Extracto
Aplicaciones
El tetraspanin CD151 actúa como un promotor de la metástasis y la invasión en varios tumores. Sin embargo, el papel de CD151 en el cáncer gástrico humano (HGC) sigue sin estar clara.
Métodos
Veinte muestras HGC y emparejados nontumor muestras, las células epiteliales gástricas humanas (HGEC), y cuatro celular de cáncer gástrico líneas se utilizaron para analizar la expresión de CD151. regulación a la baja mediada por ARN de horquilla corta de expresión en las células CD151 HGC se realizó para examinar el papel de CD151 en la proliferación y metástasis /invasión de células HGC
in vivo
y
in vitro
. La relación de CD151 con la integrina α3 en células HGC fue investigado por el silenciamiento α3 integrina seguido de co-inmunoprecipitación y la tinción de inmunofluorescencia. Por último, el valor pronóstico de CD151 y α3 integrina se evaluó por inmunohistoquímica en microarrays de tejidos de 76 pacientes HGC.
Resultados
CD151 se expresa en niveles más altos en los tejidos y células HGC HGC que en nontumor tejidos y células HGEC. Baja regulación de CD151 por vshRNA-CD151 metástasis deteriorada y la invasión de las células HGC-27, pero no afectó a la proliferación celular. CD151 forma un complejo con la integrina α3 en células HGC. CD151-transfección de ADNc rescatado la invasión metastásica de las células potencial y HGC-27-vshCD151, pero no los de las células a3 HGC-27-vshintegrin
in vitro
. Clínicamente, la sobreexpresión CD151 se correlacionó significativamente con la etapa de alta TNM, la profundidad de la invasión y compromiso de los ganglios linfáticos positivos (
p Hotel & lt; 0,05), y altos niveles de integrina α3 se asociaron con gran tamaño tumoral, estadio TNM alta, profundidad de la invasión y la implicación de los ganglios linfáticos (
p Hotel & lt; 0,05). Es importante destacar que el postoperatorio 5 años de supervivencia global de los pacientes con CD151
baja y /o la integrina α3
baja fue mayor que la de los pacientes con CD151
alta y /o la integrina α3
alta.
Conclusión
CD151 se asocia positivamente con la invasividad de HGC, y CD151 o la combinación de CD151 y la integrina α3 es un nuevo marcador para predecir el pronóstico de los pacientes HGC y puede ser potenciales dianas terapéuticas.
Visto: Yang YM, Zhang ZW, Liu QM, Sun YF, Yu JR, Xu WX (2013) la sobreexpresión de CD151 Predice el pronóstico en pacientes con cáncer gástrico resecado. PLoS ONE 8 (3): e58990. doi: 10.1371 /journal.pone.0058990
Editor: Yves St-Pierre, INRS, Canada |
Recibido: 7 Octubre de 2012; Aceptó 8 de febrero de 2013; Publicado: 22 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de estación de trabajo académico del hospital de Shaoxing segundo pueblo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer gástrico humano (HGC) es la causa más frecuente de muerte relacionada con el cáncer [1]. La incidencia de HGC se estimó en 934.000 casos por año con un 56% de los nuevos casos se producen en el Este de Asia, incluyendo 41% en China y 11% en [2] Japón. A pesar de que la incidencia global de GC ha disminuido en los últimos años, su tasa de mortalidad en China es la más alta entre todos los tumores y representa el 25% de la mortalidad en todo el mundo GC [3]. A pesar de los recientes avances en la quimioterapia y técnicas quirúrgicas, la tasa de supervivencia a 5 años global (SG) en China es inferior en un 40%. La mayoría de HGC se diagnostican en estadio III o IV, y la tasa de metástasis en los ganglios linfáticos de la GC es alto (50-75%) [4]. La patogénesis de la HGC es multifactorial, incluyendo la predisposición genética y los factores ambientales. Varias alteraciones genéticas se asocian con la predisposición a la HGC, incluyendo aquellos que implican los genes supresores de tumor, oncogenes, moléculas de adhesión celular, factores de crecimiento, y la inestabilidad genética [5]. Por lo tanto, el logro de una mejor comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la HGC y la identificación de marcadores de diagnóstico valiosas y nuevas estrategias terapéuticas es de gran importancia clínica.
tetraspaninas son proteínas de la superficie celular que atraviesan la membrana cuatro veces, y se encuentran en varios tipos de células en muchos organismos. En ellas se muestran numerosas propiedades indicativo de su importancia fisiológica en la adhesión celular, la motilidad, la activación y la proliferación, así como su contribución a condiciones patológicas tales como la metástasis y la angiogénesis patológica [6], [7], [8]. CD151 es una glicoproteína de superficie celular que pertenece a la superfamilia tetraspanin que fue mostrado por primera vez para promover la metástasis en un estudio en el que un anticuerpo desconoce la formación de metástasis inhibe específicamente en un carcinoma epidermoide humano
in vivo
[
9
]. El anticuerpo reconoce CD151 y se inhibe la migración de células sin afectar a la adhesión o la proliferación. Pequeños ARN de interferencia (siRNA) mediada por la regulación negativa de la expresión de CD151 en los melanocitos primarios como resultado la pérdida de la motilidad, mientras que tenía poco efecto sobre los niveles de estado estacionario de las integrinas. Además, estas alteraciones podrían invertirse cuando CD151 fue re-expresa [10]. La sobreexpresión de CD151 fue mostrado para activar vías de señalización dependientes de integrinas y los receptores del factor de crecimiento, lo que resultó en el aumento de la motilidad y capacidad de invasión de las células del cáncer [11]. Este proceso también se sugirió para contribuir a la activación de las vías mediadas por GTPasas pequeñas, lo que aumenta la unión a Cdc42 y Rac, los organizadores del citoesqueleto de la célula GTP. La activación de la adhesión dependiente de Ras, ERK /MAPK1 /2 y la proteína quinasa B (PKB) /Akt se ha demostrado que ser modulada por CD151 [7], [12]. La amplia gama de funciones de CD151, y en particular su participación en la invasión y la metástasis de las células cancerosas, sugieren que una mejor comprensión de su expresión y su papel en la HGC puede ser importante.
En el presente estudio, se investigado la expresión de CD151 en las células epiteliales gástricas humanas (HGEC), líneas celulares, muestras HGC HGC y los tejidos adyacentes nontumorous. Además, se analizó el efecto de siRNA silenciamiento de CD151 sobre la proliferación, la invasión y la capacidad metastásica de las células HGC-27, y se examinó la relación entre CD151 y α3 integrina. Por último, la expresión de CD151 y α3 integrina fue examinado por inmunohistoquímica en una micromatriz de tejido que consiste en 76 casos de HGC, y el papel pronóstico de CD151 y /o α3 integrina en HGC se investigó.
Materiales y Métodos
líneas celulares
líneas celulares HGEC y HGC, incluyendo HGC-27, AGS, MKN28, y MGC803, se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se mantienen en nuestro laboratorio. Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone) a 37 ° C en un incubador humidificado bajo 5% de CO
2.
Pacientes y seguimiento
Veinte muestras de tumores frescos de las zonas cercanas al margen del tumor y los tejidos no tumorales emparejados (más de 3 cm de distancia del tumor) fueron ciegamente obtenidas de pacientes consecutivos con HGC que fueron sometidos a resección curativa entre febrero 2009 y noviembre de 2010 a Shaoxing Segundo hospital Popular (Shaoxing, china). Otros 76 pacientes con cáncer gástrico sometidos a resecciones R0 con disección de ganglios linfáticos extendida (D2) entre septiembre de 2005 y septiembre de 2008 a Shaoxing Segundo Hospital Popular se inscribieron en este estudio. La evaluación de las piezas de resección se realizó de acuerdo con las directrices de la Asociación Japonesa del Cáncer Gástrico (1998). Cada una resección norma implicó la eliminación de los grupos 1 y 2 ganglios linfáticos (rango 36-60, con una media de 47,6). clasificación de la etapa se realizó de acuerdo a la clasificación TNM para el HGC (UICC). Los especímenes fueron seleccionados sobre la base de la disponibilidad de tejidos adecuados, fijado en formol e incluidos en parafina y clínico patológica completa y los datos de seguimiento de los pacientes. Las características de los sujetos del estudio se resumen en la Tabla 1. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Shaoxing segundo pueblo Research Hospital y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los individuos. Ninguno de los pacientes recibió quimioterapia o terapia de radiación antes o después de la cirugía como parte de un programa de adyuvante. la recopilación de datos de seguimiento se terminó en septiembre de 2012. La mediana de seguimiento fue de 43,0 meses (rango 6-78 meses). Los procedimientos de seguimiento consistieron en la historia tanto, el examen físico, evaluación de marcadores tumorales (CEA, CA-199), la ecografía abdominal y la radiografía de tórax cada 2-3 meses o TC cada 6 meses. La supervivencia global (OS) se definió como el intervalo entre la cirugía y la muerte o entre la cirugía y la última observación en pacientes supervivientes. Los datos fueron censurados en la última visita de seguimiento para los pacientes que viven.
La extracción de RNA y transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
El ARN total fue extraído utilizando el TRI Reactivo (Sigma) de acuerdo con el protocolo del fabricante. a continuación, el ARN se trató con ADNasa I (Roche Diagnostics), se purificó a través de una columna RNeasy (Qiagen) y se sometió a electroforesis para determinar la integridad del ARN antes de su uso en experimentos de 5'-RACE. ADN complementario (ADNc) se sintetizó a partir de 2 g de ARN total usando hexámeros aleatorios (Proligo) y superíndice III Reverse Transcriptase (Invitrogen). RT-PCR se llevó a cabo en un panel de líneas celulares y muestras tumorales. Los cebadores utilizados para la PCR fueron las siguientes: CD151, 5'-ACTTCATCCTGCTCCTCATCAT-3 'y 5'-TCCGTGTTCAGCTGCTGGTA-3'; integrina α3, 5'-CGAGAGGAAAGAGGAAGTAGGGGGT-3 'y 5'-ATGAAGAAGGAGTGAGGGGTGAGCA-3'; Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), 5'-GGCATCCTGGGCTACACTGA-3 'y 5'-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'. Las condiciones de RT-PCR fueron las siguientes: 10 min a 94 ° C, la desnaturalización a 94 ° C durante 20 s, hibridación a 59 ° C durante 30 s, y extensión a 72 ° C durante 60 s. La expresión de CD151 y la integrina α3 en relación con la limpieza gen GAPDH se analizó mediante análisis de densidad utilizando el software v5.0 Exploración de Banda. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Immunoblotting y ensayo de inmunofluorescencia
Total proteína extracto de células (30 g) se separó por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno, y se incubaron con el anticuerpos correspondientes. Las membranas fueron desarrollados con el método de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Mouse anti-humano CD151 (11G5a, 1:200; Serotec, Reino Unido) y anti-integrina anticuerpos monoclonales a3 (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) se utilizaron para detectar la expresión de CD151 y α3 integrina, respectivamente . GAPDH (1:5,000; Chemicon, EE.UU.) se utilizó como control interno. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
se utilizaron HGC-27 células para detectar la ubicación de CD151 y α3 integrina como se describe anteriormente [13]. Se han usado de ratón anti-humano CD151 anticuerpo monoclonal (11G5a, 1:200;; Serotec, Reino Unido) y anticuerpo de ratón anti-humano de integrina α3 (Chemicon International, Temecula, CA P1B5, 1:300). Los cortes fueron analizados por microscopía de fluorescencia (Leica Microsystems Imaging Solutions).
La transfección de vectores de Lentiviral con pequeña horquilla de ARN contra CD151 y integrina α3
El vector pGMLV /Neo-shRNA-CD151 se construyó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (pGMLV, una pequeña horquilla de ARN (shRNA) i Vector, Shanghai Genomeditch Co. Ltd). Tres vectores de lentivirus shRNA-CD151 (pGMLV-GFP-shRNA -CD151) se generaron para silenciar la expresión de CD151 en HGC-27 células (shRNA-CD151-HGC-27). Las secuencias de direccionamiento shRNA para CD151 fueron los siguientes:#1, 5'-CATGTGGCACCGTTTGCCT-3 ';#2, 5'-TACCTGCTGTTTACCTACA-3 ';#3, 5'-CATACAGGTGCTCAA AATA-3 '. La secuencia de focalización shRNA de la integrina α3 fue el siguiente: 5'-CCTCTATATTGGGTACACGAT-3 '(Shanghai Genomeditech, Shanghai, China). Establemente transfectadas clones se caracterizaron por RT-PCR y se analizaron por inmunotransferencia para los niveles de expresión del CD151 y proteínas integrinas a3.
MTT de ensayo, la migración celular, y la invasión de Matrigel Ensayos
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (2.000 por 200 l pocillos) y se incubaron durante 24, 48, y 72 h. Se añadió un volumen 20 l de solución de MTT en los puntos de tiempo indicados y se incubaron durante 4 h. El (DMEM 200 l que contenía suero bovino fetal al 10%) medio fue entonces reemplazado por 150 l DMSO, las placas se agitaron durante 10 min y se midió la absorbancia a 490 nm para determinar el número de células viables en cada pocillo. Todos los experimentos se realizaron tres veces. Se evaluó
La migración celular usando un ensayo de cicatrización de heridas. Las células fueron cultivadas a 80-90% de confluencia en placas de 24 pocillos. Una herida se hizo arrastrando una punta de pipeta de plástico a través de la superficie de la célula. Las células restantes se lavaron tres veces para eliminar los desechos celulares y se incubaron a 37 ° C con medio libre de suero. En los tiempos indicados, las células que migran en la parte delantera de la herida se fotografiaron y se comparan. Se realizaron tres experimentos separados
ensayos de la invasión de células se realizaron utilizando cultivos polarizados de 24 pocillos (tamaño de poro 8 micras; Millipore). recubiertas previamente con Matrigel (Falcon 354480; BD Biosciences). Un total de 1 × 10
a continuación, 5 células se suspendió en 500 l DMEM que contiene 1% de FBS y se añadieron a la cámara superior, mientras que 750 l DMEM que contiene 10% de FBS se colocó en la cámara inferior. Después de 48 h de incubación, Matrigel y las células restantes en la cámara superior se retiraron por hisopos de algodón. Las células en la superficie inferior de la membrana se fijaron en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con Giemsa. Las células en 5 campos microscópicos (magnificación, × 200) se contaron y se fotografiaron. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
En Vivo Metástasis Ensayos
Para los ensayos de metástasis in vivo, MGC-803-Mock, MGC-803-vshRNACD151 y MGC-803-CD151-vshRNA cADN células CD151 fueron trasplantadas en ratones desnudos (5 semanas de edad BALB /c-nu /nu, 5 por grupo, 1 × 10
6 células por ratón) a través de la vena lateral de la cola [14]. Después de 7 semanas, se sacrificaron los ratones. Sus pulmones se retiraron y se sometieron a hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción. Toda la investigación con animales se realizó de acuerdo con los protocolos aprobados por la Comisión de Cuidado Animal Hospital es la segunda personas Shaoxing.
Co-inmunoprecipitación (Co-ip) Ensayos
Las células se lisaron con tampón de lisis RIPA suplementado con NaF 40 mM, 100 mM Na
3Vo
4, y completa inhibidor de la proteasa (Roche). Después de retirar el material insoluble por centrifugación a 12.000 x g, los lisados precleared se incubaron con la proteína pre-absorción mAb primario A- y perlas de G-Sepharose (Pierce Biotechnology) durante la noche a 4 ° C. Los precipitados se lavaron tres veces con tampón de lisis, hervidas en tampón de muestra 2 x SDS durante 5 minutos, y las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE en geles de gradiente de 10%. inmunotransferencias posteriores se sondearon con el anticuerpo apropiado y detectados por ECL.
Construcción de microarrays de tejidos e inmunohistoquímica
microarrays de tejidos se construyeron como se describe anteriormente [15]. En resumen, todas las muestras de pacientes HGC fueron revisados histológicamente por hematoxilina & amp; eosina, y áreas de representación fueron previamente marcada en los bloques de parafina, separado de materiales necróticas y hemorrágicas. Los duplicados de cilindros 1 mm de diámetro a partir de dos áreas diferentes, el centro del tumor y el margen no canceroso más cercano (designados como intratumoral y peritumoral, respectivamente; un total de cuatro golpes) se incluyeron en cada caso, junto con diferentes controles, para asegurar la reproducibilidad y la tinción homogénea de las diapositivas (Shanghai Biochip Co. Ltd, Shanghai). Por lo tanto, se construyeron cuatro bloques de microarrays de tejidos diferentes, cada uno que contiene 140 cilindros. Secciones 4 micras de espesor se colocaron en portaobjetos recubiertos con 3-aminopropiltrietoxisilano. Monoclonal de ratón anti-humano CD151 (11G5a, 1:200; Serotec, Reino Unido) y el ratón α3 integrina anti-humana (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) anticuerpos se utilizaron para detectar la expresión de CD151 y α3 integrina . Las imágenes fueron capturadas por el software Leica v3 QWin Plus. La intensidad de tinción positiva se midió como se describe. La intensidad de CD151 y integrina α3 se clasificó en dos niveles de expresión de acuerdo con la zona media de la tinción positiva como el valor de corte de la siguiente manera: CD151
alta, & gt; 50% de la sección de tumor; y α3 integrina
alta, & gt; 25% de la sección del tumor; CD151
bajo, & lt; 50%, y la integrina α3
bajo, & lt; 25% [15]
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el software SPSS 16.0 (. SPSS). Los valores se expresan como la media ± desviación estándar. Para marcadores inmunohistoquímicos, el punto de corte para la definición de subgrupos fue valor de la mediana intensidad. La χ
2-test y la prueba t de Student se utilizaron para las comparaciones entre los grupos. OS se definió como se describe anteriormente [15]. Significado pronóstico se evaluó utilizando las estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier y log-rank pruebas. modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox se utilizó para analizar los factores pronósticos independientes. Todas las pruebas fueron de dos colas y
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
CD151 se sobreexpresa en HGC
expresión de CD151 se analizó. por RT-PCR e inmunotransferencia en el tumor y los tejidos no tumorales HGC emparejados. CD151 se expresa en niveles bajos en tejidos no tumorales en comparación con tejidos HGC. Como se muestra en la Fig. 1A, B y C, la expresión relativa de la proteína CD151 en muestras HGC fue de 2,95 ± 0,21 (rango, 1,13 - 3,59) en comparación con 1,30 ± 0,09 (rango, 1,00-1,81) en muestras no tumorales, y la diferencia fue estadísticamente significativa (
p Hotel & lt; 0,01). Además, CD151 niveles de expresión fueron significativamente inferiores en HGEC que en HGC-27, AGS, MKN28 y MGC803 células (p & lt; 0,05). No se detectaron diferencias en los niveles de expresión entre las células CD151 HGC (Fig. 1D, E y F). Immunohistochemstry (IHC) Los análisis confirmó que la proteína CD151 se expresa en niveles más altos en los tejidos que en HGC emparejado no tumoral tejidos (Fig. 1G).
(A) La expresión de CD151 ARNm y proteínas en muestras de GC y la emparejado muestras nontumorous; (B y C) un histograma mostró CD151 mRNA en muestras de GC y las muestras no tumorosas emparejados (p & lt; 0,05); (D) RT-PCR e inmunotransferencia analizaron la expresión de CD151 en HGEC y HGC-27, AGS, MKN28 y MGC803 células (p & lt; 0,05); (E y F) Un histograma mostraron CD151 ARNm y proteína en HGEC y HGC-27, AGS, MKN28 y MGC803 células (p & lt; 0,05).
CD151 Promovida la invasión y la metástasis de las células HGC
in vitro e in vivo
Para examinar el papel de CD151 en las células HGC, se modificó la expresión de CD151 en las células HGC-27 por la interferencia de ARN y transfección de ADNc-CD151 (Fig. 2A) . Los resultados del ensayo de curación de la herida mostraron un retraso en la velocidad de cierre de la herida de shRNA-CD151-HGC-27 células a las 48 h en comparación con las células HGC-27-Mock, que fue recuperado por ADNc de CD151 de la transfección (Fig. 2B). Down-regulación de CD151 no tuvo efecto significativo sobre la proliferación celular (
p
& gt; 0,05, Fig 2C.). Sin embargo, la regulación a la baja de la expresión de CD151 deteriora la capacidad de invasión de las células HGC-27 (figuras 2D, E.)
(A) La expresión de CD151 en HGC 27 células por interferencia de ARN y transfección de ADNc-CD151.; (B) El abajo /o regulación de CD151 no tienen ninguna influencia sobre la proliferación celular (
p Hotel & gt; 0,05); (C) El ensayo de cicatrización de heridas reveló que un retraso evidente en la tasa de cierre de la herida de las células HGC-27-vshRNA-CD151 fue encontrado a las 24 y 48 horas, en comparación con las células HGC-27-Mock, mientras que fue la recuperación de cADN transfección CD151; ensayos de invasión (D y E) mostraron que Matrigel abajo /o la regulación de la expresión de CD151 fue acompañado por un descenso /o ascender invasión de células HGC in vitro; (F y G) Las secciones seriadas de pulmón de ratón mostraron la capacidad de metástasis de las células cancerosas que expresan diferentes (barra de escala: 50 micras) CD151.
Para estudiar más a fondo el papel de CD151 en la metástasis tumoral in vivo, MGC-803-Mock, MGC-803-vshRNACD151 y MGC-803-vshRNACD151-ADNc-CD151 células fueron trasplantadas en ratones desnudos a través de la vena lateral de la cola. El análisis histológico de los pulmones de los ratones confirmó que la baja regulación de CD151 suprime la formación de metástasis de pulmón. Los números y el tamaño de los nódulos de metástasis pulmonar se redujo significativamente en el grupo de MGC-803-vshRNACD151 en comparación con las células MGC-803-vshRNACD151-ADNc-CD151 (Fig. 2 F, G) MGC-803-Mock y. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que CD151 es un regulador positivo de la metástasis del cáncer gástrico.
CD151 forma un complejo con la integrina α3 y silenciamiento de la integrina α3 Perjudicial HGC invasión celular inducida por CD151 sobreexpresión
La participación de tetraspanins en la regulación mediada por la integrina de la metástasis del cáncer se ha demostrado, y α3β1 integrina se ha demostrado que la promoción de la invasión y la metástasis GC [16]. Por lo tanto, se investigó la relación entre la integrina α3 y CD151 en las células HGC. Como se muestra en la Fig. 3A, α3 integrina se expresó en niveles altos en las células HGC que en las células HGEC. Co-immunoprecipitation experimentos mostraron que CD151 forma un complejo con la integrina α3 en HGC-27 células (Figs. 3B, C). Por otra parte, CD151 y α3 integrina co-localizados en la membrana plasmática de las células HGC-27 como se muestra por inmunofluorescencia (Fig. 3D).
(A) La expresión de la integrina α3 eran mucho más altos en las células HGEC y HGC ; (B y C) El co-IP identifica que la integrina α3 forman un complejo con la integrina α3; (D) Doble tinción indicó que la CD151 y integrinα3 co-localizada en la membrana de HGC-27 células; (E) La baja regulación de la integrina α3 en las células HGC; ensayos de invasión (F) de Matrigel mostraron que la baja regulación de la integrina α3 fue acompañado por un descenso invasión de las células HGC, los anticuerpos de interferencia integrina α3 y a3 integrina inhiben la invasión de células dotado por CD151.
Para examinar aún más la participación de CD151 en la integrina función α3, las células fueron sometidas a la interferencia de ARN o la transfección de ADNc y se analizaron mediante experimentos Transwell después de reemplazar el gel de matriz con laminina-332 [17]. Los resultados mostraron que el silenciamiento de la integrina α3 marcadamente inhibida la invasión de HGC-27 células, y CD151 cDNA transfección rescatados la capacidad invasiva de HGC-27-vshRNACD151, pero no la de HGC-27-vshRNA integrina células a3. Además, los anticuerpos de integrina a3 inhibieron la invasión de las células HGC-27-vshRNACD151-cDNA-CD151 (Figs. 3E, F). Estos resultados sugieren la función coordinada del complejo α3 CD151-integrina, e indicaron que los altos niveles de CD151 y α3 integrina están asociados con el aumento del potencial metastásico de las células de GC.
Expresión de CD151 o integrina α3 está positivamente asociado con fenotipos malignos de HGC por inmunohistoquímica
La expresión de CD151 y la integrina α3 proteína se investigó en 76 pacientes HGC primarios utilizando microarrays de tejidos (TMA). CD151 proteína inmunoreactividad localiza en la membrana celular (Fig. 4A). En los tejidos tumorales, la expresión de CD151 mostró una heterogeneidad considerable en las diferentes muestras (Figs. 4a1, B1, C1 y D1). CD151
alta representaron el 50% (38/76) de toda la cohorte. Como se muestra en la Tabla 1, CD151
alta fue significativamente correlacionado con el tamaño del tumor (
p = 0,021
), la profundidad de la invasión (
p = 0,004
), compromiso de los ganglios linfáticos (
p = 0,028
) y estadio tumoral alto (
p = 0,002
). Sin embargo, otras características clínicas, incluyendo la edad, el sexo y la diferenciación del tumor, no fueron significativamente relacionados con la expresión de CD151.
(A) La inmunorreactividad de CD151 y proteínas integrinα3 se encuentra en las membranas celulares. En los tejidos tumorales, la expresión de CD151 mostró una heterogeneidad considerable en las diferentes muestras (Fig.4a1, B1, C1 y D1). Se observó tinción positiva de Integrinα3 en la membrana de las células de carcinoma (Fig. 4 a2, b2, c2, y d2). (B, C y D) Significado pronóstico evaluada por las estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier y log-rank pruebas. Las comparaciones de OS por CD151 (B), Integrinα3 (C), y co-sobreexpresión de CD151 y integrinα3 (D).
Las membranas de las células tumorales teñidas positiva para la integrina α3 (Figs. 4a2, b2, c2, y d2). En todos los tejidos analizados, se detectaron altos niveles de expresión de la integrina α3 en 27 muestras de tejido HGC (35,52%). En consonancia con los resultados de estudios anteriores [16], [18], los pacientes con expresión de la integrina α3 alta eran más propensos a exhibir características agresivas. Integrina α3
pacientes de alto mostraron tumores de mayor tamaño (
p =
3.46E-4), mayor profundidad de la invasión (
p = 0,001
), superior etapa del tumor (
p =
0,005), y una mayor implicación de los ganglios linfáticos (
p = 0,040
) que los pacientes con expresión de la integrina α3 baja (Tabla 1).
La sobreexpresión de CD151 y /o α3 integrina son independientes los factores que predicen el pronóstico de los pacientes HGC
hasta el último seguimiento, los niños de 3 y 5 años las tasas de SG en toda la población eran 53,0 y 40,78%, la SG a 5 años en el CD151
baja grupo fue significativamente mayor que en el CD151
grupo alto (68,42%
vs.
23.68%, respectivamente,
p = 0,007
, Fig. 4B), y el postoperatorio SG a 5 años de los pacientes HGC fue mayor en el α3 integrina
baja que en el α3 integrina
grupo alto (66,67%
vs.
13,51%,
p = 6,67
E-6). Evaluación del efecto combinado de CD151 y α3 integrina en el pronóstico de HGC mostró que la SG a 5 años de CD151
alta /α3 integrina
pacientes de alto (grupo III, n = 23) fue de 17.40%, lo que era significativamente menor que la de CD151
baja /α3 integrina
pacientes bajo (grupo 77.78% I, n = 27) y, o bien pacientes bajos (los pacientes con cualquiera de baja CD151 o baja α3 integrina solo) (23,08% en el grupo II , n = 26, Figs. 4C y D).
El análisis univariado mostró que el tamaño del tumor, profundidad de la invasión, la afectación ganglionar, estadio tumoral alto, la expresión de CD151 alta, alto nivel de la integrina α3 y co-expresión de CD151 y α3 integrina fueron predictores para OS. Otras características incluyen la edad, el sexo y la diferenciación no tenían ningún significado pronóstico para el sistema operativo (Tabla 2). Multivariado de riesgos proporcionales de Cox modelo mostró que la profundidad de la invasión era un indicador pronóstico independiente para el sistema operativo (Tabla. 2).
Discusión
Los resultados del presente estudio mostraron que CD151 se expresó en niveles más altos en las células de GC y los tejidos tumorales que en las células HGEC y tejidos no tumorales, lo que es consistente con informes anteriores sobre la expresión de CD151 en una variedad de tumores, incluyendo colangiocarcinoma intrahepático, HCC, de mama, de pulmón, cáncer de próstata [15] de colon y, [19], [20], [21]. Además, nuestro estudio mostró que CD151 forma un complejo funcional con α3 integrina, y regulación por disminución de la expresión de integrina CD151 o α3 marcadamente inhibida la invasión y metástasis de las células HGC in vitro. Clínicamente, nuestros resultados indican que la expresión de alto nivel de CD151 o el co-sobreexpresión de CD151 y α3 integrina puede tener consecuencias desfavorables pronósticos para los pacientes con GC
.
La evidencia inicial de que CD151 promueve la metástasis vino de un estudio que muestra que un anticuerpo con especificidad desconocida inhibe la formación de metástasis por una línea de carcinoma epidermoide humano
in vivo
. El anticuerpo reconoce CD151 y se inhibe la migración de células sin afectar a la adhesión o la proliferación [22]. La sobreexpresión de CD151 se ha detectado en muchos tipos de tumores, y el aumento de la expresión de CD151 se ha asociado con un mal pronóstico en cáncer de mama, de páncreas, y cáncer de pulmón no de células pequeñas, así como HCC. Por otra parte, CD151 se ha demostrado que es un mejor predictor de pronóstico en pacientes con cáncer de próstata que el grado histológico [23]. En el presente estudio, dos líneas de evidencia indican que la sobreexpresión de CD151 es de importancia clínica en HGC. En primer lugar, la sobreexpresión CD151 se observó con mayor frecuencia en los pacientes con mal pronóstico HGC. En segundo lugar, el aumento de expresión de CD151 aumentó la invasión y metástasis de las células HGC. Además, los datos clínicos reveló que una elevada expresión CD151 superó otros parámetros clínicos usados comúnmente como el aumento de tamaño del tumor y una pobre diferenciación para predecir HGC pronóstico. Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que CD151 juega un papel importante en la progresión de HGC. En el presente estudio, mostramos que interactúa con la integrina CD151 en las células α3 HGC. La modulación de los niveles de expresión de la integrina α3 en células HGC-27-vshCD151-cDNA-CD151 reveló la formación de un complejo α3 CD151-integrina funcional y mostró que co-sobreexpresión de CD151 y α3 integrina se asoció con un aumento de potencial metastásico de células HGC . Teniendo en cuenta el papel de la integrina α3 establecido en HGC [16], es razonable suponer que la sobreexpresión CD151 puede promover la metástasis /invasión en GC.
Debido a su naturaleza hidrofóbica, tetraspanins asociado entre sí y con otra membrana proteínas [24]. De hecho, está bien establecido que tetraspanins proporcionan una plataforma de señalización en la membrana plasmática a través de la formación de microdominios enriquecidos tetraspanin (TEM) [6], [7]. Hasta la fecha, diferentes tipos de proteínas de membrana, incluyendo receptores de factor de crecimiento, integrinas, dominios de inmunoglobulina y EWI-F (una subfamilia de proteínas Ig) se han encontrado en TEM [25]. Por otra parte, se ha informado de que se asocia íntimamente con TEM las funciones de estas proteínas de membrana. Por ejemplo, se encontraron diferentes combinaciones de tetraspanins forman TEM para afectar a la función de los receptores del factor de crecimiento y la integrina. Más importante aún, el nivel de expresión de tetraspanins individuales en TEM también tiene un efecto significativo en las proteínas asociadas [26], [27]. En estudios recientes, derribo de CD151 fue mostrado perjudicar la formación de los sistemas y CD151 eliminación inhibe la función de varias proteínas de membrana, lo que indica que CD151 juega un papel fundamental en la formación y función TEM [7], [26]. Además, el bloqueo de CD151 notablemente afectada la invasividad y el potencial metastásico de las células tumorales, y la orientación de la proteína CD151 o TEM se ha convertido en una estrategia terapéutica prometedora [23]. En el presente estudio, la expresión de CD151 mostró ser un predictor independiente para el sistema operativo. Sin embargo, la expresión combinada de CD151 y α3 integrina fue un predictor más fiable de OS que CD151 o la expresión de integrina α3 solo, apoyando la noción de que tanto CD151 y α3 integrina juegan un papel importante en HGC. Por lo tanto, nuestros resultados son significativos y sugieren que CD151 o el complejo α3 CD151-integrina pueden ser objetivos importantes en el tratamiento de pacientes con CG
En conclusión., CD151 sobreexpresión es un predictor de mal pronóstico en pacientes con HGC