2-shRNA (5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 '), que no se dirige ningún gen específico como los grupos de control.
SATB1 células que sobreexpresan
El humana de longitud completa SATB1 cDNA fue clonado en el vector de expresión pcDNA3.1 comprado de GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, china). Después de ser confirmada mediante secuenciación de ADN, el vector de expresión y el control pcDNA3.1 vector pcDNA3.1-SATB1 se transfectaron en células -confluent 50% BIU-87 utilizando Lipofectamine 2000, respectivamente (Invitrogen). Después de la transfección, se seleccionaron líneas celulares estables después de la incubación con 600μg /ml de G418 en medio RPMI-1640 suplementado con suero de ternera fetal al 10% durante dos semanas. Estos se cultivaron a continuación para los experimentos posteriores. Se establecieron las células BIU SATB1 sobreexpresan y los niveles de expresión SATB1 mostrados por estas células se confirmaron mediante análisis en tiempo real de RT-PCR. Se utilizaron células no transfectadas BIU-87 como los grupos de control.
inmunofluorescencia análisis
Para determinar la localización celular de proteínas para SATB1 y E-cadherina, inmunofluorescencia se realizó utilizando un láser confocal de barrido microscopio A1Si. Brevemente, BIU-87 y T24 células transfectadas con pcDNA3.1-SATB1 y vectores de expresión pGenesil2-SATB1-shRNA fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio y se colocaron en placas de 24 pocillos. Las células fueron fijadas con 4% de paraformaldehído durante 30 min a 37 ° C después de la incubación durante 3 días, y después se lavaron con PBS dos veces durante 10 minutos cada uno. Las células fijadas se permeabilizaron con 0,3% Triton X 100 para 15 min, se bloquearon en suero de cabra al 10% durante 1 h, y después se lavaron con PBS dos veces durante 10 minutos cada uno. Luego, las células se incubaron con el anticuerpo primario de la siguiente manera: anticuerpo policlonal de conejo SATB1, y E-cadherina (Abcam Inc., Cambridge, CA, EE.UU.) (01:50) a 4 ° C durante la noche seguido por la detección con anticuerpos secundarios conjugados con Cy5 y faloidina marcada con FITC (5μg /ml) (Sigma) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. DAPI se utilizó posteriormente para teñir los núcleos. Las imágenes se recogieron usando una Nikon A1Si láser confocal de barrido microscopio (Nikon, Japón).
Ensayos
invasión y migración celular in vitro
BIU y T24cells transfectadas con plásmidos pcDNA3.1-SATB1, pGenesil2 vector que contiene shRNA SATB1-específica, así como el vector de control negativo se añadieron al compartimento superior de las placas Transwell con filtros de policarbonato de 6,5 mm y el tamaño de poro 8.0μm (Corning Costar, MD, EE.UU.). Esto se hizo en 100 pl de medio libre de suero y 500μL de RPMI-1640 que contienen 10% de FBS. Para los ensayos de invasión celular, los cartuchos de filtro transwell se recubrieron con 50 l de Matrigel (BD Biosciences, NJ, EE.UU.). Después de la incubación durante 12 h a 37 ° C, 5% de CO
2 ambiente, las células tumorales que penetraron la parte inferior de la membrana de inserción fueron fijadas en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con violeta cristal (Boster Ltd., Wuhan, China) según con el protocolo del fabricante. A continuación, se contaron las células teñidas invasivos bajo un microscopio de luz en 10 campos seleccionados al azar a 200 × magnificación. Para los ensayos de migración de células, las células transfectadas se sembraron en cámaras superiores sin Matrigel recubierto. Después de la incubación durante 12 h a 37 ° C, 5% de CO
2 atmósfera, las células migradas en la parte inferior de la membrana de filtro se fijaron y tiñeron con violeta cristal y luego se contaron y se analizaron como se describe anteriormente. Los tres pocillos replicados se ensayaron por ensayo, y cada experimento se realizó por triplicado. Espectrofotómetro se utilizó para medir la densidad óptica a 560 nm, y la capacidad de invasión de las células se calculó usando el porcentaje de las células que penetraron los filtros recubiertos con Matrigel.
ciclo celular y análisis de proliferación
para validar los efectos de SATB1 sobre el ciclo celular, citometría de flujo se utilizó para el análisis el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular después de la tinción de células con yoduro de propidio (PI) (Keygentec, china) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, las células BIU y T24 se resuspendieron en PBS enfriado con hielo y se fijaron con 70% de etanol en hielo. A continuación, los pozos fijos se tiñeron con solución de PI durante 30 min y se analizaron por citometría de flujo
CCK-8 ensayo de proliferación celular (CCK-8 kit; Boster Ltd., Wuhan, China). Se utilizó para detectar la célula las tasas de crecimiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En, las células breves establecidos desmontables-SATB1 T24 y SATB1-overexpressing células BIU-87 en 4 × 10
3 por pocillo fueron sembradas en placas de 96 pocillos de fondo plano y se incubaron durante 48 horas a 37 ° C, en una 5% de CO
2 atmósfera. Para la cuantificación de la viabilidad celular, las células se incubaron con una solución de CCK-8 (10μl /pocillo) durante 1,5 h a 37 ° C. A continuación, los valores de absorbancia de las células tumorales se midieron a 450 nm en los puntos de tiempo indicados utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad, Tokio, Japón). Los tres pocillos replicados se ensayaron por ensayo, y cada experimento se realizó por triplicado.
Apoptosis ensayo
Para detectar los efectos de SATB1 sobre la apoptosis celular, citometría de flujo se realizó para analizar la tasa apoptotics usando Anexina V-FITC Kit de Detección de apoptosis (Keygentec, china) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, las células BIU y T24 transfectadas con plásmidos pcDNA3.1-SATB1 y vector que contiene pGenesil2 shRNA SATB1-específico, así como vector de control negativo se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 24 horas. A continuación, las células (1x10
6) fueron teñidas con anexina-V y PI y las células apoptóticas se determinaron mediante el kit de detección de apoptosis Anexina V-FITC y evaluados por un instrumento FACSCalibur.
El análisis estadístico
los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Los tres pocillos replicados se ensayaron por ensayo, y cada experimento se realizó por triplicado. Las comparaciones estadísticas entre los grupos fueron determinados por
del estudiante t-test
. análisis cruzados se realizó a través de Pearson chi-cuadrado (χ
2) o la prueba exacta de Fisher para analizar la significación de las correlaciones entre la expresión SATB1 y las características clínico-patológicas de cáncer de vejiga. Kaplan-Meier parcelas fueron utilizados para estimar la relevancia pronóstica de SATB1 en un análisis univariado. El análisis multivariante se realizó mediante un análisis de riesgos proporcionales de Cox. Todos los datos fueron analizados con el programa SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Todas las pruebas estadísticas fueron de dos colas y la significación estadística se asignó a p & lt; 0.05.
Resultados
SATB1 está regulado en los tejidos humanos y BTCC línea celular de cáncer de vejiga de alto potencial metastásico
Para investigar si la expresión anormal de SATB1 está relacionada con el desarrollo del cáncer de vejiga y la progresión y también participan en la regulación de EMT en el cáncer de vejiga humana, inmunohistoquímica, se llevaron a cabo inicialmente en tiempo real de RT-PCR y análisis de transferencia Western para identificar la expresión de SATB1. Además de que se utilizaron para analizar la E-cadherina y vimentina en 126 muestras de tejido de cáncer de vejiga humano, correspondiente a los tejidos normales adyacentes y líneas celulares de cáncer de vejiga, respectivamente. Se encontró que los niveles de expresión de SATB1 y vimentina ser significativamente hasta reguladas en ARNm y los niveles de proteína en los tejidos CVNMI y MIBC en comparación con los correspondientes especímenes no neoplásicas adyacentes (Fig 1A y C;. * P & lt; 0,05; ** P & lt ; 0,001). También se encontró que hubo cambios notables en los niveles de expresión de SATB1 y vimentina entre CVNMI y MIBC tejidos, que revelaron que los tejidos MIBC mostraron niveles más altos de SATB1 y vimentina que en los tejidos CVNMI (Figura 1 A y C;. * P & lt; 0,05). Los niveles de expresión de SATB1 ARN y proteína fueron significativamente más altos en la línea celular de tumor metastásico (T24) que en la línea de células tumorales no metastásico (BIU-87) (Fig 1A y C;. ** P & lt; 0,001), lo que sugiere SATB1 expresión se asoció con fenotipos tumorales agresivas. Además, la expresión de vimentina se upregulated sorprendentemente en los niveles de ARN y de proteínas en la línea celular T24 en comparación con los de BIU-87 líneas celulares (Fig 1A y C;. * P & lt; 0,05). Por el contrario, la expresión de E-cadherina fue notablemente baja o perdido en el mRNA y los niveles de proteína en los tejidos CVNMI, tejidos MIBC y alta T24 línea celular tumoral metastásico, pero significativamente alta en los correspondientes ejemplares no neoplásicas adyacentes y la línea de BIU-87cell (fig. 1A y C; * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,001). Resultados similares se obtuvieron por análisis de tinción inmunohistoquímica para detectar SATB1, E-cadherina y vimentina, que mostró que SATB1 se localizó predominantemente en los núcleos de los tejidos del cáncer de vejiga, con baja inmunorreactividad en los tejidos normales de la vejiga (Fig. 1B). Sin embargo, se encontró que la vimentina que se manchado predominantemente en plasmalema de tejidos de cáncer de vejiga, con una pérdida de o baja de la tinción de cadherina E (Fig. 1B). Entre los pacientes con cáncer de vejiga primarios con expresión positiva mostrada SATB1 expresión de E-cadherina perdido o baja, pero la expresión de alto vimentina. Por el contrario, los pacientes SATB1-negativos mostraron una fuerte tinción de E-cadherina, pero una tinción luz de vimentina (Fig. 1D), lo que sugiere una fuerte correlación positiva entre SATB1 y marcadores de EMT en el BTCC.
Las expresiones de los niveles de mRNA SATB1, e-cadherina y vimentina en tejidos de carcinoma de vejiga humano y dos líneas de células de carcinoma de vejiga fueron evaluados por RT-PCR cuantitativa (a; * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,001). Se realizó la tinción inmunohistoquímica de tejidos de carcinoma de vejiga humana y la correspondiente tejidos no cancerosos adyacentes para SATB1, E-cadherina y vimentina. tinción SATB1 se observó en los núcleos de las células de cáncer de vejiga, se encontró que la vimentina que se manchado predominantemente en plasmalema de las células de cáncer de vejiga, pero no se observó tinción de E-cadherina principalmente en plasmalema de las células de la vejiga no cancerosas (B); muestras de cáncer de vejiga con SATB1-positivos fueron teñidas con vimentina pero no la E-cadherina. Sin embargo, las muestras tumorales con SATB1-negativos fueron teñidas con E-cadherina, pero no vimentina (D). La ampliación original fue de 400x × (B y D). Los niveles de proteína de SATB1, E-cadherina y vimentina fueron examinados por Western blot (C). Las barras de error indican s.e.m., n = 3 experimentos.
La sobreexpresión de SATB1 se asocia con parámetros clínico y se correlaciona con mal pronóstico
Se investigaron las relaciones entre la expresión SATB1mRNA y los factores clínico-patológicos. Como se muestra en la Tabla 1, la alta expresión de SATB1 se asoció significativamente con la edad (≥55 vs. & lt; 55, p = 0,034), la profundidad del tumor primario de la invasión (T1 + T2 vs T3 + T4, P & lt; 0,001), TNM etapa (estadios I + estadios II vs III + IV, p = 0,015), la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos (P = 0,013) y la presencia de metástasis a distancia (P = 0,012). Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas entre la alta expresión SATB1 y cualquier sexo (masculino vs. femenino, P = 0,143) o la diferenciación del tumor (G1 vs. G2 + G3, P = 0,111). Se realizó un análisis de Kaplan-Meier para determinar la importancia pronóstica de SATB1. Como se muestra en la Fig. 2, el análisis reveló una correlación entre altos niveles de SATB1expression y tiempos de supervivencia global más corta (P & lt; 0,001). Además, el análisis de regresión de Cox multivariable confirmó que la expresión SATB1 es un factor pronóstico importante e independiente para la vejiga humana carcinoma de células transicionales después de ajustar por otros factores, como se muestra en la Tabla 2 (P = 0,005).
El 5 años tasa de supervivencia global en pacientes con alta expresión SATB1 fue significativamente peor que aquellos con expresión SATB1 baja (P & lt; 0,001; prueba de log-rank)
la expresión ectópica de SABT1 induce EMT en una establecida. línea celular de cáncer humano, aumentando su capacidad invasiva
los estudios anteriores han relacionado con SATB1expression transición epitelio-mesenquimal (EMT) [21,24]. Para probar si la expresión ectópica de SATB1 podría inducir la EMT en las células tumorales no metastásicos, la vejiga línea celular de cáncer humano (BIU-87) con muy baja expresión SATB1 se transfectadas con pcDNA3.1-SATB1 plásmidos de expresión para establecer un establo SATB1 que sobreexpresa línea celular tal como se describe en materiales y Métodos. Los resultados de tiempo real RT-PCR y Western Blot mostró que SATB1 ARNm y los niveles de proteína de grupo transfectadas aumentaron significativamente en comparación con el grupo y el grupo nontransfected transfectadas con vector de control (Fig 3A;. ** P & lt; 0,001). Sin embargo, no hubo cambios notables en la expresión de SATB1 en el grupo control transfectadas con el vector y el grupo nontransfected (P & gt; 0,05). Resultados similares se pueden obtener por análisis de inmunofluorescencia para detectar SATB1 (Fig. 3C). Curiosamente, se encontró que la transfección de células BIU-87 causó un aumento significativo de Snail y Slug (ARNm y proteína) y una inducción concomitante de vimentina (ARNm y proteínas). Los niveles de mRNA de expresión de E-cadherina se redujo después de la transfección de pcDNA3.1-SATB1 plásmidos de expresión (Fig 4A;. P & lt; 0,05). Sin embargo, no hubo cambios notables en la expresión de la proteína E-cadherina entre el vector de control y el grupo pcDNA3.1SATB1 (Fig 4B;. P & gt; 0,05). Sólo había una tendencia de reducción en la expresión de la proteína E-cadherina, y el efecto inhibido no fue tan pronunciado debido a la inhibición podría ser posterior a la traducción.
La expresión SATB1 de BIU-87 células y las células transfectadas con T24 pcDNA3.1-SATB1 y pGenesil2-SATB1-shRNA fueron examinados por qRT-PCR y Western blot (A y B; ** P & lt; 0,001). Se han usado no transfectadas BIU-87 células como grupo de control. las células T24 tratadas con pGenesil2 vector de control que no se dirigen a cualquier gen específico se utilizaron como los grupos de control. Se realizó un análisis de inmunofluorescencia para detectar la SATB1staining en cada uno de los grupos celulares. Inmunofluorescencia imágenes a 200 × magnificación (C y D). Las barras de error indican SEM, n = 3 experimentos
La expresión de Snail y Slug, dos inhibidores de la E-cadherina, y la vimentina mesenquimales marcador se upregulated después de la expresión SATB1 se mejoró (A; **. P & lt; 0,001). Los niveles de mRNA de expresión de E-cadherina se redujo después de la transfección de pcDNA3.1-SATB1 plásmidos de expresión (A; P & lt; 0,05). Hubo una tendencia de reducción en la expresión de la proteína E-cadherina en BIU-87 células con expresión SATB1 mejorado (B; P & gt; 0,05). Después de la expresión SATB1 fue silenciado con SATB1 shRNA en las células T24, se downregulated la expresión de Snail, Slug y marcadores mesenquimales vimentina. La expresión de marcadores epiteliales, E-cadherina, se upregulated comparación con las células no transfectadas y células transfectadas con el vector de control (C y D; * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,001). No hubo cambios notables en las expresiones de ZEB1, ZEB2 y torsión, a otros inhibidores conocidos de la E-cadherina, en BIU-87 con una mayor expresión y T24 células SATB1 con la reducción de expresión SATB1, respectivamente.
sin embargo, no hubo cambios notables en la expresión de ZEB1, ZEB2 y Twist, lo que se conoce como otros inhibidores de la e-cadherina, en los tres grupos de células (P & gt; 0,05).