Extracto
El objetivo fue investigar la importancia clínica de la expresión de la novela CARMA3 andamio de proteínas en el cáncer de células no pequeñas de pulmón (NSCLC) y la función biológica de CARMA3 en líneas celulares de cáncer. Se observó tinción de moderada a alta CARMA3 en 68,8% de los 141 especímenes de NSCLC en comparación con los tejidos normales correspondientes. La sobreexpresión de CARMA3 se correlacionó significativamente con el estadio TNM (p = 0,022) y el estado del tumor (p = 0,013). CARMA3 upregulation también se correlacionó con una tasa de supervivencia más corta de los pacientes de estado ganglionar N0 (P = 0,042), así como la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (P = 0,009). En los casos positivos de mutación de EGFR, la expresión CARMA3 fue mucho mayor (87,5%) en comparación con los casos que no son de mutación (66,1%). Además, se observó que desmontables de CARMA3 inhibe la proliferación de células tumorales y la invasión, e induce la detención del ciclo celular en el límite entre el G1 y fase S. Además, demostró una relación directa entre CARMA3 y la activación de NF-kB. El cambio de comportamiento biológico de las células CARMA3 desmontables puede ser relacionada-kappa B-NF. Nuestros resultados demostraron, por primera vez, que CARMA3 se sobreexpresa en NSCLC y correlacionado con la progresión del cáncer de pulmón, la expresión de EGFR, y la mutación de EGFR. CARMA3 podría servir como un posible objetivo de drogas compañera, además de NF-kB y EGFR en cáncer de pulmón EGFR mutante
Visto:. Li Z, P. L, Q Dong, Huang B, Li H, Tang Z, et al. (2012) La sobreexpresión de CARMA3 en células no pequeñas de cáncer de pulmón está vinculado a la progresión tumoral. PLoS ONE 7 (5): e36903. doi: 10.1371 /journal.pone.0036903
Editor: William C. S. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 15 Noviembre 2011; Aceptado: April 9, 2012; Publicado: 15 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30.972.967) y el Fondo de Investigación del Programa de Doctorado de la Educación Superior de China (Nº 20092104110018). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
CARMA3 (también conocido como CARD10 o Bimp1) pertenece a la familia CARMA y contiene tres miembros, CARMA1 (también conocido como CARD11), CARMA2 (CARD14), y CARMA3. Estas tres proteínas comparten motivos estructurales similares, contienen un dominio CARD, un Src-homología 3 (SH3) de dominio, los dominios de uno o varios PDZ, y un dominio GuK. Sin embargo, presentan distintos perfiles de expresión; CARMA1 se expresa en células hematopoyéticas, CARMA2 en la placenta, y CARMA3 en todas las células no hematopoyéticas [1] - [4]. Estudios recientes han demostrado que CARMA3, como una proteína de andamiaje, juega un papel crítico en ligandos de GPCR y la activación de NF-kB inducida por PKC [5] - [8]. Se ha demostrado previamente que la activación de NF-kappa B está implicado en la tumorigénesis y en el desarrollo de neural, corazón y enfermedades inmunes [9] - [13]. CARMA3 activa NF-kappa B mediante la contratación de Bcl10 y MALT1, dos proteínas indispensables que se requieren para GPCR y la activación de NF-kB PKC inducida por [6], [14] - [16]. El eje de señalización PKCa-CARMA3 juega un papel esencial en LPA inducida de células de cáncer de ovario en la invasión vitro [17]. Un estudio reciente demostró que la deficiencia de CARMA3 afectada la proliferación de cáncer de células in vitro e in vivo, y la supervivencia inhibido, la migración y la invasión en el cáncer de mama líneas celulares MDA468 humana y A431 [18]. CARMA3 caída causó una marcada inhibición de SDF-1α invasión de las células mediada por carcinoma de células escamosas orales TB2-T4 [7]. Sin embargo, la expresión de la proteína de CARMA3 en tejidos de cáncer de pulmón y el papel potencial de CARMA3 en el comportamiento biológico de las células de cáncer de pulmón no se han explorado. Por lo tanto, hemos examinado la expresión de CARMA3 en tejidos de cáncer de pulmón y su relación con diferentes parámetros clínico. Además, se evaluó la asociación de la expresión CARMA3 con la proliferación y el potencial metastásico de varias líneas celulares de cáncer.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad médica de china, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente. Se obtuvieron 141 muestras de casos de NSCLC forma el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de China durante el período de 2008 a 2011. El diagnóstico histológico y el grado de diferenciación de los tumores fueron definidas por la evaluación de las secciones de tejido hematoxilina y eosina-manchado, según las directrices de la Organización Mundial de la Salud de la clasificación. Las 141 muestras fueron reevaluados con respecto a sus subtipos histológicos, estado de diferenciación, y las fases del tumor. Para las muestras de NSCLC, SCC y adenocarcinoma fueron identificados en 65 y 76 de los 141 casos, respectivamente. No se observaron metástasis en los ganglios linfáticos en 68 de los 141 pacientes. Se utilizó el sistema taging p-TNM de la Unión Internacional Contra el Cáncer (7ª edición) para clasificar las muestras como los estadios I (n = 64), II (n = 41), III (n = 30) y IV (n = 6) .
Líneas celulares
A549, H1299, H460 y HBE se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.), LK2 se obtuvo del Banco de Recursos de Investigación del cáncer de Japón (Tokio, Japón), SPC se obtuvieron de CCTCC (Centro chino de la cultura típica Conservar, Wuhan, República Popular china), H157 se adquirió de Banco de células, Academia de Ciencias de china (Shanghai, china), El BE1 y LH7 fueron regalos de Dr. Jie Zheng (Facultad de Medicina de la Universidad de Pekín, china) .Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al 10% (Invitrogen), 100 UI /ml de penicilina (Sigma, St. Louis, MO , EE.UU.), y 100 mg /ml de estreptomicina (Sigma). Las células se cultivaron en placas de cultivo de tejido estériles y se pasaron cada 2 días utilizando 0,25% de tripsina (Invitrogen).
Inmunohistoquímica
muestras de tumores extirpados quirúrgicamente se fijaron con 10% de formalina neutral, embebidos en parafina y se prepararon 4 micras de grosor. La inmunotinción se realizó mediante el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa (Ultra Sensitive TM, Maixin, Fuzhou, China). Las secciones se desparafinaron en xileno, se rehidrataron en alcohol graduado serie y se hirvió en tampón de citrato 0,01 M (pH 6,0) durante 2 minutos en un autoclave. actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno (0,3%), que fue seguido por la incubación con suero de cabra normal para reducir la unión no específica. Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo CARMA3 (1:80 dilución) (Sigma). inmunoglobulina de ratón (a la misma concentración del anticuerpo específico de antígeno) (Maixin, Fuzhou, China) se utilizó como control negativo. La tinción para todos los anticuerpos primarios se realizó a temperatura ambiente durante 2 horas. HRP-conjugado con polímero anti-ratón /conejo IgG (lista para el uso) (Maixin, Fuzhou, China) se utilizó como anticuerpo secundario. Después del lavado, las secciones se incubaron con peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina-biotina, seguido por 3, tetrahidrocloruro 3'-diaminobencidina para desarrollar la reacción de la peroxidasa. Contratinción de las secciones se realizó con hematoxilina, que fueron deshidratados en etanol antes de mounting.Two investigadores independientes examinaron todas las diapositivas tumorales al azar. Cinco miradas fueron examinados por diapositiva, y no se observaron 100 células por visión a 400 × magnificación. Normal epitelio bronquial presente en las secciones de tumor se utilizó como control negativo. La inmunotinción de CARMA3 se obtuvo tras una escala semicuantitativa mediante la evaluación en áreas representativas del tumor, la intensidad y el porcentaje de células que muestran la inmunotinción más alta que las células de control. tinción citoplásmica de las células tumorales se consideró como la inmunotinción positiva. La intensidad de la tinción citoplásmica CARMA3 también se puntuó como 0 (sin tinción), 1 (débil), 2 (marcado). anota Porcentaje fueron asignados como 1- 1-25%, 26-50% 2- y 3- 51-100%. Las puntuaciones de cada muestra de tumor se multiplicaron para dar una puntuación final de 0 a 6 y la expresión total de CARMA3 se determinó como negativa o baja expresión (-): score & lt; 3 o expresión positiva o alta expresión (+): Puntuación ≥3.
(a) expresión CARMA3 fuerte en el adenocarcinoma de pulmón (400 ×). (B) la expresión CARMA3 débil en el adenocarcinoma de pulmón (400 ×). (C) la expresión CARMA3 fuerte en pulmón carcinoma de células escamosas (400 ×). (D) la expresión CARMA3 débil en el pulmón carcinoma de células escamosas (400 ×). (E) epitelio bronquial normal que muestra tinción débil para CARMA3 (400 ×). (F) Los controles negativos para la tinción CARMA3 con anticuerpo IgG de ratón no inmune (400 ×).
tinción inmunohistoquímica para CARMA3 y EGFR en muestras representativas 2 NSCLC. Una mostraba fuerte expresión de CARMA3 (A) y la expresión fuerte EGFR (400 ×) (B). El otro mostró débil expresión de CARMA3 (400 ×) (C) y la debilidad de expresión de EGFR (400 ×) (D). (E, F) La correlación de CARMA3 y la expresión de EGFR en muestras de CPNM con mutación de EGFR (400 ×).
Análisis de mutación de EGFR
Las secciones en parafina de las muestras 75 de NSCLC de mutación de EGFR el análisis se obtuvieron a partir primer hospital Afiliado de la Universidad médica de china entre 2009 y 2011. En pocas palabras, el ADN se extrajo de las secciones de tejido incluidas en parafina utilizando Takara DEXPAT Easy Kit (Takara Biotecnología, Dalian, china) de acuerdo con el protocolo del fabricante. mutaciones de EGFR se detectaron usando el kit de detección de mutaciones de EGFR (GP Medical Technologies, Pekín, China) en 7900HT Sistema Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA).
cuantitativa en tiempo real PCR (SYBR Green Método)
Quantitative PCR en tiempo real se realizó utilizando SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems) en un volumen total de 20 l en 7900HT sistema de PCR rápida en tiempo real (Applied Biosystems) como sigue: 95 ° C durante 30 segundos, 40 ciclos de 95 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 30 segundos. Una etapa de disociación se realizó para generar una curva de fusión para confirmar la especificidad de la amplificación. β-actina se utilizó como gen de referencia. Los niveles relativos de expresión de genes han estado representados gen? Ct = Ct referencia -Ct, y el pliegue del cambio de la expresión génica se calculó por el método 2-ΔΔCt. La imprimación secuencias se proporcionan en la Tabla S1, los experimentos se repitieron por triplicado.
Análisis de Western Blot
Las proteínas totales de tejidos y líneas celulares primarios se extrajeron en tampón de lisis (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) y se cuantificó utilizando el método de Bradford. Cincuenta microgramos de proteína se separaron mediante SDS-PAGE (12%). Después de transferir, el fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) se incubaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos CARMA3 (1:200; Sigma), Bcl-10 y β-actina (1:500 ; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-fosfo-ERK, anti-fosfo-IKK, anti-fosfo-I? B, anti-fosfo-Rb, anti-P27, anti-ciclina A, anti-ciclina D1, anti -Cyclin D3, anti-CDK4 y anti-CDK6 (1:1000; Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA). Después de la incubación con peroxidasa de acoplamiento de anti-ratón o IgG de conejo (Santa Cruz Biotechnology) a 37 ° C durante 2 horas, las proteínas unidas se visualizaron utilizando ECL (Thermo Fisher Scientific) y se detectaron utilizando Sistemas de bioimagen (UVP Inc., Upland, CA, ESTADOS UNIDOS). Los niveles de proteína relativos se calcularon sobre la base de β-actina como control de carga.
Tratamiento interferente pequeño ARN
Dharmacon siGENOME SmartPool siRNA para CARMA3, Bcl10 y Dharmacon siGENOME no director siRNA#1 eran comprado de Dharmacon (ThermoFisher Scientific). Para las transfecciones, las células se sembraron en una placa de 24 pocillos 24 h antes del experimento. Las células fueron transfectadas con siRNA usando el DharmaFECT 4 (0,20 l /pocillo; ThermoFisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la transfección, el ARNm y los niveles de proteína se evaluaron 48 horas más tarde.
proliferación de células de prueba
ensayo de proliferación celular se realizó utilizando Cell Counting Kit-8® solución (Dojindo, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se sembraron a una concentración de 5 × 10
3 células /100 l /pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos y se trata con 10 l /pocillo de solución de Cell Counting Kit-8® durante las últimas 4 horas de la cultura. La densidad óptica de los pocillos se midió a 450 nm usando un lector de microplacas.
formación de colonias de ensayo
Para los ensayos de formación de colonias, se cultivaron las células en placas de 6 cm a una densidad de 5.000 células /placa , y se transfectaron con CARMA3, Bcl10, o siRNAs de control negativo. Las colonias se lavaron dos veces con PBS, se fijaron y se tiñeron con violeta de cristal de formaldehído-13-15 días después de la transfección. Todos los experimentos se repitieron independientemente un mínimo de tres veces en condiciones idénticas.
(A) análisis de transferencia de Western de la expresión CARMA3 en células de cáncer de pulmón transfectadas con siRNA. (B) los perfiles de expresión CARMA3 relativa en un panel de líneas celulares derivadas de las vías respiratorias humanas evaluados por PCR en tiempo real.
Tasa de (A) el crecimiento celular se determinó por el ensayo de CCK-8, como se describe en sección 2. Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes. células (panel superior) H1299 y A549 (B) transducidas con siRNA de control, CARMA3, o Bcl10 se sometieron a ensayo de formación de colonias. (Panel inferior) la cuantificación de histograma. Las barras de error indican ± SD (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01) guía empresas
(Alta) CARMA3 y tratamiento Bcl10 siRNA inhibieron la invasión celular medible en ambas líneas celulares (200 ×).. (Baja) El gráfico de barras indica la media y la diferencia en el número de células entre las fotografías, y la derivación estándar se calculó a partir de la media de las células en los 10 campos (**, P & lt; 0,01)
Matrigel invasión de ensayo
ensayo de invasión celular se realizó utilizando una cámara de 24 pocillos Transwell con un tamaño de poro de 8 mm (Costar, Cambridge, MA). Los insertos se recubren con 20 l de Matrigel (dilución 1:03, BD Bioscience, San José, CA, EE.UU.). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se tripsinizaron las células y 3 × 10
5 células en 100 l de medio libre de suero fueron transferidos a la cámara de Matrigel superior y se incubaron durante 16 horas. Después de la incubación, las células no invadidas en la superficie de la membrana superior se eliminaron con una punta de algodón, y las células que pasaron a través del filtro se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con hematoxilina. El número de células invadidas se contó en 10 campos de alta potencia seleccionados al azar en el microscopio. Este experimento se realizó por triplicado.
Cell Cycle Análisis
Las células (500,000) se sembraron en 6 cm placas de cultivo de tejidos. Después de 12 h de incubación, las células fueron transfectadas con cantidades indicadas de siRNA. Las células fueron fijadas con 75% de etanol 48 h después de la transfección, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se tiñeron en 5 mg /ml de yoduro de propidio en PBS suplementado con RNasa A (Roche, Indianapolis, IN) durante 30 minutos a temperatura ambiente . Los datos fueron recolectados a través de los sistemas de BD
ensayo de luciferasa
Las células fueron transfectadas inicialmente con CARMA3, Bcl10, o ARNip de control negativo para las 24 h.; células fueron co-transfectadas con 500 ng de plásmido reportero pNF-kB-Luc y 100 ng de luciferasa Renilla plásmido de 24 h. Las células se trataron durante 30 min con o sin EGF (100 ng /ml), y luego se lisaron; la actividad de luciferasa se determinó con un sistema de doble luciferasa reportero de ensayo (Promega, Madison, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. la actividad de NF-kB se evaluó sobre la normalización de la actividad de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla actividad. Los experimentos se realizaron por triplicado en tres experimentos independientes.
Análisis estadístico
SPSS versión 16.0 para Windows fue utilizado para todos los análisis. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para examinar las posibles correlaciones entre la expresión CARMA3 y los factores clínico-patológicos. Las curvas de Kaplan-Meier se utilizaron para el análisis de supervivencia, y se determinó log-rank basado en las diferencias. Se utilizó la prueba t de Student para comparar otros datos. p-valores se basan en el análisis estadístico de dos caras, y p. & lt; se consideró 0,05 para indicar la significación estadística
células H1299 y A549 (A) (superior) fueron tratados con siRNA-CARMA3 específica durante 48 h . A continuación, las células se recogieron y se trataron con RNasa, y se tiñeron con PI. La distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. (Baja) El porcentaje de células en G1, S, G2 fase en histogramas. (* P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001) frente al grupo control. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. células H1299 y A549 (B) fueron tratados con siRNA-CARMA3 específico para 48 h. Los lisados celulares se sometieron a análisis de inmunotransferencia usando anticuerpos indicados.
células (A) H1299 y A549 fueron transfectadas con control o-CARMA3 siRNA durante 24 h, después se trató con NF-kappa B-luciferasa y control
Renilla
plásmidos indicadores para las 24 h. Las células se trataron con o sin EGF (100 ng /ml) antes de la cosecha, y la inducción de NF-kappa B resultante se midió mediante el cálculo de la relación de luciferasa /
Renilla
. Datos (mean_S.E.) Son de al menos tres determinaciones separadas. (** P & lt; 0,01) (B) las células H1299 y A549 se transfectaron con una piscina siRNA CARMA3 orientación durante 48 h, después se trató con EGF (100 ng /ml) durante los períodos de tiempo indicados. Total de lisados celulares se prepararon a partir de estas células y después se sometieron a análisis de inmunotransferencia con anticuerpos indicados.
Resultados
significado clínico de CARMA3 expresión de proteínas en tejidos de NSCLC
analizaron los niveles de expresión de proteínas de CARMA3 mediante inmunohistoquímica de 91 muestras de NSCLC y sus correspondientes tejidos normales. CARMA3 se encontró que se expresa predominantemente en el compartimiento citoplasmático. epitelio bronquial normal mostró tinción CARMA3 negativo o débil (Fig. 1E), mientras que CARMA3 tinción fue significativamente más fuerte en tejidos de cáncer de pulmón. Encontramos de moderada a alta tinción CARMA3 en 69% de los especímenes de cáncer de pulmón (Fig. 1A y C). También usamos transferencia de Western para analizar la expresión de CARMA3 en 18 casos.El resultados muestran que el 56% de las muestras de cáncer de pulmón muestran moderada a alta expresión CARMA3 (Figura S2, S3).
La correlación entre CARMA3 expresión y los clinicopathologicfactors de NSCLC se muestran en la Tabla 1. CARMA3 sobreexpresión mostró una correlación significativa con el estadio TNM (p = 0,022) y el estado del tumor (p = 0,013), pero no se observó ninguna correlación respecto a la edad, el sexo, la diferenciación, metástasis de ganglios linfáticos , y la histología del tumor. Para reclamar mejor la correlación de CARMA3 con la progresión del cáncer de pulmón, se evaluó la relación entre la expresión de CARMA3 y la supervivencia global de los pacientes con CPNM etapa N0 (38 CAMRA3 + y 16 CAMRA3 -). Tras el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, hemos encontrado que los pacientes con baja expresión de CARMA3 tuvieron una supervivencia estadísticamente significativa más larga (la supervivencia media = 32 ± 3,80 meses; 95% intervalo de confianza 24.56-39.44 meses) que aquellos con alta expresión de CARMA3 (mediana de supervivencia = 20 ± 3,91 meses; 95% intervalo de confianza del 12,33 a 27,67 meses, p = 0,042;. Figura S4) guía
Un estudio informó recientemente demostró que la expresión es necesaria para CARMA3 EGFR inducida por la activación de NF-kappa B [15]. la sobreexpresión de EGFR se ha demostrado en muchos cánceres humanos, incluyendo de pulmón, colon, páncreas, mama, ovario, vejiga, riñón y sistema nervioso [19], [20]. Por lo tanto, hemos examinado la relación entre la expresión y el estado CARMA3 EGFR en CPNM. Se encontró que el EGFR se expresa en la membrana celular y citoplásmica. Existe una correlación significativa entre la expresión CARMA3 y la expresión de EGFR se observó (P = 0,009) en las muestras de NSCLC (Tabla 1 y Fig. 2A-D). Para determinar si la mutación de EGFR se correlaciona con la expresión CARMA3 elevada, se investigó la relación entre la expresión y mutación CARMA3 EGFR. Se utilizó un kit de detección de mutaciones de EGFR, y encontramos 16 de 75 muestras tumorales fueron positivas para la mutación de EGFR (Tabla S2). Entre los 16 casos, 87,5% exhibió expresión CARMA3 positiva, una tasa mucho más alta en comparación con los casos que no son de mutación (66,1%). Se encontró que los casos de mutación de EGFR 86,67% positivo también mostraron expresión CARMA3 positivo (Fig. 2E y F).
CARMA3 contribuye al crecimiento celular del cáncer de pulmón y la invasión
Nos examinó por primera vez la expresión de CARMA3 en varias líneas celulares de cáncer de pulmón, como se muestra en la Fig. 3B, H1299, A549, BE1 exhibe altos niveles de expresión de CARMA3 mientras que las células normales de epitelio bronquial (HBE), LK2, y LH7 mostraron niveles más bajos de expresión CARMA3. SPC, H157, H460 y exhibieron niveles moderados de expresión CARMA3.
A continuación empleó un enfoque de interferencia de ARN para determinar si CARMA3 y CBM complejo (CARMA3-Bcl10-MALT1) desempeña un papel en el crecimiento de células de cáncer. Los CARMA3 y Bcl10 niveles de expresión se mantuvieron sin cambios después de la transfección transitoria con el ARNsi de control negativo, mientras que CARMA3- o siRNA Bcl10 específicos suprimió significativamente tanto mRNA, así como los niveles de expresión de proteínas en el H1299 y líneas de células A549 (Fig. 3A y la Fig. S1 ). A continuación, se analizó la tasa de crecimiento de las células. Con CARMA3 o Bcl10 siRNA, células H1299 muestra reducida de las tasas de crecimiento en comparación con el control negativo (Fig. 4A). De manera similar a las células H1299, encontramos que desmontables de CARMA3 o Bcl10 también redujo la tasa de crecimiento de las células A549 (Fig. 4A). Hemos utilizado un método independiente, ensayos de formación de colonias, para validar los efectos anti-proliferativos de CARMA3 o inhibición Bcl10 en células de cáncer de pulmón. CARMA3- o Bcl10-siRNAs dirigidos condujo a una clara reducción de la capacidad de formación de colonias de dos líneas celulares de cáncer de pulmón probados en comparación con las células control tratadas con siRNA (Fig. 4B). Estos estudios pérdida de función demostraron que el CARMA3 y CBM siRNAs podrían inhibir la proliferación de células tumorales en comparación con irrelevante SINC. Para examinar más a fondo si CARMA3 y Bcl10 contribuyen a la capacidad invasiva de células no pequeñas de cáncer de pulmón de células, se realizaron ensayos de invasión Matrigel. Nuestros resultados demuestran que las capacidades invasivas de CARMA3- y células cancerosas H1299 Bcl10-desmontables se redujeron en comparación con las células de control negativo (Fig. 5). Del mismo modo, la caída de CARMA3 o Bcl10 en células A549 también redujo la capacidad invasiva de estas células (Fig. 5). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que CARMA3 y complejo CBM son positivos invasión de células reguladores.
Resultados CARMA3 deleción en la detención de G1 y la inhibición del crecimiento de células cancerosas de pulmón
análisis del ciclo celular por células activadas por fluorescencia (FACS) se realizaron en células de cáncer, con o sin CARMA3-caída, y se encontró que el porcentaje de células en la fase G1 se incrementó y células en la fase S se redujo en las células con CARMA3-caída en comparación con las células control (Fig. 6 A). Estos resultados sugieren que CARMA3 deleción induce la detención del ciclo celular en la transición G1 /S límite. Para investigar el mecanismo subyacente a la inducción de la detención del ciclo celular, hemos probado el efecto de la caída en CARMA3-ciclina A, ciclina D1, ciclina D3, CDK4, CDK6, P27, y P-Rb. Como se muestra en (la figura 6 B), análisis de transferencia Western reveló que desmontables de CARMA3 disminuyó los niveles de proteína de la ciclina D1, CDK4, CDK6, y P-Rb, pero aumentó los niveles de p27. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la inhibición de la expresión CARMA3 induce la detención del ciclo celular en la fase G1 y suprime el crecimiento de células de cáncer de pulmón.
represión de CARMA3 Inhibe p-I? B y NF-kB activación
para determinar si CARMA3 media la activación de NF-kappa B estimulada por EGF en células de cáncer de pulmón, se utilizó H1299 y A549 células. Las células que se habían sometido a tratamiento CARMA3 siRNA exhiben inhibición de NF-kappa B en presencia o ausencia de EGF. Del mismo modo, nuestros resultados demostraron que siRNA mediada Bcl10-desmontables inhibido NF-kB luciferasa expresión (Figura 7 A). Nuestros resultados del estudio demuestran claramente el papel esencial de la CARMA3-Bcl10-MALT1 complejo de señalización en la activación de NF-kB inducida por EGF en células de cáncer de pulmón. A fin de verificar el papel de la expresión CARMA3 en inducida por EGF la activación de NF-kB en las células cancerosas, células H1299 y A549 células transducidas con CARMA3 siRNA fueron estimuladas con EGF. Se observó un bloqueo en la capacidad del EGF para inducir p-I? B concomitante con desmontables de CARMA3, pero la fosforilación de IKK inducida por EGF no se vio afectada en las células deficientes en CARMA3. Por otra parte, la caída CARMA3 no afectó la fosforilación inducida por EGF de ERK (Figura 7 B). Tomados en conjunto, nuestros resultados demuestran que CARMA3, a través de la fosforilación de I? B, media la activación de NF-kB inducida por EGF en células de cáncer de pulmón.
Discusión
En este estudio, se evaluó el patrón de expresión y biológica papel de la novela CARMA3 andamio de proteínas en NSCLC humano. Nuestros resultados demuestran que la expresión de proteínas CARMA3 en tejidos de cáncer de pulmón es mayor en comparación con el correspondiente tejidos pulmonares normales. A nivel de proteínas, expresión CARMA3 estaba restringida al citoplasma en todas las muestras. Se encontró una correlación significativa entre CARMA3 regulación y ambos estadio TNM y el estado del tumor. Además, hemos demostrado que CARMA3 regulación también se correlacionó con una tasa de supervivencia más corta de los pacientes del estado ganglionar N0 así como el estado de EGFR. CARMA3 se ha demostrado previamente para jugar un papel fundamental en la activación inducida EGFR de NF-kappa B [18]. mutación de EGFR se correlaciona significativamente con elevada expresión de EGFR, su señalización aguas abajo, y la respuesta clínica al tratamiento con gefitinib [21]. Por lo tanto, hemos examinado aún más la relación entre la expresión CARMA3 y mutación de EGFR. Hemos encontrado que la expresión de CARMA3 es significativamente mayor en los casos de mutación de EGFR en comparación con los casos no mutación. Estos resultados sugieren que CARMA3 puede jugar un papel importante en el cáncer de pulmón EGFR mutante. Un informe reciente ha demostrado que desmontables de varios componentes de la vía de NF-kB muerte celular específicamente mejorada inducida por el erlotinib TKI de EGFR en células de cáncer de pulmón EGFR mutante [22]. A medida que la sobreexpresión de las proteínas CARMA3 induce robusta NF-kB activación [3], [4], CARMA3 y NF-kB pueden servir como potenciales dianas farmacológicas compañero junto con EGFR en cáncer de pulmón EGFR mutante.
CARMA3 ha sido reportado para promover la progresión de células de cáncer de ovario [17], para aumentar el crecimiento de células de cáncer de mama humano y la invasión [18], inducir invasión de carcinoma de células escamosas oral (CCCA) [23]; CARMA3 también juega un papel importante en la aterogénesis [24] y la activación de NF-kB en las células de las vías respiratorias epitelial [25]. Sin embargo, el papel funcional sigue siendo poco clara. Para dilucidar la función biológica de CARMA3 en cáncer de pulmón, se emplearon siRNA desmontables expresión CARMA3 tanto en A549 y las líneas celulares H1299, que expresan altos niveles de CARMA3. Se observó alteración de la capacidad de proliferación tanto en A549 y células H1299 después CARMA3 caída. Desmontables de Bcl10, que es otro componente del complejo de CBM, también problemas de la proliferación celular. Por lo tanto, CARMA3 siRNA desmontables potencialmente altera la proliferación de células malignas a través de la destrucción del complejo CARMA3-Bcl10-MALT1. La mayoría de los factores de proliferación influyen en el crecimiento celular al afectar la progresión del ciclo celular. En este estudio, el ciclo celular análisis revelaron que el porcentaje de células en la fase G1 se aumentó, mientras que el porcentaje de células en la fase S se redujo en las células CARMA3-desmontables en comparación con las células control. Desmontables de CARMA3 inhibió el G1 a S transición en la progresión del ciclo celular, lo que sugiere el papel desempeñado por CARMA3 en la proliferación de células de cáncer de pulmón. progresión del ciclo celular está modulada por un número de moléculas. Para determinar el mecanismo potencial de CARMA3 relativa a la regulación del ciclo celular, se analizó el efecto de la caída en CARMA3 moléculas relacionadas con el ciclo celular. Se analizaron los niveles de ciclina A, ciclina D1, ciclina D3, CDK4, CDK6, p-Rb y P27 y encontramos que desmontables de CARMA3 disminuyó los niveles de la proteína ciclina D1, CDK4, CDK6, y P-Rb, pero aumentó los niveles de p27. Ciclina D1, que impulsa la progresión de las células en las fases proliferativa del ciclo celular, juega un papel importante en la tumorigénesis. La ciclina D /CDK4, 6 vía /pRb se ha demostrado previamente para ser alterado en más de 80% de los tumores humanos [26], [27]. Es un regulador clave de la G1 crítica para la transición de fase S del ciclo celular. Durante la fase G1, la pRB es inactivada por eventos de fosforilación secuenciales mediadas por diversas quinasas dependientes de ciclina (CDKs), que conduce a la liberación de los factores de transcripción E2F, la activación de muchos genes, y la progresión del ciclo celular [28]. La p27 inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina (también llamado Kip1) es una proteína inhibidora del crecimiento que bloquea la progresión del ciclo celular en la transición G1 /S [29]. Tomados en conjunto, estos resultados indican que CARMA3 controla el ciclo celular mediante la regulación de la ciclina D1, CDK4, CDK6, p-Rb y p27.
Se ha convertido en cada vez más claro que la señalización de NF-kB juega un papel crítico en el cáncer desarrollo y la progresión [30] - [34]. Nuestros resultados demuestran además una relación directa entre CARMA3 y la activación de NF-kB. El cambio de la progresión del ciclo celular después de la caída CARMA3 está potencialmente relacionada con NF-kB. NF-kappa B es el objeto de numerosos estudios de investigación farmacéutica como un objetivo para la terapia anti-cáncer. El bloqueo de NF-kappa B potencialmente detiene la proliferación de células tumorales y causa apoptosis, o aumenta la sensibilidad a la acción de agentes anti-tumorales. El presente estudio demostró que CARMA3 caída inhibe la activación de NF-kB, bloqueando así la progresión del cáncer de pulmón y que sugiere la importancia potencial de este hallazgo para nuevas terapias contra el cáncer.
Cáncer
pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en los Estados unidos y en todo el mundo. La forma principal de cáncer de pulmón es el NSCLC [35] .A pesar de los avances en la detección temprana y el tratamiento estándar, el CPCNP a menudo se diagnostica en una etapa avanzada y tiene un mal pronóstico. Descubre valiosa biomarcador para la detección de NSCLC en una etapa temprana puede mejorar sustancialmente la supervivencia. Ahora, hay muchos biomarcadores potencialmente útiles para el cáncer de pulmón han sido verificados, como CEA, CA-125, CYFRA 21-1, TPA [35] - [39]. Cada vez más biomarcadores potenciales nuevos para el cáncer de pulmón se han descubierto, como AEA, DDH, EGFR, Mig-6 [40] - [43]. En esta investigación nos encontramos con CARMA3 como otro biomarcador potencialmente útil para el cáncer de pulmón. Las identificaciones de los biomarcadores están dando lugar a una mayor comprensión de los mecanismos moleculares implicados en el cáncer de pulmón y ayuda a reducir el sufrimiento y la pérdida de vidas causada por la enfermedad letal [44].
En conclusión, nuestro estudio demostró que es CARMA3