Extracto
epitelial de carcinoma de ovario (EOC) es un tumor agresivo a menudo se diagnostica en una etapa avanzada, cuando hay poca o ninguna perspectiva de cura. A pesar de los avances en las estrategias quirúrgicas y quimioterápicos, se han obtenido sólo mejoras marginales en la evolución del paciente. Por lo tanto, desentrañar los mecanismos biológicos que sustentan la progresión EOC es fundamental para mejorar la supervivencia de los pacientes. Recientemente, se informó de que CD157 (un ectoenzyme regulación de leucocitos diapedesis) se expresa en EOC y que la alta expresión de la molécula se correlaciona negativamente con el resultado de la enfermedad en los pacientes. Aquí, demostramos que la sobreexpresión forzada de CD157 en OVCAR-3, TOV-21G, A2780 y OV-90 líneas celulares de cáncer de ovario promueve cambios morfológicos y fenotípicos que se caracterizan por la ruptura de las uniones intercelulares, regulación a la baja de los marcadores epiteliales y mesenquimales regulación al alza de los. Estos cambios en la forma celular y el fenotipo llevar a la reducción de la sensibilidad a la anoikis, el aumento de crecimiento independiente de anclaje, la motilidad celular y la invasión mesotelial. Por el contrario, desmontables de CD157 en células OV-90 y OC314 revierte el fenotipo mesenquimal y reduce el potencial migratorio de las células. El análisis de perfiles de transcriptoma resaltado 378 genes expresados diferencialmente de manera significativa, lo que representa la firma de las células CD157 con sobreexpresión OVCAR-3 y OV-90. La modulación de los genes seleccionados se traduce en la alteración de la expresión de proteínas que dan las células un fenotipo altamente maligno. El cuadro general deducida a partir del análisis de las transcripciones moduladas es que la alta expresión de CD157 fortalece una serie de procesos biológicos que favorecen la progresión del tumor (incluyendo el desarrollo y la motilidad celular), y debilita varios procesos biológicos que impiden la progresión del tumor (por ejemplo, apoptosis, muerte celular y respuesta al estrés). En conjunto, estos hallazgos implican CD157 en la progresión de EOC para enfermedad metastásica y sugieren que CD157 puede representar una diana terapéutica valiosa
Visto:. Morone S, Lo-Buono N, Parrotta R, Giacomino A, Nacci G, Brusco A, et al. (2012) La sobreexpresión de CD157 contribuye a la progresión del cáncer epitelial de los ovarios promoviendo la diferenciación mesenquimal. PLoS ONE 7 (8): e43649. doi: 10.1371 /journal.pone.0043649
Editor: Sandra Oršulić, el Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Abril de 2012; Aceptado: 23 de julio de 2012; Publicado: 20 Agosto 2012
Copyright: © Morone et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de subvenciones de la Asociación italiana para la Investigación del cáncer (AIRC, MFAG6312 e IG 11602 EO), del Ministerio italiano de Universidad e Investigación Científica (PRIN y el 60% Proyectos de AF) y de la Fundación Internacional para la Investigación en Medicina Experimental. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cáncer de ovario
epitelial (EOC) es una neoplasia ginecológica agresiva y letal. Más del 70% de los pacientes se presentan con enfermedad avanzada y, a pesar de un tratamiento agresivo, los 5 años de tasa de supervivencia de los pacientes con EOC es inferior al 50%. Este mal pronóstico resulta de la dificultad del diagnóstico en las fases clínicas iniciales y la falta de una terapia eficaz para tumores en estadios avanzados. La comprensión de los mecanismos biológicos que regulan la progresión de la EOC tanto, es fundamental para la elaboración de nuevas opciones de tratamiento y mejorar la supervivencia de los pacientes
. Se piensa
EOC de procedencia del epitelio superficial del ovario que recubre el ovario. células EOC pueden arrojar desde el tumor primario y, porque no es una barrera anatómica está presente, se extendió directamente por toda la cavidad peritoneal y luego difundir principalmente a través del sistema linfático, el desarrollo de los mecanismos de defensa necesarios para la supervivencia en condiciones independientes de anclaje [1]. En el ambiente del tumor, localizada la degradación proteolítica de la matriz extracelular (ECM) facilita la migración de las células de flotación, lo que les permite ancla para el mesotelio y posteriormente invadirla, el establecimiento de tumores en los sitios secundarios. diseminación tumoral implica una conversión fenotípica de las células epiteliales, que no son móviles, en las células mesenquimales. Este proceso tiene notables similitudes con la transición epitelio-mesenquimal (EMT) que ocurren durante el desarrollo embrionario [2]. De hecho, el tipo 3 o EMT oncogénico se reconoce cada vez más como un mecanismo dinámico y transitorio por células en los tumores no invasivos primarios adquieren propiedades esenciales para la migración, la invasión, la diseminación metastásica y la resistencia a la apoptosis [3]. El programa EMT puede ser inducida por una variedad de señales contextuales que las células pueden experimentar en el microambiente tumoral; con independencia de las señales de activación, la activación de la EMT se asocia con un mal resultado clínico en diferentes tipos de tumores, incluyendo el cáncer [4] de ovario. moléculas de la superficie celular que participan en el control de procesos tales como la célula-célula, la adhesión ECM celular, la migración intraperitoneal localizada y la invasión del peritoneo por células o agregados de células (esferoides) flotante se cree que desempeñan un papel fundamental en la progresión COE y, en última instancia, , en el resultado de los pacientes.
CD157 /BST-1, un elemento anclado a GPI de una familia de NADase ciclasa /ADP-ribosil, es un ectoenzyme que escinde extracelular nicotinamida adenina dinucleótido (NAD
+) , generando ribosa cíclica ADP (cADPR) y ADPR [5], [6]. Además, CD157 establece interacciones funcionales y estructurales con otras moléculas transmembrana adquiriendo de este modo la capacidad de transducir señales intracelulares [7] - [9]. Aunque CD157 se caracterizó inicialmente como un estroma [10] y la glicoproteína de superficie mieloide [11] que participan en el control de la migración celular y la diapedesis [12], hemos demostrado que la CD157 es expresada también por & gt; 90% de EOC primaria y que el alto niveles de CD157 se asocian con recidiva tumoral rápida en pacientes con EOC. Consistentemente con estos resultados, la inhibición de la actividad de CD157, por un anticuerpo monoclonal específico (mAb)
in vitro
o por su expresión débil en pacientes, se asocia con una reducción de invasión de células tumorales y la migración. La asociación de CD157 con la agresividad COE ha sido confirmada por la observación de que la expresión exógena de CD157 en las células EOC apenas móviles, CD157-negativos aumenta sustancialmente la motilidad celular, un prerrequisito para la invasión de células tumorales en los tejidos circundantes [13].
La implicación de CD157 en la motilidad celular y la invasión tumoral, y su asociación con un peor pronóstico en pacientes con cáncer de ovario, nos llevó a investigar aún más su papel biológico en la progresión del COE usando líneas celulares de cáncer de ovario ingeniería como modelo experimental. El objetivo final era entender cómo la función de CD157 podría contribuir a un cáncer de ovario más agresivo y si CD157 podría ser útil para ayudar a la gestión de estos pacientes.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares Reactivos y
las líneas celulares humanas EOC OVCAR-3 y OV-90 y la línea de células mesoteliales pleurales no malignas Met-5A se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las líneas celulares EOC TOV-21G y A2780 fueron proporcionados por M. F. Di Renzo (Universidad de Turín, Italia) y OC314 facilitado por S. Ferrini (Instituto para la Investigación y Tratamiento del Cáncer, Génova, Italia). El anti-CD157 mAb (SY /11B5, proporcionado amablemente por F. Malavasi, Universidad de Turín, Italia) fue producida en laboratorios y la afinidad de los autores purificados en proteína G (Sigma-Aldrich). El F-Alexa 488 marcado (ab ')
2 fracción de anticuerpos de cabra contra IgG de ratón o de IgG de conejo eran de Molecular Probes (Milán, Italia). Anti-E-cadherina mAb fue de BD Biosciences (Milán, Italia), anti-Caracol, anti-ZEB1, anti-EpCAM, anti-VCAN, anti-BMP-7, anti-tubulina, anti-β-catenina, anti-N- cadherina y anti-β-actina-peroxidasa de rábano (HRP) mAb eran de Santa Cruz Biotecnologías (Santa Cruz, CA), anti-lamin B1 fue de Abcam (Cambridge, UK). faloidina marcada con TRITC utilizado para detectar la F-actina fue de Sigma-Aldrich. GM6001 (inhibidor de metaloproteasas de la matriz) era de Enzo Life Science (Biochem Vinci, Vinci, Italia).
CD157 de transfección génica y shRNA Lentiviral Transducción de partículas
Las células fueron transfectadas con el vector de expresión pcDNA3 eucariota. 1 que contiene el ADNc de longitud completa para-CD157 o ninguna inserción (mock), como se describe [13]. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 o MCDB131 /M199 (vol /vol) medio de cultivo (Sigma-Aldrich, Milán, Italia) suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS, Biochrom Seromed, Milán, Italia). Las células se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO2 y la prueba de
Mycoplasma
contaminación.
expresión de CD157 en las células OV-90 y OC314 fue silenciada por la entrega lentiviral de PLV-Puro (Biosettia, San Diego, CA) que codifica un ARN de horquilla corta (ARNhc) de orientación BST-1 mRNA (secuencias diana 5'-GAGTCAGACTGCTTGTATA-3 '(shCD157) y 5'-CCTGAGCGATGTTCTGTAT-3' (shCD157#2); secuencia codificada 5 ' -TTCTCCGAACGTGTCACGTT-3 '). Las partículas se generaron como se describe anteriormente [14]. Las células se incubaron con sobrenadantes lentivirales apropiados y Polybrene (8 mg /ml, Sigma-Aldrich). Las células transducidas se sometieron a la selección de 2 mg /ml puromycine (Santa Cruz biotecnologías) durante 3 días.
(A) sqrt-PCR de la expresión CD157 ectópica en células OVCAR-3 (arriba). GAPDH se utilizó como control interno. Western blot de CD157 en OVCAR-3 /CD157 y OVCAR-3 /simulacros de células (parte inferior). El mAb anti-β-actina se utilizó como control de carga. (B-C) Morfología de OVCAR-3 /maqueta y /CD157 células OVCAR-3. se muestran colonias representativas visualizadas después de tinción con violeta cristal utilizando un microscopio invertido IX70 equipado con una cámara UC30 y el software de análisis CellF (Olympus Biosystems). (B, barra de escala: 200 micras; C, barra de escala: 20 mM). (D) La microscopía confocal análisis de F-actina. Las células se cultivaron en cubreobjetos recubiertos de gelatina, se fijaron con 2% PFA, permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 y se tiñeron con faloidina-TRITC. Las muestras se analizaron utilizando un escaneo láser confocal Olympus FV300 microscopio. Las células fueron imágenes utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 60 × (1,4 NA). (Barra de escala: 20 mM). Microfotografías en B, C, y D fueron entonces reproducen en blanco y negro. (E) OVCAR-3 células fueron sometidas a un ensayo de célula-célula adhesión y grupos (& gt; 5 células) se contaron en 20 campos diferentes /plato. Los resultados representan la media ± SEM de cuatro experimentos independientes. ** P & lt; 0,01 prueba de la t, de dos colas. (F) Los agregados generados utilizando el método de la gota colgante y la incubación durante la noche a 37 ° C fueron dispersados mecánicamente y luego fotografiado bajo el microscopio de contraste de fase (barra de escala: 50 mM). (G) La inducción de la anoikis en las células OVCAR-3 /CD157 y OVCAR-3 /simuladas después de 72 horas de cultivo en placas recubiertas con poli-MiSAmA. Imágenes de microscopía de contraste de fase muestran la formación de grandes agregados flotantes en OVCAR3 /células simuladas y pequeños agregados o células individuales aisladas de las células OVCAR3 /CD157 (barra de escala: 200 m). (H) después de 24, 48 y 72 h de crecimiento independiente de anclaje, se fijaron las células, se permeabilizaron, se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron con un FACSCanto. El análisis de datos se realizó con el software de análisis del ciclo celular ModFit LT ™. Anoikis en OVCAR-3 /mock y 3-OVCAR /CD157 células se determinó midiendo el porcentaje de células sub-G1. Los resultados representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01 prueba de la t, de dos colas. (I) histogramas representativos de estado del ciclo celular de las células simuladas y CD157-positivo OVCAR-3 después de 48 h de crecimiento independiente de anclaje. (J) El crecimiento independiente del anclaje de las células simulacros de OVCAR-3 /CD157 y se analizó por el ensayo de formación de colonias en agar blando. Gráfico representa el número medio de colonias formadas a partir de tres experimentos independientes ± SEM después de 3 semanas de incubación de las células en agar blando. * P & lt;. 0.05, dos colas prueba t
Western Blot Analysis
lisados de células totales se obtuvieron mediante incubación en tampón de lisis RIPA (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sodio, EDTA 1 mM, 0,1% SDS suplementado con Na 1 mM
3Vo
4, 5 mM NaF, 50 mg /ml de aprotinina y leupeptina). extractos citosólicos se obtuvieron por las células incubando durante 10 minutos a 4 ° C con una solución de tampón hipotónico que contiene Tris-HCl 20 pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl 3 mM
2 y 50 mg /ml de cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich ). La suspensión se trató con una solución de NP40 al 0,5% y se centrifugó el homogeneizado obtenido (3.000 rpm, 10 minutos a 4 ° C). Los extractos nucleares se prepararon incubando el sedimento obtenido como se describe anteriormente en tampón de lisis RIPA durante 30 minutos. Después de 30 minutos de centrifugación a 14.000 rpm a 4 ° C, se determinó la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford (Bio-Rad Laboratories). La transferencia Western se realizó como se describió anteriormente [13]. En pocas palabras, cantidades iguales (30 g) de extractos de proteínas de las células se separaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 10% (PAGE) en condiciones y electro-transferido en un difluoruro de polivinilideno no reductor (PVDF) membranas, bloquearon a continuación y se sondaron con el indicado mAb. Después de la incubación con los anticuerpos conjugados con HRP apropiadas (Santa Cruz Biotechnologies), las bandas inmunorreactivas se detectaron por un aumento de quimioluminiscencia (Perkin Elmer, Monza, Italia). Las imágenes fueron capturadas con un análisis ChemiDoc ™ + Sistema XRS y densitometría se realizó con el software Image Lab ™ (Bio Rad, Milán, Italia).
Cell Colonia Ensayo de dispersión y de colonias en agar blando Formación
Las células (500 /pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos y se mantuvieron en medio de cultivo suplementado con 5% de FCS durante 14 días, después se lavaron, se fijaron en metanol durante 30 minutos, se tiñeron con cristal violeta (Sigma-Aldrich) y se visualizaron usando un IX70 microscopio invertido equipado con una cámara UC30 y el software de análisis CellF (Olympus Biosystems).
en los ensayos de agar blando 6 × 10
2 células se mezclaron con una solución de agar al 0,45% en medio RPMI que contiene 10% de FCS y capas en la parte superior del 0,9% capa de agar de base en placas de 24 pocillos. Los ensayos se realizaron por triplicado. Después de 2-3 semanas a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora, las colonias se visualizaron con un microscopio invertido y se contaron.
adhesión célula-célula y célula de agregación Ensayos
los estudios de adhesión célula-célula se realizaron como se describe [15]. Brevemente, suspensiones de células individuales fueron sembradas en placas de cultivo de 0,5% de agarosa recubiertas de (1 ml /pocillo, 30 minutos a 37 ° C) para evitar la adhesión celular, y se agita lentamente durante 2 horas a 37 ° C.
ensayos de agregación celular se realizaron con el método de la gota colgante, como se describe [16]. Brevemente, las células (5 × 10
3/25 l de medio RPMI 1640 con 5% FCS) fueron sembradas en la superficie interior de la tapa de una placa de Petri. Para evitar la evaporación, 10 ml de fosfato de solución salina tamponada (PBS) se coloca en el plato. Después de la incubación durante la noche a 37 ° C, los agregados de células se dispersaron y se fotografiaron mecánicamente usando un microscopio de contraste de fase.
Anoikis Ensayo
Las células (5 × 10
5 /pocillo) se cultivaron con 20 mg /ml de poli HEMA (polihidroxietilmetacrilato, Sigma-Aldrich) tratados con placas de 6 pocillos durante 24 a 72 h. A continuación, los agregados de células se dispersaron y las células se fijaron con etanol 75% enfriado con hielo (vol /vol) durante la noche a 4 ° C. Las células fueron tratadas con 100 mg /ml de RNasa A (Sigma-Aldrich, 30 minutos a 37 ° C), teñidas con 10 mg /ml de yoduro de propidio (10 minutos a 4 ° C) y las muestras se analizaron con un FACSCanto (Becton Dickinson, Mountain View, CA, EE.UU.). El análisis de datos se realizó utilizando el software de análisis del ciclo celular ModFit LT ™ (Verity Software House, Topsham, ME). Anoikis se determinó midiendo el porcentaje de células sub-G1.
Inmunofluorescencia La tinción y microscopía confocal
En experimentos de microscopía confocal, las células fueron cultivadas a subconfluencia en cubreobjetos recubiertos de gelatina, se fijaron con 4% paraformaldehído (PFA) durante 30 minutos a 20 ° C, se lavaron y se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 en solución salina tamponada con fosfato con 1% de suero normal de cabra y 1% de BSA durante 15 minutos a 20 ° C. Las células se incubaron con los anticuerpos primarios indicados, seguido de Alexa Fluor anticuerpos secundarios-488-conjugados. Las muestras se analizaron con un microscopio de escaneo láser confocal Olympus FV300 equipado con un Argon azul (488 nm) láser, un verde helio-neón (543 nm) del láser, y software FluoView 300 (Olympus Biosystems, Hamburgo, Alemania). Las células fueron imágenes utilizando un objetivo de 60 × aceite de inmersión (NA 1.4) y 10 × lente ocular. Nomarski imágenes fueron obtenidas por contraste diferencial de interferencia (DIC) componentes ópticos instalados en un microscopio invertido IX71. análisis semicuantitativo de la E-cadherina tinción de unión se realizó contando un mínimo de 10 campos por muestra (al menos 200 células en total) y marcando como positivos el número de células con los dos restantes fronteras entre células fluorescentes.
ARN la extracción y la transcriptasa inversa-PCR
el ARN total (2 g) extraído de un 70-80% de cultivos confluentes usando el reactivo TRIZOL® (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italia) fue transcrito de forma inversa con la M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen) y cebadores oligo-dT. cDNA se amplificó utilizando KAPA2G Fast HotStart ADN polimerasa (Kapa Biosystems, Cambridge, MA). Cada ciclo consistió en la desnaturalización a 94 ° C durante 10 segundos, hibridación durante 10 segundos y extensión a 72 ° C durante 1 segundo. En el análisis semi-cuantitativo (sqrt-PCR), se determinó el número apropiado de ciclos para permanecer dentro de la fase exponencial para cada sustrato. Los cebadores usados se indican en la Tabla S1. Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa.
SYBR verde en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR)
El ARN total fue extraído utilizando el RNeasy mini kit (Qiagen, Milán, Italia ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. QRT-PCR se realizó utilizando SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich) y un sistema de detección ABI 7500 Secuencia rápida (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Se llevaron a cabo las condiciones de los ciclos de PCR para todas las muestras de la siguiente manera: 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla S2. Las reacciones de PCR para cada plantilla se realizaron por triplicado en placas de 96 pocillos. Se utilizó el método comparativo CT (Applied Biosystems) para determinar la expresión génica en transfectadas con CD157 en relación con el valor observado en las células de control correspondientes, utilizando TBP como control de normalización.
(A) Microscopía confocal análisis de E- cadherina y (B) la expresión de β-catenina en OVCAR-3 /CD157 y células simuladas. Las células se cultivaron en un cubreobjetos recubierto con gelatina, se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron con anti-E-cadherina, y los anticuerpos anti-β-catenina seguidos por anticuerpo marcado con Fluor-488 Alexa secundaria. Las muestras se analizaron con un microscopio confocal de barrido láser Olympus FV300 y por Nomarski contraste diferencial de interferencia (DIC) óptica. Para E-cadherina, una imagen de fluorescencia se fusionó con la imagen DIC se muestra (barra de escala: 50 mM). análisis semicuantitativo de la E-cadherina tinción de unión se determinó contando un mínimo de 10 campos /muestra (al menos 200 células en total) y anotando las células positivas con dos restantes fronteras intercelulares fluorescentes. Para β-catenina, se muestra una imagen fluorescente. Recuadro: vista de un OVCAR-3 /CD157 célula individual que presenta difusa tinción de β-catenina en el plan de foco de corte a través del núcleo amplificado. Los asteriscos corresponden a nucleolos. (C) de Western blot para la E-cadherina y β-catenina en las células simuladas OVCAR-3 /CD157 y. Densitometría cuantifica el nivel de expresión de E-cadherina y β-catenina en relación con ß-actina. (D) los niveles de β-catenina en fracciones nucleares y citoplasmáticas de OVCAR-3 /mock y OVCAR-3 /CD157 células se determinaron por análisis de transferencia Western. α-tubulina y lamina B1 (LAMB1) se utilizaron como controles de carga citoplasmáticas y nucleares, respectivamente. Densitometría cuantifica el nivel de expresión de β-catenina en relación con el control adecuado. (E) sqrt-PCR para la E-cadherina, N-cadherina, β-catenina y E-cadherina represores de la transcripción en células simuladas OVCAR-3 /CD157 y. Densitometría cuantifica los niveles de expresión de E-cadherina represores relativos a GADPH. (F) QRT-PCR para ZEB1, Caracol y TWIST1. Se utilizó el método CT comparativo para determinar la expresión génica en las células CD157-transfectadas en relación con el valor observado en las células simuladas, utilizando TBP como control de normalización. Histogramas informan los medios ± SEM de tres experimentos independientes QRT-PCR, cada uno realizado por triplicado. * P & lt; 0,05, *** P & lt; 0,001;
ns
, no significativo; prueba de la t de dos colas. (G) Análisis de transferencia Western que muestra el nivel de Caracol y ZEB1 en OVCAR-3/3-maqueta y OVCAR /CD157 células. Densitometría cuantifica el nivel de expresión de ambas proteínas en relación con ß-actina. Los resultados mostrados en cada panel son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.
cicatrización de heridas Ensayo
Las células se sembraron en placas de seis pocillos hasta la confluencia y luego se hizo un rasguño través de la monocapa, tal como se describe anteriormente [13]. Imágenes del área heridos se registraron en los tiempos indicados. Cada experimento se realizó por cuadruplicado y se repitió al menos tres veces.
Transmesothelial Ensayos de Migración y análisis de microscopía confocal
células Met-5A (2 × 10
5) fueron etiquetados utilizando un Cellebrite ™ kit de Red de membrana citoplasmática de tinción de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Biotium Inc. Hayward, CA), y luego se sembraron en (10 mg /ml) cubreobjetos recubiertos de fibronectina y se dejaron crecer hasta confluencia. las células del cáncer de ovario (1,5 × 10
5) se tiñeron con 5 M CFSE (éster de succinimidil éster, Molecular Probes) y se sembraron en la monocapa Met-5A durante 6 h (OVCAR-3 células) o 2,5 horas (OV-90 células) a 37 ° C. las células tumorales no adherentes se retiraron cuidadosamente, la muestra fijada con 2% PFA y después se analizaron usando un escaneo láser confocal Olympus FV300 microscopio. Las células se obtuvieron imágenes utilizando un objetivo de inmersión en 60 × aceite (1,4 NA) por exploración secuencial de los planos XY registradas a lo largo del eje Z (tamaño del paso: 1,25 m). Se contaron las células en la parte superior, la mediana y de la etapa inferior y la proporción de células en la etapa inferior a células totales representa el porcentaje de células que migró a través de la monocapa [17]. Donde se indique, las células se trataron durante 1 h con GM6001 (25 mg /ml) antes de la siembra en el Met-5A monocapa de células mesoteliales.
La gelatina y la caseína zymography ensayos
OVCAR-3 y OV -90-transfectadas las células se sembraron en placas de 48 pocillos y se cultivaron hasta 80% de confluencia, después se incubaron durante 48 h adicionales en un medio libre de FCS. Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) MMP2 y la actividad MMP9 en el medio condicionado se analizaron mediante 10% de SDS-PAGE que contenía 1 mg /ml de gelatina (zimografía de gelatina) [18], y se visualizó la actividad MMP7 usando 12% de SDS-PAGE que contenía 1 mg /ml de caseína (caseína zimografía) [19]. Los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie G-250 para visualizar la actividad de la proteasa. Las imágenes fueron capturadas con un análisis ChemiDoc ™ + Sistema XRS y densitometría se realizó utilizando el software Image Lab ™.
esferoide desagregación Ensayo
Los esferoides se generaron con el método de la gota colgante y su desagregación en recubiertos de fibronectina placas (10 g /ml) se midió después de 12 h de incubación a 37 ° C, como se describe en otra parte [13]. Brevemente, placas de 96 pocillos se recubrieron con 10 mg /ml de fibronectina y se bloquearon con BSA (1 mg /ml) durante 1 h a 37 ° C. Esferoides (8-10 esferoides /pocillo) se sembraron en medio RPMI-1640 sin suero. Para realizar un seguimiento de esferoides individuales en el tiempo, cada pocillo fue fotografiado 30 minutos después de la siembra (tiempo 0) y después de 12 h. El área de píxeles de los esferoides se midió a tiempo 0 y 12 h, y el pliegue del cambio en el área se calculó como la relación entre el área de píxeles de los esferoides en 12 h y en el tiempo 0.
Microarray hibridación, Recopilación y análisis de
ARN total fue extraído de las líneas celulares de control confluente 70-80% (duplicados /simulacros y OV-90 /simulacro de OVCAR-3) líneas de células y pruebas (OVCAR-3 /CD157 y OV 90 /CD157), preparación de la sonda de microarrays, la hibridación, la exploración y análisis de imágenes se realizaron como se describe anteriormente [20]. Dos repeticiones, con tinte de intercambio, se realizaron para cada muestra. elaboración de datos en bruto se llevó a cabo con Bioconductor [21], utilizando R lenguaje estadístico [22] la aplicación de un corte en el valor P, ajustados para múltiples pruebas por el método de Benjamini-Hochberg (& lt; 0,01), seguido de filtración en nivel de expresión (logFC & gt; 1 o se convierte la -1 en por lo menos una línea celular, con exclusión de las transcripciones con signo opuesto). Este criterio permite la identificación de las transcripciones con la modulación concordantes y tuvo en cuenta las diferencias intrínsecas biológicos de distintas líneas celulares que podrían ser reflejados en la amplitud de los cambios veces.
Gene ontología, vía canónica, y el análisis de redes funcionales se realizaron utilizando tanto la base de conocimientos DAVID [23] y MetaCore software desde GeneGo Inc., aplicando una línea de corte en los valores de p de enriquecimiento (& lt; 0,05). conjuntos de datos de expresión génica se han depositado en la Expresión Génica Omnibus (GEO) de bases de datos, ID: GSE36364.
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=flktjkcsuyygcrm&acc=GSE36364).
Statistical Métodos y Análisis de Datos
A menos que se indique lo contrario, los valores se expresan como medias ± SEM. Las comparaciones entre los dos grupos se llevaron a cabo utilizando
t
prueba no pareada una de Student bilateral para variables distribuidas normales. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS Statistics 17 de software (Chicago, IL) y el software GraphPad Prism 5 (San Diego, CA). Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras. Para todos los análisis, se consideraron significativas las diferencias en P & lt; 0,05 (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001
frente
control) y
ns
por no significativa .
(a) sqrt-PCR (izquierda) y análisis de Western blot (derecha) de CD157 en OV-90 /CD157 y OV-90 /células simuladas. GAPDH y β-actina se utilizaron como controles internos, respectivamente. (B) Morfología de colonias formadas por OV-90 /maqueta y 90-OV /CD157 células. se muestran colonias representativas visualizados después de la tinción con cristal violeta. Barra de escala: 200 M. (C) sqrt-PCR análisis de E-cadherina y N-cadherina en las células OV-90 /simulacros y OV-90 /CD157. Densitometría cuantifica los niveles de expresión de mRNA de las moléculas indicadas en relación con GAPDH. (D) Efecto de la sobreexpresión de CD157 en anoikis. Después de 48, 96 y 72. 192 h de crecimiento independiente de anclaje, se fijaron las células, se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron con un FACSCanto. Anoikis en OV-90 /mock y 90-OV /CD157 células se determinó midiendo el porcentaje de células sub-G1. Los resultados representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01 prueba de la t, de dos colas. (E) el crecimiento independiente del anclaje de OV-90 /CD157 y células simuladas se analizó por el ensayo de formación de colonias en agar blando. Gráfico representa el número medio de colonias formadas a partir de tres experimentos independientes ± SEM después de 3 semanas de incubación de las células en agar blando. *** P & lt; 0,001 prueba de la t, de dos colas. (F) Efecto de la expresión de CD157 en la migración celular en un ensayo a los arañazos de heridas en OV-90 /CD157 y células simuladas. Las células fueron cultivadas como monocapas, heridos, y se fotografiaron en el tiempo 0 y a las 24 horas. bordes de la herida están indicadas por las líneas de puntos negro (barra de escala: 200 M). (G) La capacidad de las células para cerrar la herida se calculó mediante la medición de distancias 20 elegidos al azar a lo largo del borde de la herida en el tiempo 0 y a las 24 horas. Los resultados representan el porcentaje de reducción de la anchura media de la herida y se expresan como la media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05; prueba de la t de dos colas.
sqrt-PCR (izquierda) y Western blot (derecha) que muestra OV-90 células (A) retrovıricamente transducidas con un shRNA que se dirige al ARNm de CD157 humano, lo que resulta en knockdown eficiente de la expresión de CD157. GAPDH y β-actina se utilizaron como controles internos, respectivamente. (B) Morfología de colonias formadas por OV-90 /scramble y células /shCD157 OV-90. se muestran colonias representativas visualizados después de la tinción con cristal violeta. Barra de escala: 200 M. (C) sqrt-PCR para la E-cadherina, N-cadherina y Caracol, TWIST1 y Slug represores transcripcionales en OV-90 /scramble y OV-90 /shCD157 células. Densitometría cuantifica los niveles de expresión de mRNA de las moléculas indicadas en relación con GAPDH. ensayo (D) Anoikis. Después de 48, 72, 96 y 192 h en el crecimiento independiente de anclaje, se fijaron las células, se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron con un FACSCanto. El análisis de datos se realizó con el software de análisis del ciclo celular ModFit LT ™. Anoikis en OV-90 /scramble y OV-90 células /shCD157 se determinó midiendo el porcentaje de células sub-G1. Los resultados representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01 prueba de la t, de dos colas. (E) el crecimiento independiente del anclaje de OV-90 /scramble y OV-90 células /shCD157 se analizó por el ensayo de formación de colonias en agar blando. Gráfico representa el número medio de colonias /campo formado a partir de tres experimentos independientes ± SEM después de 3 semanas de incubación de las células en agar blando. * P & lt; 0,05 test de la t, de dos colas. (F) Efecto de CD157 caída en la migración de células OV-90 en un ensayo a los arañazos de la herida. Las células fueron cultivadas como monocapas, heridos, y se fotografiaron en el tiempo 0 y a las 24 h (barra de escala: 200 m). bordes de la herida se indican mediante líneas de puntos negros. (G) La capacidad de OV-90 /scramble y células /shCD157 OV-90 para cerrar la herida se calculó mediante la medición de distancias 20 elegidos al azar a lo largo del borde de la herida en el tiempo 0 y a las 24 h. Los resultados representan el porcentaje de reducción de la anchura media de la herida y se expresan como la media ± SEM de tres experimentos independientes. ** P & lt;. 0,01, prueba t de dos colas
Resultados
Expresión CD157 modula células del cáncer ovárico morfología y la interacción célula-célula
Elegimos OVCAR- 3 células de cáncer de ovario como el modelo más adecuado para estudiar los efectos inducidos por la expresión de CD157 ya que tienen un fenotipo epitelial [24], son poco invasiva, apenas móviles en el plástico y apenas anclaje independiente [25]. Para explorar la importancia biológica de CD157 en la progresión del cáncer de ovario, que transfectadas establemente CD157 de cuerpo entero en OVCAR-3 células CD157-negativos (Figura 1A). Imágenes de microscopía de luz revelaron que las células crecieron simulacros de agrupaciones tan estrechamente conectados compuestos por células con morfología epitelial típica de adoquines similar. Por el contrario, OVCAR-3 /CD157 células exhibió una distribución más dispersa y forma alargada, una característica distintiva de las células similares a fibroblastos, y formó uniones mal organizados entre las células adyacentes (Figura 1B, C).