Extracto
ETV1
se sobreexpresa en un subgrupo de cánceres de próstata clínicos como una transcripción de fusión con muchos diferentes socios. Sin embargo,
ETV1
también puede ser sobreexpresado como una transcripción de longitud completa. ETV1 funciones de la proteína de longitud completa en forma diferente a ETV1 truncada producida por los genes de fusión. En este trabajo se describen los antecedentes genéticos de larga duración
ETV1
sobreexpresión y las propiedades biológicas de las distintas isoformas ETV1 de larga duración en el cáncer de próstata. Separables FISH mostró en cinco de las seis muestras de pacientes con sobreexpresión de larga duración
ETV1
una reordenación genómica del gen, lo que indica translocación frecuente. Hemos sido capaces de estudiar los reordenamientos en más detalle en dos tumores. En el primer tumor 5'-RACE en ADNc demostró la vinculación de la completa
ETV1 Versión taquigráfica al primer exón de un exón dos NcRNA gen específico de la próstata que mapea en el cromosoma 14 (
EST14
) . Esto dio lugar a la expresión de ambos de larga duración
ETV1
transcripciones y
EST14 ETV1-
transcripciones de fusión. En los cromosomas se propaga de un xenotrasplante derivada de la segunda cáncer de próstata se observó un complejo
ETV1
desplazamiento que implica un fragmento de cromosoma 7 que alberga
ETV1 Opiniones y fragmentos de los cromosomas 4 y 10. Estudios posteriores revelaron la sobreexpresión de varios diferentes transcripciones de larga duración, dando lugar a cuatro isoformas de proteínas con diferentes regiones N-terminales. Incluso la isoforma más corta sintetizado por larga duración
ETV1
estimulado
in vitro
crecimiento independiente de anclaje de células de la próstata PNT2C2. Esto contrasta la falta de actividad de incluso más corto ETV1 truncado-N producida por transcritos de fusión. Nuestros resultados que la sobreexpresión en cáncer de próstata clínico de larga duración
ETV1
se debe a reordenamientos genómicos que implican diferentes cromosomas y la identificación de una isoforma ETV1 biológicamente activa acortada son de gran importancia para la comprensión del mecanismo de la función ETV1 en el cáncer de próstata .
Visto: Gasi D, van der Korput HA, Douben HC, de Klein A, de Ridder CM, van Weerden WM, et al. (2011) La sobreexpresión de longitud completa
ETV1
Transcripciones en clínica del cáncer de próstata Debido a Gene translocación. PLoS ONE 6 (1): e16332. doi: 10.1371 /journal.pone.0016332
Editor: Andrew Wilber, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 5 Septiembre, 2010; Aceptado: December 10, 2010; Publicado: 26 Enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Gasi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio el apoyo de una subvención Marie Curie (Cancure) proporcionada por la Unión Europea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
fusiones de genes son importantes en el desarrollo de muchos tumores malignos hematológicos y sarcomas, pero son poco frecuentes en la mayoría de otros tipos de tumores [1]. Sin embargo, la fusión frecuente entre los
TMPRSS2
y el gen ETS
ERG
mostró que la fusión de genes es un evento de gran relevancia en el cáncer de próstata [2], [3]. La sobreexpresión de la TMPRSS2-ERG
gen de fusión
ha sido reportado en 40 a 70% de los casos de cáncer de próstata [2] - [5]. Las fusiones de
TMPRSS2
y otros tres genes que codifican factores de transcripción ETS,
ETV1
,
ETV4
y
ETV5
, que se encuentran en cromosomas diferentes, ocurren a baja frecuencia en el cáncer de próstata [2], [6], [7]. Sin embargo, para
ETV1
al menos 10 parejas de fusión diferentes se han descrito [8] - [10]. La mayoría de ellas tienen en común que, como
TMPRSS2
, que son específico de la próstata andrógeno y regulada-expresó. Las propiedades de los componentes de fusión son elementos clave para explicar la sobreexpresión regulada por andrógenos de un oncogén ETS en el cáncer de próstata. Sin embargo, una característica única de
ETV1
es que no sólo puede ser sobreexpresado en el cáncer de próstata como una transcripción de fusión, sino también como un tipo salvaje larga duración transcripción.
La gran familia de factores de transcripción ETS se compone de 27 miembros [11] - [13]. Todos los miembros tienen en un dominio de unión a ADN altamente homóloga común, el dominio ETS. Las regiones restantes de la mayoría de las proteínas ETS muestran homología estructural limitada. ETV1, ETV4 y ETV5 son los miembros de una pequeña subfamilia de proteínas relacionadas estructuralmente ETS. Estas proteínas contienen en la región N-terminal de un dominio de transactivación conservada corta ácida (TAD) que está ausente en ERG. proteínas ETS regulan muchos genes diana que modulan los procesos biológicos como el crecimiento celular, la angiogénesis, la migración, la proliferación y la diferenciación. Sin embargo, ¿cuál de las muchas funciones biológicas y moleculares de las proteínas ETS son las más importantes en el cáncer de próstata no se conoce.
Tras
ERG, ETV1
es el gen sobreexpresado ETS más frecuente en el cáncer de próstata ( ~ 10% de los tumores) [10]. La proteína ETV1 traducido de la mayoría de los transcritos de fusión se trunca, que carece de los 131 aminoácidos N-terminales (dETV1). Aprox. la mitad de los tumores con
ETV1
sobreexpresión expresar una transcripción de la fusión, los otros muestran un alto nivel de larga duración
ETV1
expresión. El
in vitro
propiedades biológicas y moleculares de dETV1 parecen diferentes de las de los de larga duración proteína ácido amino 477 [10]. Esta observación sugiere que los tumores con sobreexpresión de larga duración ETV1 son diferentes de tumores que expresan dETV1.
Se sabe poco sobre el mecanismo de larga duración
ETV1
sobreexpresión y su función en el cáncer de próstata clínico . Nuestros resultados actuales muestran que la sobreexpresión de larga duración
ETV1
se correlaciona con la reordenación de la
ETV1
región cromosómica. Por otra parte, hemos identificado un nuevo, N-truncado
ETV1
isoforma con la misma actividad como de larga duración
ETV1
.
Resultados y Discusión
Anteriormente , se informó de
ETV1
sobreexpresión en ocho de las 84 muestras de cáncer de próstata. En cuatro de los casos esto se debe a un gen de fusión, en los otros cuatro un larga duración
ETV1 Versión taquigráfica se sobreexpresa [10]. En el presente estudio se investigó la sobreexpresión de
ETV1 fotos: por reacción de la transcriptasa inversa cuantitativa (qPCR) en una novela cohorte de 66 cánceres de próstata. En seis ARN
ETV1
se detectó sobreexpresión. Las muestras G51, G59, G233, G270 y G268 se derivaron de tumores primarios y G210 se derivó de un tumor recurrente. Las seis muestras se estudiaron adicionalmente por QPCR con pares de cebadores en el extremo 5 'de
ETV1
mRNA (exón 1F y el exón 4R) y en el extremo 3' del ARNm (exón 11F y el exón 12R) (Figura 1A). Un alto el exón 11-12 al exón 1-4 relación es indicativa de un gen de fusión; una relación de 01:01 indica sobreexpresión de larga duración
ETV1
ARNm. Sobre la base de estos criterios, los tumores G51, G59, G233 y G270 expresan de larga duración
ETV1
mientras G210 y G268 expresaron una transcripción de fusión (véase también el control PC374 que expresa
TMPRSS2-ETV1).
HNRPA2B1-ETV1
se encontró que la transcripción de fusión en G210 muestra (datos no mostrados); la transcripción de la fusión en G268 no ha sido identificado todavía. Estas dos muestras no se investigaron más en este estudio.
(A) QPCR en ARN a partir de muestras clínicas que muestran
ETV1
sobreexpresión. Dos pares de cebadores se utilizaron para determinar
ETV1
expresión:
ETV1
exón 1 y el exón 4 hacia adelante inversa, y el exón 11 y el exón 12 hacia adelante inversa, respectivamente. Primer secuencias se dan en el cuadro complementario S1. Los productos amplificados se cuantificaron con relación a la expresión de la porfobilinógeno desaminasa (
PBGD
) limpieza de genes. Los datos se normalizaron a la plena longitud
ETV1
sobreexpresa en el PC135 xenoinjerto. Un alto exón 11/12 al exón relación de 1/4 indica un
ETV1
evento de fusión, una relación de 1 a 1 indica una sobreexpresión de larga duración
ETV1 Versión taquigráfica. PC374 es un xenotrasplante de un gen que se expresa sobre Fusion
TMPRSS2-ETV1. Un experimento representativo de las seis muestras que mostrar
ETV1
sobreexpresión se representa. (B) la interfase FISH en secciones de tejido de cáncer de próstata fresco congelado. BAC utilizados se indica a continuación la región del cromosoma 7 investigados. BAC RP11-124L22 (rojo) vanos
ETV1 Opiniones y RP11-1149J13 (verde) se superpone
DGKB gratis (panel izquierdo). Las posiciones de los genes de la parte superior del cromosoma 7 se indican en MBP. Una señal dividida que representa un
ETV1
translocación se indica con una flecha. (C) La translocación de
ETV1
en el cromosoma 14 en G270 tumor. Las secciones de tejido se hibridaron con BAC RP11-460G19 (verde) que se solapa
MIPOL1
y los flancos
ETS14
y con el
ETV1
BAC RP11-124L22 (rojo) (ver B para detalles). En el panel izquierdo de la posición de
MIPOL1
BAC en el cromosoma 14 se indica. En el panel de la derecha una señal de fusión (amarillo) muestra co-localización de
ETV1
y
MIPOL1
/
EST14 Hoteles en G270, según lo indicado por la flecha.
en los próximos experimentos nos centramos en la elucidación del mecanismo de la sobreexpresión de larga duración
ETV1
. Recientemente, se ha demostrado que en dos líneas celulares de cáncer de próstata que sobreexpresan de longitud completa
ETV1
, LNCaP y MDA PCa2b,
ETV1
se transloca [8]. Ahora hemos abordado la cuestión de si en muestras clínicas de la translocación completa
podría producirse ETV1
gen. Para detectar las diapositivas reordenamientos genómicos de tejidos de todas las muestras de cáncer de próstata con cuatro de larga duración
ETV1
sobreexpresión fueron analizados por FISH en interfase ruptura de separación, con dos sondas marcadas BAC, BAC uno reconoce
ETV1
y la segundo, el gen que flanquean
DGKB gratis (Figura 1B). La serie se complementó con dos muestras que albergan de larga duración
ETV1
sobreexpresión de nuestro estudio anterior, G89 y G308 [10], los cuales se dispone tejidos congelados de suficiente calidad morfológica. La Figura 1B muestra los resultados de los experimentos de FISH. Curiosamente, encontramos señales de división en todas las muestras excepto G59, lo que indica frecuentes
ETV1
reordenamientos en los cánceres de próstata que sobreexpresan de larga duración
ETV1
. La ausencia de una señal dividida en G59 sugiere ausencia de la translocación, aunque no se puede excluir un punto de interrupción fuera de la región investigada. Su alta frecuencia observada indica reordenación genómica como un mecanismo importante de larga duración
ETV1
sobreexpresión en cáncer de próstata clínico. Obviamente, la región cromosómica a la que
ETV1
se transloca puede contribuir a la elucidación del mecanismo de
ETV1
sobreexpresión. Hemos sido capaces de identificar más detalles de los reordenamientos en muestras G270 y G89.
Se ha demostrado en células LNCaP que
ETV1
se transloca a 14q13.3-q21.1. El gen completo se integra en el último intrón de
MIPOL1
. En MDA PCa2b,
ETV1
se transloca a la misma región, aunque la posición exacta es desconocida [8]. inserción Por otra parte, se ha descrito previamente de truncado
ETV1
en el intrón de un gen que codifica un exón dos ncRNA, denotado
EST14
, dando lugar a un
EST14-ETV1
fusión transcripción que contiene
ETV1
exón 5-12 secuencias (G342 muestra en la referencia 10;. Figura 2A). Es importante destacar que,
EST14
Maps directamente adyacente a
MIPOL1
en 14q. Como la mayoría
ETV1
parejas de fusión,
EST14
es un gen específico de la próstata andrógeno-regulado. Para investigar si la misma región cromosómica participó en larga duración
ETV1
translocación en nuestra cohorte novela, la interfase FISH se realizó con el
ETV1
BAC (Figura 1B) en combinación con un
MIPOL1
BAC (Figura 1C). Se detectó una señal amarilla fusión en la muestra de G270 (Figura 1C), pero en ninguno de los otros tumores. Estos datos indican que aunque parece una preferencia para el cromosoma 14q13.3-21.1, otras regiones genómicas también contribuirán al reordenamiento y la sobreexpresión de larga duración
ETV1
.
(A) Representación esquemática de
ETV1 CD -
EST14
la transcripción de fusión en los tumores de próstata G270 y G342 (G342 muestra es de la ref. 10). Las flechas indican las posiciones de los cebadores utilizados en el experimento de RT-PCR. Primer secuencias se muestran en el cuadro complementario S1. (B) Secuencia del punto de
EST14
y
Hoteles en ETV1 muestra G270 fusión. La posición del punto de fusión en G270 tumor fue mapeado por PCR de largo alcance sobre el ADN genómico con un cebador directo en el
EST14
intrón y revertir aguas arriba del cebador de
ETV1
exón 1. Al punto de fusión se perdieron dos residuos T. El punto de interrupción en
EST14 Hoteles en G270 y G342 se indican con flechas.
Información adicional de
ETV1
reordenamiento en G270 vino de 5'-RACE de ADNc de tumor (datos no mostrados). Sorprendentemente, no solo se detectaron como se esperaba los de larga duración
ETV1 Versión taquigráfica sino también una transcripción de fusión (Figura 2A). Tal resultado no se encontró para cualquiera de los otros tumores que sobreexpresan de longitud completa
ETV1
. La secuenciación mostró que el transcrito de fusión en G270 se compone de
ETV1
exón 1-12 precedido por el primer exón de
EST14
(Figura 2A). El escaneo de la
EST14
intrón y
ETV1
acompañamiento de la región por PCR de largo alcance y la secuencia asignada a los puntos de interrupción en G270 $ $ 1,9 Kbp aguas arriba de
ETV1
exón 1 y ~ 5 Kbp aguas abajo de
EST14
exón 1. el punto de interrupción en
EST14
sólo 180 pb aparte del punto de interrupción en G342 (Figura 2B y ref. 10).
Para más información de
ETV1
reordenación también se recogió para G89 muestra. Anteriormente, un xenoinjerto propagado en ratones desnudos masculinos se había generado a partir de este tumor (PC135). Como G89 tumoral, PC135 sobreexpresa de larga duración
ETV1
[3]. La disponibilidad del xenoinjerto permitió la preparación de extensiones de cromosomas en metafase. En FISH multicolor se encontró un patrón de reordenamiento cromosómico complejo (datos no mostrados). pinturas de cromosomas individuales se utilizaron para validar los datos de FISH multicolor. Pintura del cromosoma 7 indica la presencia de múltiples fragmentos de cromosoma 7 (Figura 3). La hibridación con un
ETV1
BAC identificó la presencia de tres copias de genes: dos en los cromosomas de apariencia normal, 7 y uno en un cromosoma marcador compleja. pruebas de seguimiento mostraron que el cromosoma marcador contenía fragmentos de cromosomas 4, 7 y 10, como se indica por primera vez por FISH multicolor (Figura 3). El
ETV1
BAC hibridado en la unión del cromosoma 7 y el fragmento de cromosoma 4, lo que sugiere fuertemente que el 4; 7 translocación jugó un papel decisivo en la sobreexpresión de
ETV1
. Las posiciones exactas de los puntos de interrupción en 4 y 7 no se habían determinado. Nuestros datos predicen que varias regiones cromosómicas están implicadas en la sobreexpresión de larga duración
ETV1
. Al menos una de estas regiones está en el cromosoma 14 y una segunda en el cromosoma 4. El cromosoma 14 región también está involucrado en
ETV1
fusión génica. la tecnología de secuenciación profunda podría ser decisivo en la identificación de otros
ETV1
reordenamientos.
Pinturas de los cromosomas 4, 7 y 10 son de color verde y el
ETV1
BAC (Figura 1b) es rojo. Las flechas negras indican el translocado
ETV1
. En el panel inferior del cromosoma marcador correspondiente se encajona en rojo.
caracterización detallada de los de larga duración
ETV1
transcripciones de los distintos tumores por 5'-RACE y secuenciación mostró que no sólo
ETV1
exón 1- exón 12 transcripciones estuvieron presentes, sino también varios otros de larga duración
ETV1
transcripciones, como consecuencia de uso promotor alternativo. Estas transcripciones se indican como
ETV1
,
ETV1-1a
,
ETV1-1b
y
ETV1-1c Figura 4A y Figura complementario S1 espectáculo.
las posiciones de los diferentes primeros exones del gen e indicar los diversos codones de iniciación ATG. Por tanto
ETV1-1a Opiniones y se encontraron
ETV1-1b
dos variantes de empalme (datos no mostrados). qPCR experimentos utilizando cebadores transcripción específicos de ARN a partir de las seis muestras de cáncer de próstata clínicos que sobreexpresan
ETV1
mostró que el nivel de expresión de los diferentes transcritos fue variable en los diferentes tumores (ver Figura S2).
ETV1
apenas se expresa en el control de la próstata benigna G277 muestra hiperplasia. La Figura 4B representa esquemáticamente la composición prevista de las diversas isoformas de la proteína ETV1 que se producirán. Tenga en cuenta que ETV1-1c es de lejos el más corto, que carece de los ácidos N-terminales 60 aminoácidos, incluyendo la mayor parte de la TAD ácido conservado. En dETV1 que se expresa por la mayoría de los genes de fusión, los N-termimal 131 aminoácidos están ausentes. ETV1, ETV1-1b1 y -1b2 eran de tamaño similar, como se muestra en transferencias Western de lisados de células transfectadas HEK293T (Figura 4B).
(A) Representación esquemática de la organización de la
ETV1
gen. primeros exones alternativos son 1a, 1, 1b y 1c. Las posiciones de los cuatro codones de inicio ATG diferentes se indican. Se dan más detalles en la Figura complementario S1. (B) Representación esquemática de la composición de diferentes proteínas ETV1 y su expresión en células HEK293T transfectadas. Los diferentes colores de las regiones N-terminales indican una composición de aminoácidos diferente. dETV1 es la proteína ETV1 truncada producida por los genes de fusión. Esta proteína es capaz de inducir el crecimiento independiente del anclaje. En el panel de la derecha se muestra una transferencia Western de isoformas ETV1 producidos por las células HEK293T transfectadas transitoriamente. ß-actina se utilizó como control de carga. (C) Ensayo de agar blando que muestra el crecimiento independiente de anclaje de células PNT2C2 infectadas con lentivirus que expresan las diversas isoformas ETV1 o controlar GFP. Las barras representan el número medio de colonias por campo microscópico de tres experimentos independientes (± SD). Imágenes representativas de las colonias teñidas se muestran debajo de la cifra de barras.
Anteriormente, hemos demostrado que ETV1 y dETV1 diferían en la estimulación de la
in vitro
crecimiento independiente de anclaje [10] . las células infectadas con todos los PNT2C2 nuevas construcciones de ETV1 inducidas crecimiento independiente de anclaje de una manera similar como ETV1 (Figura 4C). Sorprendentemente, ETV1-1c, aunque expresado a un nivel inferior y mucho más pequeña, es tan activo como las isoformas ETV1 más largos. Por lo tanto, no era necesario que el TAD N-terminal completo, pero los aminoácidos 61-131 parece esencial para la actividad biológica de ETV1 (Figura 4B, C).
En resumen, los datos presentados revelan dos importantes aspectos novedosos de la papel de ETV1 en el cáncer de próstata. En primer lugar, se demuestra que en los cánceres de próstata clínicos un subgrupo de pacientes positivos muestran ETV1 de larga duración
ETV1
sobreexpresión debido a la translocación de todo el gen a diferentes cromosomas. Esta nueva observación complementa el mecanismo bien descrito de la sobreexpresión de ETV1 truncada causada por fusiones de genes, donde la regulación de expresión se determina por el promotor y potenciadores de los compañeros de fusión. En segundo lugar, en contraste con dETV1 producida por fusiones de genes, una isoforma corta de ETV1 de longitud completa, ETV1-1c, que carecen de la mayor parte del TAD N-terminal, es tan activo como isoformas ETV1 más largos, que contiene el TAD ácido N-terminal completa. Este hallazgo señala el crecimiento independiente de anclaje a una pequeña región que está ausente en ETV1 truncada expresada por los genes de fusión.
Es de gran importancia para ampliar el número de muestras clínicas con el fin de poder comparar la progresión tumoral en los dos subgrupos de cánceres de próstata que muestran sobreexpresión de truncada frente de larga duración ETV1, y determinar los mecanismos moleculares implicados en su diferente comportamiento biológico.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
el uso de las muestras fue aprobado por el Comité de Ética Médico Erasmus MC de acuerdo con la investigaciones médicas en seres humanos actúan en el protocolo MEC-2004-261, titulado "el uso de tejido residual normal y el cáncer humano a partir de un banco de tejidos para la caracterización de ADN, ARN y proteínas ".
los animales fueron alojados de acuerdo con las directrices del Centro Médico Erasmus, y los procedimientos se llevaron a cabo en cumplimiento de las normas para el uso de animales de laboratorio. Los experimentos con animales llevados a cabo en este manuscrito han sido aprobados por el comité animal experimental del Centro Médico Erasmus (DEC-consultar Erasmus MC proyecto 102-10-01).
Las muestras de tejido, el ARN y el aislamiento de ADN
cánceres de próstata se congelaron se obtuvieron mediante prostatectomía radical o resección transuretral. Hematoxilina /eosina (HE) secciones de tejidos teñidos fueron evaluados histológicamente por un patólogo (G. van Leenders). Todas las muestras contenían al menos 50% de células tumorales.
ARN a partir de muestras clínicas fue aislado utilizando ARN-Bee (Campro Scientific, Berlín, Alemania). Se aisló el ADN utilizando el kit de extracción de ADN DNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). ARN a partir de líneas celulares se aisló utilizando el kit de extracción de ARN RNeasy (Qiagen).
mapeo punto de interrupción
La posición del punto de fusión en el tumor de 270 fue asignada por PCR de largo alcance sobre el ADN genómico utilizando un cebador directo en el
EST14
intrón y el cebador inverso aguas arriba de
ETV1
exón 1. los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 1% y se secuenciaron en un analizador genético ABI 3100 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.).
Q-PCR
expresión de ARNm fue analizado por QPCR. Se preparó ADNc con MMLV-RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y oligo (dT) 12 de imprimación. QPCR se llevó a cabo en el poder SYBR Green PCR Master Mix en un sistema ABI Prism 7700 de detección de secuencias (Applied Biosystems). Los productos amplificados se cuantificaron con relación a porfobilinógeno desaminasa (
PBGD
) por el método de la curva estándar. Por cebadores ver Tabla S1.
mediada por RNA ligasa-rápida amplificación de cDNA extremos
5'-RLM-RACE se realizó usando el kit GeneRacer de Invitrogen. cDNA se amplificó utilizando el cebador 5 'GeneRacer y un cebador específico de gen inversa (ETV1 exón 6). Los productos de PCR fueron analizados en un gel de agarosa al 1,5%, y se extirparon bandas, purificados y secuenciados.
fluorescencia
hibridación in situ
FISH se llevó a cabo el 5-m secciones de tejido congelado de acuerdo con protocolos clásicos con modificaciones menores [14]. BAC clones RP11-124L22 (
ETV1
), RP11-460G19 (
MIPOL1
), RP11-1149J13 (
DGKB
) fueron adquiridos de Recursos BACPAC (bacpac.chori. org). BAC eran o digoxigenina-11-dUTP o biotina-16-dUTP (Roche, Basilea, Schweiz) marcado y se visualizó con anti-digoxigenina FITC (Roche) o estreptavidina-Alexa 594 (Invitrogen). Las secciones de tejido se contratiñeron con DAPI. Las imágenes se recogieron en un microscopio de epifluorescencia (Leica DM, Wetzlar, Alemania) equipado con un dispositivo de carga acoplada enfriado cámara (Fotometría, Tucson, AZ, EE.UU.).
Para la preparación de metafase para untar, PC135 xenoinjerto se propagó en ratones desnudos masculinos. Las células individuales se recogieron mediante el picado y filtración. Metafase preparación y la hibridación fueron esencialmente como se describe [14]. pinturas cromosoma 4, 7 y 10 eran de la Euro-Diagnostica (Malmö, Suecia). Metafases fueron analizados con un microscopio Axioplan 2 Imaging (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) y las imágenes fueron capturadas utilizando software Isis (MetaSystems, Altiussheim, Alemania).
Los plásmidos de expresión
ADNc de los diferentes isoformas ETV1 se amplificaron por PCR y se clonaron en pGEM-TEasy (Promega). Los insertos se verificó la secuencia y se clonaron en el vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen) o el vector pWPXLd lenti-viral (Didier Trono, Universidad de Ginebra).
Western El análisis de transferencia
Para el análisis de transferencia de Western, células HEK293T fueron transfectadas con los diferentes expresión pcDNA3-ETV1 construcciones usando el método de precipitación con fosfato de calcio. Las células se recogieron 48 h después de la transfección. El análisis de transferencia Western se llevó a cabo utilizando procedimientos estándar con anticuerpo dirigido a la ETV1 C-terminal (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EE.UU.). ß-actina se utilizó como control de carga (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.). Las proteínas se visualizaron por quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).
Infecciones lentivirales
HEK293T células se cotransfectaron con vectores de expresión pWPXLd-ETV1, o pWPXLd-GFP (control), y pPAX2 y pMD2.G (Trono) utilizando el método de precipitación con fosfato de calcio. Virus se recogió a partir del sobrenadante y se utilizó para la infección de células PNT2C2. Se propagaron las piscinas de las células infectadas.
Soft agar ensayo
Una capa de 0,6% bajo punto de fusión de agarosa en medio de cultivo estándar se preparó en placas de seis pocillos. En la parte superior, una capa de 0,3% de agarosa que contiene 1 x 10
se sembraron 4 PNT2C2 células infectadas con diversos virus ETV1 expresar o células PNT2C2-GFP de control. En el día 14, las células se tiñeron con violeta cristal y se contaron las colonias.
Apoyo a la Información
Figura S1.
parte de la secuencia genómica de
ETV1
. Los diferentes exones están resaltados en amarillo. los codones de inicio de traducción están subrayados. Tenga en cuenta que la transcripción a partir de exón 1a puede o no incluir el exón 1a1 pero el inicio de la traducción es la misma que la de la transcripción a partir de exón 1. El extremo del exón 1b1 se indica en rojo.
ETV1
transcripciones a partir de los exones falta el exón 1c 1, 2 y 3, que se traduce en un TAD truncada de la proteína traducida
doi:. 10.1371 /journal.pone.0016332.s001 gratis (DOC)
figura S2.
La expresión de los diferentes
ETV1
transcripciones se determinó mediante QPCR en el rápido sistema de PCR en tiempo real 7900HT de Applied Biosystems utilizando el SYBR verde Master Mix potencia (Applied Biosystems). Los niveles de expresión son en relación con la limpieza de genes
PBGD
.
ETV1
y
PBGD
cebadores se enumeran en el cuadro complementario S1. G277 es una muestra de la HPB. Tiene muy baja o ninguna expresión de todos los diferentes
ETV1
transcripciones. Las muestras G51, G59, G89, G233, G270 y G308 todo sobreexpresan
ETV1
Los diferentes transcripciones se expresan en niveles variables
doi:.. 10.1371 /journal.pone.0016332.s002 gratis (TIF )
Tabla S1.
Primer secuencias
doi:. 10.1371 /journal.pone.0016332.s003 gratis (TIF)