Extracto
El objetivo del presente estudio fue determinar la importancia clínica de la molécula de adhesión de la unión A (JAM-A ) en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y la función biológica de JAM-a en líneas celulares de cáncer. Demostramos que JAM-A se expresa predominantemente en las membranas celulares y la alta expresión de JAM-A se produjo en el 37% de las muestras de tumor de pulmón en comparación con los tejidos normales correspondientes. Alta expresión de JAM-A se correlacionó significativamente con el estadio TNM (p = 0,021), metástasis de ganglios linfáticos (P = 0,007), y la disminución de la supervivencia global (p = 0,02), Además, se observó que el silenciamiento JAM-A por interferente pequeño proliferación de células tumorales de ARN inhibido y la detención del ciclo celular inducida en el G1 /S límite. análisis de transferencia Western reveló que desmontables de JAM-A disminuyó los niveles de proteína de la ciclina D1, CDK4, 6, y P-Rb. Por lo tanto, JAM-A desempeña un papel importante en la progresión del NSCLC
Visto:. Zhang M, Luo W, Huang B, Z Liu, Sun L, Q Zhang, et al. (2013) La sobreexpresión de JAM-A en células no pequeñas de cáncer de pulmón se correlaciona con la progresión tumoral. PLoS ONE 8 (11): e79173. doi: 10.1371 /journal.pone.0079173
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de mayo de 2013; Aceptado: September 23, 2013; Publicado: 12 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30.972.967) y el Fondo de Investigación del Programa de Doctorado de la Educación Superior de China (Nº 20092104110018). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Junctional molécula de adhesión a (JAM-a) es una glicoproteína transmembrana de tipo I que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. JAM-A se distribuye ampliamente en los tejidos, incluyendo la placenta, los pulmones, el hígado, los riñones, el páncreas, el corazón, el cerebro, los intestinos, y los ganglios linfáticos [1], [2], [3], [4]. JAM-A se expresa predominantemente en las uniones intercelulares de células epiteliales y endoteliales, JAM-A también se encuentra en la superficie de los leucocitos, linfocitos, plaquetas, eritrocitos y [5], [6], [7], [8]. JAM-A está implicada en diversos procesos celulares, tales como la adhesión célula-célula, la migración de leucocitos, la activación de plaquetas, angiogénesis, y reovirus de unión a [5], [9], [10], [11]. El JAM-Una proteína se compone de un dominio extracelular con dos bucles similares a Ig, una sola región que atraviesa la membrana, y una cola citoplásmica corta que termina en un motivo de unión PDZ. JAM-A puede formar homodímeros a través de este bucle de Ig N-terminal. interacciones homofílicas son importantes para el JAM-A antes mencionada función en las células [12]. El motivo de unión a PDZ-C-terminal puede facilitar las interacciones con diversas proteínas de andamiaje, como ZO-1, AF-6, y PAR-3 [13], [14], [15]. motivos de unión JAM-A dimerización y PDZ son críticos para la cascada de señalización [16], [17]. Recientemente, JAM-A ha sido implicado en la progresión tumoral, pero el papel de JAM-A en el crecimiento y la diseminación del tumor sigue siendo un tema controvertido. Naik et al. [18] informó de que inicialmente JAM-A podría reducir la invasión y la motilidad de las líneas celulares de cáncer de mama
in vitro Opiniones y JAM-A expresión en pacientes con cáncer de mama se asoció negativamente con la agresividad del tumor y la metástasis. clínico-similares o
in vitro
datos -generated fueron reportados por otros relacionados con el carcinoma de endometrio [19] y el cáncer de páncreas [20]. Por el contrario, Mc Sherry et al. [21], utilizando un conjunto de datos clínicos más grandes, informaron de una correlación positiva entre JAM-Una expresión e invasivo pronóstico del cáncer de mama. Del mismo modo, mayor clínico-,
in vitro CD -, y
in vivo
conjuntos de datos -generated se informó recientemente en el cáncer de mama y el carcinoma epidermoide [22], [23], [24], [25], [26]. La expresión de JAM-Una proteína en tejidos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y la relación con diversos factores clínico-patológicos no ha sido completamente investigada. Por otra parte, el papel exacto de JAM-A en la progresión del cáncer de pulmón no está claro. Por lo tanto, se determinó JAM-A expresión en tejidos de NSCLC mediante técnicas de inmunohistoquímica. Además, se determinó la asociación entre JAM-A expresión y la proliferación en varias líneas celulares de cáncer. Demostramos que JAM-A se expresa cantidades relativamente altas en los tejidos de NSCLC y algunos tipos de líneas celulares de cáncer, y que los niveles de JAM-A asociada a la membrana celular se correlaciona con la agresividad del tumor.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio se llevó a cabo con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Medicina china. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes con CPNM y se llevaron a cabo todas las investigaciones clínicas de acuerdo con los principios promulgados en la Declaración de Helsinki.
Pacientes y muestras
Ochenta y dos muestras de NSCLC se obtuvieron de la primer hospital Afiliado de la Universidad médica de china entre 2002 y 2009; 42 muestras se sometieron a estudios de seguimiento. Ninguno de los pacientes recibió radioterapia o quimioterapia antes de la resección quirúrgica. El diagnóstico histológico y el grado de diferenciación de los tumores fueron definidos por la evaluación de hematoxilina y eosina secciones de tejido teñido de acuerdo con las directrices de la Organización Mundial de la Salud de la clasificación. Las 82 muestras fueron reevaluados con respecto al subtipo histológico, estado de diferenciación, y el estadio tumoral. carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma fueron identificados en 36 y 46 de los 82 casos, respectivamente. No se observaron metástasis en los ganglios linfáticos en 31 pacientes. Los tumores se clasifican en las etapas I (n = 45), II (n = 30), y III (n = 17) de acuerdo con el sistema de estadificación TNM-p de la Unión Internacional Contra el Cáncer (7ª edición). La supervivencia global se define como el período de tiempo desde el diagnóstico inicial hasta la muerte o la fecha del último seguimiento.
Líneas celulares y condiciones de cultivo celular
HBE, A549, H1299, H157, y líneas de células H460 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). líneas de células SPC y LK2 fueron adquiridos de la célula Banco de Shanghai de la Academia China de Ciencias. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) que contenía suero de ternera fetal al 10% (FBS; Invitrogen), 100 UI /ml de penicilina (Sigma, St. Louis, MO, USA), y 100 mg /ml de estreptomicina (Sigma). Las células se cultivaron en placas de cultivo de tejido estériles y se pasaron cada 2 días utilizando 0,25% de tripsina (Invitrogen).
Análisis Inmunohistoquímica
muestras de tumores extirpados quirúrgicamente se fijaron con 10% de formalina neutral, incrustado en se prepararon de parafina, y 4-micras de grosor. La inmunotinción se realizó a través de ElivisionTM más Polyer HRP (ratón /conejo) Kit de IHC (Maixin, Fuzhou, China). Las secciones se desparafinaron en xileno, se rehidrataron en alcohol graduado serie, y se hirvieron en tampón de 0,01 M EDTA (pH 9,0) durante 20 minutos en una caldera. actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno (0,3%), que fue seguido por la incubación con suero de cabra normal para reducir la unión no específica. Las secciones de tejido se incubaron con el anticuerpo monoclonal JAM-A de conejo (dilución 1:100; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.). inmunoglobulina de conejo, a la misma concentración que el anticuerpo específico de antígeno (Maixin) se utilizó como control negativo. La tinción para todos los anticuerpos primarios se realizó a 4 ° C durante la noche. ElivisionTM más Polyer HRP se utilizó como anticuerpo secundario. Después del lavado, las secciones fueron incubadas con 3, tetrahidrocloruro 3'-diaminobencidina para desarrollar la reacción de la peroxidasa. Contratinción de las secciones se realizó con hematoxilina, que a continuación se deshidrataron en etanol antes del montaje. Dos investigadores independientes examinaron todas las diapositivas tumorales al azar. Cinco miradas fueron examinados por diapositiva, y no se observaron 100 células por la ampliación de 400X. La inmunotinción de JAM-A se obtuvo tras una escala semicuantitativa mediante la evaluación de áreas representativas del tumor; la intensidad y el porcentaje de las membranas celulares tenían inmunotinción más alta que las células de control. tinción de la membrana de las células tumorales se consideró inmunotinción positiva. La intensidad de JAM-A membranas tinción también se puntuó como 0 (sin manchas), 1 (débil), 2 (moderada), y 3 (alto). las puntuaciones de porcentaje se asignaron de la siguiente manera: 1, 1% -10%; 2, 11% -50%; 3, 51% -80%; y 4, 81% -100% [20]. Las puntuaciones de cada muestra de tumor se multiplicaron para dar una puntuación final de 0-12 y la expresión total de JAM-A se determinó como baja (≤4) o de alta expresión (& gt; 4).
real cuantitativa -tiempo de PCR (método SYBR Green)
cuantitativo en tiempo real PCR se realizó utilizando SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.) en un volumen total de 20 ul en una 7900HT Fast real-Time Sistema de PCR (Applied Biosystems) como sigue: 95 ° C durante 30 segundos; 40 ciclos a 95 ° C durante 5 segundos; y 60 ° C durante 30 segundos. Una etapa de disociación se realizó para generar una curva de fusión para confirmar la especificidad de la amplificación. β-actina se utilizó como gen de referencia. Los niveles relativos de la expresión génica se representan como referencia? Ct = Ct Ct-gen y el pliegue del cambio de la expresión génica se calcularon por el método 2
-ΔΔCt, donde ΔΔCt = (Ct
gen-Ct
referencia )
muestra- (Ct
gen-Ct
referencia)
calibrador. Primer secuencias de JAM-A fueron 5'-AAG GTG TTG TCC TGT GCC TAC TC-3 '(hacia delante) y 5'-AGT ACC TGG CAA GAA GGT CAC C-3' (hacia atrás). Primer secuencias de β-actina fueron 5'-GAT CAA TGC CTA GAA GCA G-3 '(hacia delante) y 5'-GAT CAA TGC CTA GAA GCA G -3' (inverso). Tres experimentos independientes se realizaron por triplicado en condiciones idénticas.
interferente pequeño Tratamiento RNA
sirna (siRNA) para JAM-A fue sintetizado por Genepharma (Shanghai, China). Las secuencias de siRNA eran como sigue: 5'-GAA GUG AAG GAG AAU UCA ATT-3 '(sentido); y 5'-UUG AAU UCU CCU UCA CUU CTT-3 '(antisentido). Las secuencias de no director siRNA (control negativo) se utiliza como un control negativo fueron los siguientes: 5 'UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3' (sentido); y 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3 '(antisentido). Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos 24 h antes de los experimentos de transfección. Las células fueron transfectadas con 100 pmol JAM-A siRNA o siRNA control negativo usando Lipofectamine2000 (5 ul /pocillo; Life Technologies Corporation, Grand Island, NY, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la transfección, las proteínas y los niveles de mRNA de JAM-A se evaluaron 48 horas más tarde. Tres experimentos independientes se realizaron en condiciones idénticas.
análisis de transferencia Western
La proteína total de las células se extrajo en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], NaCl 150 mM, 0,5% Nonidet P40, desoxicolato de sodio al 0,5%, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF]; Beyotime, Haimen, china) y se cuantificó usando el método del ácido bicinconínico (BCA) (Beyotime). Sesenta g de proteína se separó por SDS-PAGE (10%) y se transfirió a fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), Después de bloquear con 5% de BSA en Tris-solución salina tamponada-Tween 20 (TBST; 20 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, y 0,05% de Tween-20), las membranas se incubaron a 4 ° C durante la noche con los siguientes anticuerpos primarios: JAM-a (1:1000; Abcam); y anti-P-Rb, anti-P27, anti-P21, anti-ciclina A, anti-ciclina B, anti-ciclina D1, anti-CDK4, anti-CDK6, anti-AKT1 /2, y anti-P-AKT Thr 308 (1:1000; Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA). Después de la incubación con peroxidasa acoplada anti-ratón o IgG de conejo (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.) a 37 ° C durante 2 h, las proteínas unidas se visualizaron utilizando ECL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) y se detectó usando bIOimagen Sistemas (UVP Inc., Upland, CA, EE.UU.). Los niveles de proteína relativos se calcularon sobre la base de GAPDH como control de carga. Tres experimentos independientes se realizaron en condiciones idénticas.
Citometría de Flujo Ensayo
Las células se trataron con tripsina y 1 × 10
6 células se lavaron dos veces con tampón de incubación enfriado (2% de BSA en PBS) y se centrifugó, a continuación, se resuspendieron las células en 100 uL de tampón de incubación y se incubaron con o sin ratón conjugado con FITC JAM-a anti-humana de anticuerpos (1:100; Biolegend, San Diego, CA, EE.UU.) o IgG1 de ratón conjugado con FITC , anticuerpo control de isotipo κ (1:100; Biolegend) en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Después, las células se lavaron dos veces con tampón de incubación y se procesaron para análisis de citometría de flujo. Los datos fueron analizados utilizando el software FlowJo 7.6.1. Tres experimentos independientes se realizaron por triplicado en condiciones idénticas.
proliferación de células de prueba
A ensayo de proliferación celular se realizó utilizando MTT (Sigma) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células H1299 y A549 se seccionan transitoriamente con JAM-A siRNA o un control negativo siRNA. Después de 24 h, las células se trataron con tripsina y se sembraron a una concentración de 3 x 10
placas de cultivo de 3 células /100 ul /pocillo en 96 pocillos durante la noche. Cada día subsiguiente, las células se trataron con 20 ul (5 mg /ml) /pocillo de solución de MTT durante la última 4 h de la cultura. El medio de cultivo se sustituyó con DMSO (150 ul /pocillo). La densidad óptica de los pocillos se midió a 490 nm usando un lector de microplacas. Tres experimentos independientes con 5 repeticiones internas por experimento se realizaron en condiciones idénticas.
Formación de Colonias Ensayo
Para los ensayos de formación de colonias, las células fueron transfectadas con JAM-A o control negativo siRNA durante 48 h, después se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos (1000 por pocillo) y se incubaron durante 12 días. Las placas se lavaron con PBS y se tiñeron con Giemsa. El número de colonias con & gt; 50 células se contó. Las colonias se contaron manualmente usando un microscopio. Tres experimentos independientes se realizaron por triplicado en condiciones idénticas.
Ciclo Celular Análisis
Las células (100.000) fueron sembradas en placas de cultivo de 6 pocillos, sincronizada después de la privación de suero durante 24 h, a continuación, transfectadas con las cantidades indicadas de siRNA. Se recogieron las células, se fijaron en 75% de etanol 48 h después de la transfección, se lavaron con PBS, y se tiñeron en 5 mg /ml de yoduro de propidio en PBS suplementado con RNasa A (Roche, Indianapolis, IN, EE.UU.) durante 30 min a temperatura ambiente. Los datos fueron recolectados a través de los sistemas de BD. Tres experimentos independientes se realizaron en condiciones idénticas
Análisis estadístico
SPSS (versión 16.0 para Windows, SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Se utilizó para todos los análisis. Se utilizó la prueba de chi-cuadrado para determinar la correlación entre JAM-A expresión y características clínico-patológicas. Las curvas de Kaplan-Meier se utilizaron para el análisis de supervivencia, y se determinó log-rank basado en las diferencias. Se utilizó la prueba t de Student para comparar otros datos. P-valores se basan en el análisis estadístico de dos caras, y una p. & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Expresión y distribución de JAM-A en tejidos de NSCLC
Se analizó la expresión y distribución de JAM-a en 82 muestras de NSCLC y los tejidos normales correspondientes mediante inmunohistoquímica. JAM-A se expresa predominantemente en las membranas celulares; alta expresión de JAM-A se encontró en 37% de las muestras de tumor de pulmón (Tabla 1), que era mucho más alto que el epitelio bronquial y neumocitos en los correspondientes tejidos pulmonares no tumorales (Fig. 1). Se investigó la relación entre la expresión de membrana de JAM-A y parámetros clínico. Basado en el análisis univariante, la alta expresión de membrana de JAM-A se correlacionó significativamente con el estadio TNM (p = 0,021) y metástasis en los ganglios linfáticos (P = 0,007), pero no con la edad (p = 0,818), el sexo (p = 0,96), la diferenciación (p = 0,174), el estado del tumor (p = 0,105), y la histología del tumor (p = 0,818; Tabla 1). Se evaluó la relación entre la expresión de membrana de JAM-A y la supervivencia global en 49 pacientes de NSCLC. Tras el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, hemos encontrado que los pacientes con alta expresión de membrana de JAM-A tuvieron una supervivencia significativamente más baja (la supervivencia media = 50 ± 8,92 meses; 95% intervalo de confianza [IC], 32.56-67.48 meses) que los pacientes con baja expresión de membrana de JAM-a (la supervivencia media = 61 ± 4,31 meses; IC del 95%, 52.56-69.45 meses, p = 0,02; Fig. 2).
(a) fuerte JAM-a expresión en adenocarcinoma de pulmón (400X). (B) Débil JAM-A expresión en el adenocarcinoma de pulmón (400X). (C) Strong JAM-A expresión en pulmón carcinoma de células escamosas (400X). (D) débil JAM-A expresión en pulmón carcinoma de células escamosas (400X). (E) Tinción débil en el epitelio bronquial normal en el tejido pulmonar no cancerosa (400X). (F) Los controles negativos para JAM-A tinción con anticuerpo IgG de conejo no inmune (400X).
Los pacientes con baja expresión de JAM-A tuvo una mejor supervivencia global que los pacientes con alta expresión de JAM -A, tal como se define por la prueba de log-rank (p = 0,02).
JAM-A inhibe la proliferación de células de cáncer de pulmón de agotamiento
Hemos detectado JAM-Una expresión en las células normales del epitelio bronquial (HBE) y líneas celulares de cáncer de pulmón de seis por Western blot y análisis de PCR en tiempo real. células H1299 y A549 exhiben altos niveles de expresión de JAM-A, las células HBE mostraron niveles moderados de expresión de JAM-A, y H157, H460, SPC, y LK2 exhiben bajos niveles de expresión de JAM-A (Fig. 3A, B ). Debido a JAM-A es un transmembrana de tipo I glicoproteína, que luego analizado asociadas a la membrana los niveles de células JAM-A utilizando una citometría de flujo ensayo en líneas-A JAM celulares endógenos relativamente altas (H1299 y A549) y líneas-A JAM celulares endógenos relativamente bajas (H460 y H157). Como se muestra en la Fig. 3C, la expresión de superficie de JAM-A en las células H1299 y A549 fue mucho mayor que H157 y H460 células. Por lo tanto, hemos utilizado H1299 y A549 células en los estudios de pérdida de función.
JAM-A expresión en un panel de líneas de células de las vías respiratorias humanas derivadas evaluadas por Western blot, los datos se muestran como Western blots representativos experimentos. Los experimentos se repitieron 3 veces independientemente con resultados similares. (B) Expresión relativa de JAM-A mRNA en un panel de líneas de células de las vías respiratorias humanas derivadas evaluados por PCR en tiempo real. La cantidad relativa de JAM-A mRNA, normalizado a ß-actina, se compararon con las células H157 en base a la ecuación de RQ = 2
-ΔΔCt. Columnas, con una media de RQ de valores por triplicado en un experimento representativo; bares, max /min RQ. Los experimentos se repitieron 3 veces de forma independiente y realizaron por triplicado con resultados similares. (C) expresión en superficie de JAM-A en un panel de líneas de células de las vías respiratorias derivadas de humanos evaluados por un ensayo de citometría de flujo. Las células confluentes se trataron con tripsina y citometría de flujo análisis de ensayo se llevaron a cabo como se describe en la sección Métodos. Los datos se muestran como histogramas representativos (panel superior), la media de intensidad de fluorescencia de valores por triplicado en un experimento representativo, columnas, significan; bares, Dakota del Sur. (panel inferior). Los experimentos se repitieron 3 veces de forma independiente por triplicado con resultados similares.
Para determinar si o no JAM-A participa en la modulación del crecimiento de células de cáncer de pulmón, hemos utilizado siRNA desmontables JAM-A expresión en H1299 y líneas de células A549. En comparación con las líneas de control negativo siRNA transfectadas las células, JAM-A-siRNA efectivamente suprimidos los niveles totales de JAM-A de proteínas (Fig. 4A), JAM-A los niveles de mRNA (Fig. 4B), y los niveles de expresión de superficie (Fig. 4C) en las dos líneas celulares ensayadas. La tasa de crecimiento celular se determinó mediante el ensayo de MTT. células H1299 y A549 transfectadas con JAM-A-siRNA habían reducido las tasas de crecimiento en comparación con el control negativo siRNA (Fig. 5A). A continuación, realizó un método independiente (ensayo de formación de colonias) para validar el efecto antiproliferativo de JAM-A inhibición en células de cáncer de pulmón. De acuerdo con los resultados de MTT, JAM-A knockdown reduce efectivamente la capacidad de formación de colonias de las 2 líneas celulares de cáncer de pulmón analizadas (control negativo frente a JAM-A siRNA, H1229:231 ± 19 vs. 55 ± 7, p & lt; 0,01 ; A549:420 ± 31 vs 273 ± 21, p & lt; analiza la figura 5B)
(a) Western blot de JAM-a de eficiencia agotamiento de las células cancerosas; 0,01... Los datos se muestran como transferencias de Western representativas (panel izquierdo). análisis del valor densitometría de 3 experimentos independientes de Western blot, los datos se normalizaron en contra GAPDH, Columnas, media; bares, SD, ** p & lt; 0,01 (panel derecho). (B) análisis en tiempo real PCR de JAM-A eficiencia agotamiento en las células cancerosas, la cantidad relativa de JAM-A mRNA, normalizado a ß-actina, se compararon con el grupo de siRNA-transfectadas de control negativo en base a la ecuación RQ = 2
-ΔΔCt. Columnas, con una media de RQ, en un experimento representativo; bares, max /min RQ. Los experimentos se repitieron 3 veces de forma independiente, por triplicado, con resultados similares. (C) La citometría de flujo análisis de ensayo de JAM-A de eficiencia agotamiento de expresión en la superficie. células H1299 y A549 se seccionan transitoriamente con control negativo siRNA o JAM-A siRNA; después de 48 h, las células se tripsinizaron y citometría de flujo análisis de ensayo se llevaron a cabo como se describe en la sección Métodos. Los datos se muestran como histogramas representativos (panel superior), la media de intensidad de fluorescencia de valores por triplicado en un experimento representativo, columnas, significan; bares, Dakota del Sur. ** P & lt; 0,01 (panel inferior). Los experimentos se repitieron 3 veces de forma independiente, por triplicado, con resultados similares.
ensayo (A) MTT se realizó después de JAM-Un tratamiento siRNA. Se observó la absorbancia a 490 nm en diferentes puntos de tiempo. Los datos se muestran como la media ± desviación estándar de los experimentos representativos, * p & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01. 3 experimentos independientes con 5 repeticiones internas por experimento se llevaron a cabo con resultados similares. (B) Valoración de los potenciales clonogénico de las células cancerosas empobrecido-JAM-A. campos completos por placa fueron fotografiados y presentados. Los datos se muestran como ensayo de colonias representante formación (panel izquierdo), se contó el número de colonias de valores por triplicado en un experimento representativo, columnas, media; bares, Dakota del Sur. ** P & lt; 0,01 (panel derecho). 3 experimentos independientes por triplicado, se llevaron a cabo con resultados similares.
JAM-una caída Los resultados en la detención de G1 y de inhibición del crecimiento de células cancerosas de pulmón
A continuación trató de investigar los posibles mecanismos por los cuales JAM -A caída puede disminuir la proliferación celular. Se analizó el ciclo celular por fluorescencia de células activadas (FACS), y mostraron que el porcentaje de células en la fase G1 se incrementó (H1299, control negativo frente a JAM-A siRNA, 57,8 ± 2,8 vs. 68,1 ± 2,5, p & lt ; 0,01; control negativo A549 vs JAM-a siRNA, 57,12 ± 2,77 vs. 2,52 ± 65.96.1, p & lt; 0,05; Fig. 6), mientras que las células en la fase S se redujeron en células tratadas con JAM-a desmontables en comparación con las células control (H1299, control negativo frente a JAM-a siRNA, 30,49 ± 2,8 vs. 24,1 ± 2,74, p & lt; 0,05; de control negativo A549 vs. JAM-a siRNA, 29,33 ± 2,61 vs. 2,49 ± 23.49.1, p & lt ; 0.05; Fig. 6). Estos resultados sugieren que la progresión del ciclo celular-A JAM detenciones de deleción en el G1 /S límite. Para elucidar el mecanismo subyacente de JAM-A agotamiento en la detención del ciclo celular, hemos probado aún más el efecto de JAM-A caída en el nivel de expresión de los factores de varios de células relacionadas con el ciclo, que incluyen la ciclina A, ciclina B, ciclina D1, CDK4, CDK6, P27, P21, y P-Rb. El análisis de transferencia Western reveló que desmontables de JAM-A disminuyó los niveles de proteína de la ciclina D1, CDK4, CDK6, y P-Rb (Fig. 7). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la inhibición de JAM-A expresión induce la detención del ciclo celular en la fase G1 y suprime el crecimiento de células de cáncer de pulmón.
Eficacia de JAM-A desmontables sobre la progresión del ciclo celular se analizó mediante activado por fluorescencia clasificación de células. Los datos se muestran como un experimento representativo (panel izquierdo), el porcentaje de células en diferentes fases del ciclo celular se muestra como la media ± DE de 3 experimentos independientes, * p & lt; 0,05; ** P & lt;. 0.01 (panel derecho) guía empresas
(A) se llevó a cabo el análisis de transferencia Western de un panel de proteínas en siNC- o líneas siJAM-A-H1299 transfectadas las células (panel izquierdo) y A549 líneas celulares (panel derecho). Los datos se muestran como transferencias de Western representativas. Tres experimentos independientes se realizaron con resultados similares. (B) Análisis de Densitometría de 3 experimentos independientes de Western blot, los datos se normalizaron en contra GAPDH, Columnas, media; bares, SD, * p & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
PI3K-Akt-β-catenina señal de la cascada no es inhibida por altos niveles de expresión de superficie JAM-A en células cancerosas de pulmón
Los estudios publicados indican que JAM-A restringe la proliferación de las células epiteliales intestinal (IEC) mediante la inhibición de la activación de PI3K-Akt-β-catenina señal cascada [27]. Para explorar si esta vía de señalización también es eficaz en líneas celulares de cáncer de pulmón, también a prueba los niveles totales y fosforilada de Akt en JAM-A los estudios de pérdida de función. Western blot reveló que desmontables de JAM-A no cambió los niveles activos de Akt, lo que sugiere que los niveles altos de JAM-A en H1299 y A549 células no afectó a la activación de PI3K-Akt-β-catenina en cascada (Fig. 7).
Discusión
JAM-a se expresa en varios tipos de tumores y está implicado en la progresión tumoral. La expresión de JAM-Una proteína en los tejidos de NSCLC y la relación con diversos factores clínico-patológicos no ha sido examinado a fondo. Por otra parte, el papel exacto de JAM-A en la progresión del cáncer de pulmón no está claro. En este estudio se analizó el patrón de expresión y la función biológica de JAM-A en NSCLC. Demostramos que JAM-A se localiza predominantemente en las membranas celulares, y la expresión de JAM-A en los tejidos de cáncer de pulmón es mayor que los correspondientes tejidos pulmonares normales. El alto nivel de expresión de membrana de JAM-A se asoció significativamente con el estadio pTNM avanzada, metástasis de ganglios linfáticos, y redujo la supervivencia global en pacientes con cáncer de pulmón. Tomados en conjunto, nuestros resultados revelaron que JAM-A es una proteína oncogénica potencial en NSCLC y puede servir como un predictor negativo de la supervivencia en pacientes con CPNM.
Para estudiar más a fondo la función potencial de la JAM-A en células de cáncer de pulmón , hemos utilizado siRNA a desmontables JAM-a expresión en líneas celulares H1299 y A549, que expresan niveles relativamente altos de superficie JAM-a. formación proliferación y la colonia en las dos líneas celulares se suprimió significativamente después de silenciamiento de JAM-A. La mayoría de los factores de proliferación influir en el crecimiento celular al afectar la progresión del ciclo celular, de este modo se analizó el ciclo celular y mostraron que las células desmontables JAM-A tenían niveles más altos de la fase G1 y fase inferior S de las células de control. Por lo tanto, JAM-A silenciamiento inhibe la transición de G1 a S en la progresión del ciclo celular, lo que podría dilucidar el mecanismo de JAM-A sobre la proliferación de células de cáncer de pulmón. Para determinar el mecanismo potencial de JAM-A en la regulación del ciclo celular, se analizó el efecto de JAM-A desmontables en las moléculas relacionadas con el ciclo celular. Se analizó la expresión de la ciclina A, ciclina B, ciclina D1, CDK4, CDK6, P21, P27, y P-RB, y se encontró que los niveles de expresión de ciclina D1, CDK4, CDK6, y P-RB se redujeron después de JAM -A desmontables. Se ha demostrado previamente que la P-RB es responsable de un importante punto de control G1, el bloqueo de la entrada en fase S y el crecimiento celular mediante la asociación física con los factores E2F y bloqueo de la activación de la expresión génica que codifica productos necesarios para la progresión de la fase S. El complejo proteico compuesto por ciclina D1, CDK4, CDK6 y se fosforilar P-RB y promover la inactivación P-RB. Continúa la fosforilación de P-RB por diversas CDK conduce a la liberación de E2F, facilitando de este modo la activación de genes críticos para la progresión de la fase S [28], [29], [30]. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que JAM-A controla positivamente la proliferación de células de NSCLC mediante la regulación de la expresión de las moléculas relacionadas con el ciclo celular, tales como la ciclina D1, CDK4, CDK6, y P-RB.
Los estudios publicados indican que JAM-A restringe la proliferación IEC mediante la inhibición de la activación de PI3K-Akt-β-catenina [27]. Para explorar si los altos niveles de superficie JAM-A de las dos líneas celulares de la prueba o no afecta negativamente la proliferación celular en la misma forma que la IEC, también a prueba los (fosforilación) niveles activos de Akt en JAM-A los estudios de la pérdida de función de las . Western blot reveló que desmontables de JAM-A en H1299 y A549 células no cambió los niveles activos de Akt, lo que indica que los altos niveles de JAM-A en H1299 y A549 células no afectó cascada de señalización PI3K-Akt-β-catenina
activación.
El papel de JAM-a en el crecimiento y la diseminación del tumor sigue siendo un tema controvertido. Naik et al. [18] informó inicialmente que JAM-A expresión se asocia negativamente con la agresividad del cáncer de mama y metástasis en 12 tumores y el correspondiente tejido no neoplásico, así como 50 maligno y las correspondientes muestras de ganglios linfáticos metastásico. Sin embargo, Mc Sherry et al. [21], el uso de grandes conjuntos de datos clínicos (un paciente microarrays 270 invasiva el tejido de cáncer de mama [TMA] y un conjunto de datos independientes de la expresión génica de información de 295 pacientes con cáncer de mama primario), mostraron una correlación positiva entre JAM-Una expresión e invasiva pronóstico del cáncer de mama, lo cual fue confirmado además por su otro informe publicado el uso de un mayor conjunto de datos [24]. Recientemente, Murakami et al. [22], utilizando TMA de 444 pacientes con cáncer de mama invasivo, también informó de una correlación similar. En el contexto del cáncer de mama invasivo, teniendo en cuenta el conjunto de datos más grande, la asociación entre los datos clínico-patológicos y datos de supervivencia analizados por McSherry et al. [21], [24] y Murakami et al. [22], alta JAM-Una expresión debe ser un factor pronóstico negativo de la evolución del paciente. El mecanismo mediante el cual las células tumorales mantener una alta JAM-A durante la progresión tumoral queda por definir. Gotte et al. [25] mostró que el miR-145, que se dirige y regula a la baja JAM-A, es el regulado en células de cáncer de mama. Estos datos podrían explicar los altos niveles de JAM-A en este tipo particular de tumor [22]. Sin embargo, si es o no el miR-145 juega el mismo papel en el CPNM en el cáncer de mama necesita más investigación. Cabe señalar que los efectos positivos negativos, pero no de JAM-A sobre la progresión del tumor También se informó basan en conjuntos de datos clínicos con carcinoma endometrial [19] y el cáncer de páncreas [20], lo que sugiere que el papel de JAM-A en la progresión tumoral puede ser dependiente del tipo de célula. Los datos publicados han centrado en los mecanismos para la progresión tumoral JAM-A de regulación, aunque controvertido, sería mejor aclarar esta cuestión. Positivo [21], [22], [23], [24], [25], [26] y negativa [18], [19] efectos de JAM-A sobre la progresión del tumor se ha informado de
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