Extracto
El karyopherin comprende superfamilia de proteínas de transporte nucleares, que participan en el vaivén de ciertas proteínas de carga dentro y fuera del núcleo. β1 karyopherin (Kpnβ1) y α2 karyopherin (Kpnα2) se Importin proteínas, que trabajan en conjunto para transportar su carga en el núcleo. Hemos identificado previamente el aumento de expresión de Kpnβ1 y Kpnα2 en tumores de cuello uterino en comparación con el epitelio normal y en células transformadas en comparación con sus homólogos normales. Este estudio, por tanto, el objetivo de identificar los mecanismos reguladores de la transcripción asociados con niveles elevados Kpnβ1 y Kpnα2 en las células cancerosas. Kpnβ1 (-2,013 a 100) y Kpnα2 (-1900 a 69) fragmentos promotores se clonaron por separado en el vector reportero, y ensayos de luciferasa pGL3-básicos revelaron tanto las células como significativamente más activo en el cáncer y transformado en comparación con el normal. Una serie de construcciones de deleción identificó los -637 a -271 y -180 Kpnβ1 a -24 regiones promotoras Kpnα2 como responsable de la actividad promotora diferencial, y se identificaron una serie de sitios de unión a E2F altamente conservadas dentro de estas regiones. Análisis de la mutación confirmó el requisito de los sitios E2F para la actividad del promotor, y Chip análisis confirmó E2F2 /Dp1 unión a los promotores Kpnβ1 y Kpnα2
in vivo
. inhibición Dp1 dio como resultado niveles disminuidos de las respectivas proteínas, lo que confirma el papel de la E2F en la sobreexpresión de proteínas Kpnβ1 y Kpnα2 en el cáncer. se conoce la actividad de E2F ser desregulado en las células de cáncer cervical debido a la inhibición de su represor, Rb, por HPV E7. La inhibición de la E7 utilizando siRNA dado lugar a la disminución de las actividades promotoras Kpnβ1 y Kpnα2, al igual que la sobreexpresión de Rb. En conclusión, este estudio es un primer para demostrar que la expresión elevada Kpnβ1 y Kpnα2 en las células cancerosas se correlaciona con la regulación transcripcional alterada asociada con actividades Rb /E2F desregulados
Visto: van der Watt PJ, Ngarande E, más magra (VD 2011) La sobreexpresión de Kpnβ1 y Kpnα2 importin Las proteínas en el cáncer se deriva de Liberalizado E2F actividad. PLoS ONE 6 (11): e27723. doi: 10.1371 /journal.pone.0027723
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Octubre, 2011; Aceptado: 23 de octubre de 2011; Publicado: 18 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 van der Watt et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Universidad de Ciudad del Cabo, la Corporación Carnegie de Nueva York, CANSA, y el Consejo de Investigación médica (SA). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Ciudad del Cabo /Carnegie Corporation de Nueva York Desarrollo subvenciones, CANSA, y el Consejo de Investigación médica (SA). Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
karyopherin proteínas son receptores solubles de transporte nucleares que funcionan en el transporte de carga de proteínas y ARN en ciertos y fuera del núcleo de la célula, a través del complejo de poro nuclear (NPC) [1]. Carioferinas puede actuar como importins de exportinas, dependiendo de su dirección de transporte. Karyopherin beta 1 (Kpnβ1, también conocido como Importin β o p97) es una proteína importin que juega un papel clave en el proceso de importación nuclear. importación nuclear a través de Kpnβ1 puede ocurrir ya sea por Kpnβ1 actuar como un receptor de transporte nuclear autónoma, o a través de su asociación con una proteína adaptadora, como karyopherin alfa (Kpnα, también conocido como Importin α), en cuyo caso el proceso de importación se conoce como nuclear clásica importación [2]. En la vía clásica importación nuclear, la secuencia de localización nuclear (NLS) presente en la carga es reconocida y unida por el adaptador de proteínas, Kpnα, que a su vez forma un complejo trímero con Kpnβ1. La carga: Kpnα: complejo Kpnβ1 se transporta a través del complejo de poro nuclear en el núcleo, donde en ella se disocia por la unión de RanGTP. Hay seis isoformas Kpnα (Kpnα1-6), que se ha determinado que tienen unión preferencial a sustratos específicos [3]. El funcionamiento de las seis isoformas de este modo se amplía la gama de sustrato transportado a través del NPC.
Hemos demostrado recientemente que la expresión de la proteína y Kpnβ1 Kpnα, Kpnα2, es elevado en el cáncer de cuello uterino y las células transformadas tanto en el mRNA y los niveles de proteína [4]. Encontramos también que la inhibición de la expresión Kpnβ1 en células de cáncer cervical conduce a la muerte celular por apoptosis, lo que sugiere que las células de cáncer de cuello uterino se vuelven funcionalmente dependiente de la sobreexpresión Kpnβ1, poniendo de relieve la importancia de la regulación positiva Kpnβ1 en el mantenimiento de la biología del cáncer. En nuestro estudio de inhibición Kpnα2 no tuvo efecto sobre la viabilidad celular de cáncer cervical [4]; es posible que su inhibición resultó en compensación funcional por otros miembros de la familia Kpnα. Noetzel et al. [5] mostraron que las células de cáncer de mama se sometieron a la muerte celular por apoptosis cuando Kpnα2 se inhibió [5], lo que sugiere que en algunas líneas celulares podría ser funcionalmente redundantes, mientras que en otros es funcionalmente relevante. Además, muchos estudios recientes han identificado alta Kpnα2 en el tejido tumoral, lo que sugiere que la regulación al alza de los asociados Kpnα2 con el desarrollo del cáncer. Tales cánceres incluyen melanoma [6], cáncer de mama [7]; [8], cáncer del esófago [9], cáncer de ovario [10], no pequeñas de cáncer de pulmón de células [11], cáncer de próstata [12], cáncer de vejiga [13] y el cáncer de hígado [14]. Curiosamente, Wang et al. [11] mostró que Kpnα2 se secreta en el suero, lo que sugiere que tiene potencial utilidad clínica como un biomarcador de cáncer. Además, varios estudios han informado de que los altos asociados con expresión Kpnα2 pobre supervivencia de los pacientes [6] - [10]; [12]; [13], lo que sugiere un posible papel pronóstico para Kpnα2.
Mientras que la sobreexpresión de Kpnβ1 y Kpnα2 en las células cancerosas parecen ser acontecimientos significativos, se sabe poco acerca de su regulación transcripcional y los factores que controlan su expresión y plomo a su regulación por incremento en células de cáncer. En este estudio, por lo tanto, hemos clonado y analizado los promotores Kpnβ1 y Kpnα2, e identificamos un papel importante para el factor de transcripción E2F, en la inducción de la expresión Kpnβ1 y Kpnα2 en las células cancerosas.
Resultados
el aumento de la expresión de proteínas Kpnβ1 y Kpnα2 en transformadas y las células cancerosas se correlaciona con un aumento de la actividad del promotor
en base a los hallazgos anteriores que muestran una elevada expresión Kpnβ1 y Kpnα2 en células de cáncer de cuello uterino y las células transformadas en comparación a la normalidad, se investigó Kpnβ1 y la expresión de la proteína Kpnα2 en una línea celular de cáncer representante normales, transformados y de cuello uterino. Estos incluyen la línea celular de fibroblastos normales, WI38, la línea celular de fibroblastos transformada con SV40, SVWI38, y la línea celular de cáncer de cuello uterino, CaSki. El análisis de transferencia Western reveló una elevada expresión Kpnβ1 y Kpnα2 en las células transformadas y el cáncer, en comparación con las células WI38 normales (Fig. 1A). Para determinar los mecanismos reguladores de la transcripción que se asocian con elevada expresión Kpnβ1 y Kpnα2 en el cáncer y las células transformadas, aproximada una región de 2 Kb aguas arriba del sitio de inicio de transcripción de los genes Kpnβ1 y Kpnα2, junto con aproximadamente 100 pb de sus regiones no traducidas 5 '( aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción), se clonaron por separado en pGL3-Basic para el análisis de promotor. El promotor -2.013-100 Kpnβ1 y -1,990-69 Kpnα2 construye ambos mostraron significativamente mayor actividad en el transformadas y las células de cáncer en comparación con las células WI38 normales (Fig. 1B y C).
A. El análisis de Western Blot de Kpnβ1 y Kpnα2 niveles de proteína en WI38 normal SVWI38 transformado, y las células CaSki de cáncer cervical revela el aumento de expresión en el cáncer y las células transformadas. B, C. -2013-100 actividad Kpnβ1 promotor (B) y -1,900-69 actividad promotora Kpnα2 (C) se midió en lisados de células preparados a partir de células WI38, SVWI38 y CaSki transfectadas, y se observó a ser significativamente mayor en las células transformadas y cáncer en comparación con las células normales (* p & lt; 0,05). TK-Renilla-Luc se utilizó como control para la eficiencia de transfección y la actividad de la luciferasa se expresa en relación a la luciferasa de Renilla. Los resultados mostrados son la media ± desviación estándar de los experimentos realizados por triplicado y se repitieron al menos dos veces.
Kpnβ1 diferencial y Kpnα2 actividades promotoras de la normalidad, y transforman las células cancerosas se derivan de la -637 a -271 y -180 a -24 regiones de los promotores y Kpnβ1 Kpnα2, respectivamente
con el fin de determinar las regiones responsables de la actividad diferencial de los promotores y Kpnβ1 Kpnα2 en células normales y /cáncer transformadas, una serie de construcciones de deleción eran generada y se ensayó la actividad en las células WI38, SVWI38 y CaSki. Todos los constructos de deleción del promotor Kpnβ1 muestran significativamente más actividad en SVWI38 células en comparación con las células WI38 (Fig. 2A). Notablemente deleción en SVWI38 células secuencial de la región -2,013--637 no alteró la actividad del promotor, sin embargo, la supresión de la región de -637 a -271 disminuyó significativamente la actividad del promotor Kpnβ1 (aproximadamente cinco veces) (Fig. 2A). En células WI38, la supresión de esta región tuvo poco efecto sobre la actividad del promotor. En las células CaSki se hicieron observaciones similares a las de las células, donde SVWI38 deleción de la región -637 a -271 alterado de manera significativa la actividad del promotor Kpnβ1 (Fig. 2B). Estos resultados sugieren que los elementos funcionales importantes, necesarias para alta actividad promotora Kpnβ1 en células de cáncer de cuello uterino y transformadas, es probable que residir en la región de -637 a -271 del promotor Kpnβ1. Con respecto a Kpnα2, la deleción de la región 1.900--180 tuvo poco efecto sobre la actividad del promotor Kpnα2 en cualquiera de las líneas celulares (Fig. 2C, D), lo que sugiere que la región aguas arriba de -180 en el promotor Kpnα2 no confiere la actividad transcripcional. Sin embargo, la supresión de la región de -180 a -24 resultó en disminuyó significativamente la actividad del promotor, casi hasta el nivel del vector vacío, con la disminución de la actividad de ser más pronunciado en las células SVWI38 y CaSki, en comparación con WI38 (Fig. 2C, RE). Esto sugiere que los elementos funcionales importantes necesarias para la actividad del promotor basal alta Kpnα2 en células de cáncer de cuello uterino transformadas y residen en la región de -180 a -24 del promotor.
A. construcciones de informador de luciferasa que contenían fragmentos eliminados del promotor Kpnβ1 humano se transfectaron transitoriamente en células WI38 y SVWI38, respectivamente. La actividad de luciferasa fue significativamente mayor en las células SVWI38 comparación con las células WI38 normales para todas las construcciones ensayadas. El fragmento del promotor -637-100 Kpnβ1 contenía significativamente más actividad del promotor que el fragmento -271 a 100 en las células transformadas (* p & lt; 0,05). B. Actividad de Kpnβ1 promotor supresión construcciones en las células CaSki. construcciones de reportero de luciferasa C. contienen fragmentos eliminados del promotor Kpnα2 humano se transfectaron transitoriamente en células WI38 y SVWI38, respectivamente. La deleción del -180--24 región promotora dio lugar a disminución significativa de la actividad promotora. D. Actividad de Kpnα2 construcciones de deleción del promotor en células CaSki.
Los promotores Kpnβ1 y Kpnα2 contienen sitios E2F funcionales
Un análisis bioinformático de las regiones -637 a -271 de la Kpnβ1 promotor y -180 a -24 del promotor Kpnα2 (utilizando MatInspector y programas de software Conreal) identificado un número de sitios de unión putativos para E2F. E2F actividad desregulada se sabe que juega un papel clave en el desarrollo del cáncer; por lo tanto, se investigó la funcionalidad de estos sitios E2F putativos. Cinco putativo E2F sitios de unión se identificaron en el Kpnβ1 (-637 a -271) región promotora, y el uso de mutagénesis dirigida al sitio (y mutando al menos tres bases dentro de los sitios de unión consenso), se generaron constructos mutantes. Se encontraron tres sitios E2F para ser funcional, ya que su mutación resultó en una disminución significativamente la actividad del promotor Kpnβ1 (Fig. 3A). Esto incluye los supuestos sitios etiquetados como E2F (a), E2F (b) y E2F (c). Curiosamente, la mutación de estos tres sitios al mismo tiempo no confirió ninguna disminución adicional de la actividad del promotor, en comparación con la mutación de los sitios E2F individualmente, lo que sugiere que pueden trabajar en concierto para regular la expresión génica Kpnβ1 (Fig. 3A). Es de destacar, también, fue el hallazgo de que la mutación de los sitios E2F dio lugar a la actividad del promotor comparable a la de la construcción de -271 a 100, lo que sugiere que se trata de los sitios E2F que son responsables del aumento en la actividad promotora en la región de -271 a -637. La mutación de los tres sitios E2F en el promotor Kpnβ1 tenía un efecto más pronunciado sobre la actividad del promotor en las células SVWI38 y CaSki en comparación con la de las células WI38. Estos hallazgos sugieren que hay un aumento de la dependencia de los sitios E2F en células transformadas y el cáncer, en comparación con el normal (Fig. 3B).
A. La mutación de los cinco sitios E2F putativos en la Kpnβ1 (-637 a 100), el promotor se llevó a cabo por mutagénesis dirigida al sitio. La mutación de los tres sitios E2F distal conducen a una disminución significativa en Kpnβ1 (-637 a 100) la actividad del promotor, como se indica por ensayos de luciferasa. La mutación de los tres sitios E2F funcionales simultáneamente no condujo a cualquier disminución adicional en la actividad promotora. B. La mutación de los tres sitios E2F en células SVWI38 y CaSki tenía un impacto más profundo en la actividad del promotor Kpnβ1 en comparación con la de las células WI38 (números indican represión veces). C. La mutación del sitio de E2F en el promotor único Kpnα2 abolió completamente la actividad del promotor. D. La mutación del sitio de E2F en células SVWI38 y CaSki tenía un impacto más profundo en la actividad del promotor Kpnα2 en comparación con la de las células WI38. Los experimentos se muestran como la media ± SE de los experimentos realizados por cuadruplicado al menos dos veces (* P & lt; 0,05).
El análisis bioinformático del promotor Kpnα2, por otro lado, reveló la presencia de solamente un sitio E2F putativo en la región de -180 a -24. Curiosamente, a diferencia de los sitios E2F en el promotor Kpnβ1, la mutación de este sitio E2F único ha eliminado por completo la actividad del promotor Kpnα2 (Fig. 3C). La mutación del sitio de E2F en células SVWI38 y CaSki resultó en la represión 84- y 57 veces de la actividad promotora, respectivamente, mientras que su mutación en células WI38 sólo dio lugar a la represión de 4 veces del promotor (Fig. 3D).
en conjunto, estos resultados sugieren que el promotor Kpnβ1 contiene sitios E2F que actúan para mejorar la actividad del promotor, mientras que el promotor Kpnα2 contiene un sitio E2F que está implicado en la activación del promotor basal. Además, la activación de E2F de ambos promotores es más pronunciada en las células transformadas y el cáncer, en comparación a la normalidad.
E2F /heterodímeros DP1 unirse y activar los promotores Kpnβ1 y Kpnα2
in vivo
funciones E2F como un factor de transcripción heterodimérico compuesto por dos subunidades: un miembro de la familia E2F y un miembro de la familia Dp. Aunque hay varios miembros de la familia E2F que se cree que obligar a la misma secuencia de consenso (5'-TTTSSCGS-3 '; S se refiere a C o G), E2F1, E2F2 y E2F3 han demostrado que contienen una fuerte capacidad oncogénica [15], por lo tanto, la unión de E2F a los promotores Kpnβ1 y Kpnα2 se investigó usando un anticuerpo contra E2F2 que reacción cruzada con E2F1, E2F2 y E2F3. La familia de proteínas Dp comprende proteínas Dp1-3, con Dp1 haber sido previamente vinculado al cáncer. Para evaluar E2F2 /unión Dp1
in vivo
, ensayos de chip se realizaron utilizando la cromatina preparado a partir de células SVWI38 y CaSki. ADN se inmunoprecipitó utilizando anticuerpos α-E2F2 o α-DP1 y se utiliza en una PCR con cebadores que abarca los sitios E2F en los promotores Kpnβ1 y Kpnα2 (Fig. 4A, B). amplificación positiva en ambas líneas celulares SVWI38 y CaSki confirmó una asociación entre E2F2 /Dp1 y los sitios E2F, tanto en los promotores Kpnβ1 y Kpnα2 (Fig. 4A, B).
A, B. Las muestras de cromatina sonicado eran inmunoprecipitaron con un anticuerpo α-E2F2, un anticuerpo α-DP1, o sin anticuerpo, como se indica. ADN aislado de material inmunoprecipitado se amplificó por PCR usando cebadores que abarcan los sitios E2F presentes en el Kpnβ1 (A) o Kpnα2 promotores (B). Los fragmentos amplificados se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 2%. Los experimentos se realizaron en ambas líneas celulares SVWI38 y CaSki. C. Transferencia Western que muestra los niveles de proteína y Kpnβ1 Kpnα2 después de la inhibición Dp1 utilizando siRNA. β-tubulina se utilizó como control para la carga de proteínas. D, E. Kpnβ1 y Kpnα2 promotor de las actividades después de la inhibición Dp1. Los resultados mostrados son la media ± SE de los experimentos realizados por cuadruplicado al menos dos veces (* P & lt; 0,05).
Además, para determinar si la unión de E2F /Dp1 a los promotores Kpnβ1 y se Kpnα2 responsable de los elevados niveles de ambas proteínas Kpnβ1 y Kpnα2
in vivo
, la actividad E2F fue inhibida por silenciar la expresión de Dp1, sin la cual E2F ya no puede funcionar. Kpnβ1 y Kpnα2 los niveles de proteína se midieron por análisis Western Blot después de Dp1 knock-down usando siRNA, y se encontró que disminuir después de la inhibición Dp1 (Fig. 4C). Kpnβ1 y Kpnα2 actividades promotoras fueron reprimidos de manera similar a la inhibición Dp1 (Fig. 4D, E).
E7 del VPH regula Kpnβ1 y Kpnα2 actividades promotoras de células de cáncer cervical a través de la represión de Rb
En cervical células de cáncer de la proteína E7 de HPV se sabe que se unen la proteína retinoblastoma (Rb), que conduce a su fosforilación y en última instancia la degradación. Es por esta razón que los genes E2F objetivo a menudo se sobreexpresa en el cáncer cervical, como E2F ya no es reprimida por Rb y es por tanto libre para activar sus genes diana. Por lo tanto, la hipótesis de que la inhibición de HPV E7 en células de cáncer cervical conduciría a la función Rb restaurado, causando reducción de la actividad E2F, y por lo tanto disminuidos Kpnβ1 y Kpnα2 actividades promotoras. Para probar esta hipótesis, las células CaSki fueron transfectadas con HPV16 E7 siRNA (Fig. 5A), y después de confirmar la restauración de la Rb (indicado en la Fig. 5B por una disminución en los niveles de fosforilados Rb y un asociado aumentado en unphosphorylated Rb), Kpnβ1 se midieron (-637 a 100) y Kpnα2 (-180 a 69) las actividades promotoras. Kpnβ1 y Kpnα2 promotor de las actividades se redujeron significativamente en las células knock-down E7, en comparación con las células control, aunque en diferentes grados (Fig. 5C y D). Para confirmar que las disminución de las actividades de promotor Kpnβ1 y Kpnα2 fueron a través de la restauración de la función Rb, Rb se sobreexpresa en células de cáncer cervical CaSki y Kpnβ1 y Kpnα2 actividades promotoras medidos. Los resultados mostraron que Kpnβ1 y Kpnα2 actividades promotoras fueron ambos redujo significativamente en la sobreexpresión de Rb (Fig. 5E y F). En conjunto, estos hallazgos sugieren que los altos Kpnβ1 y Kpnα2 niveles de expresión en células de cáncer cervical se debe en parte a la inhibición mediada por E7 de Rb, y el consiguiente aumento de la activación de los promotores y Kpnβ1 Kpnα2 por E2F.
, B. HPV16 E7 siRNA se utilizó para inhibir la expresión de E7 en las células CaSki y análisis de transferencia Western realizado para analizar HPV E7 (a) y los niveles de Rb (B) después de HPV E7 knock-down. C, D. Kpnβ1 (C) y Kpnα2 (D) promotor de las actividades se midieron después de siRNA transfección E7, y se encontró que se inhibió significativamente después de la inhibición E7 del VPH. E, F. Rb se sobreexpresa en las células CaSki y Kpnβ1 (E) y no se encontraron actividades Kpnα2 (F), el promotor que se inhibe de manera significativa. Los resultados mostrados son la media ± SE de los experimentos realizados por cuadruplicado al menos dos veces (* P & lt; 0,05).
Discusión
En este estudio hemos clonado y analizado la Kpnβ1 y Kpnα2 los promotores con el objetivo de identificar posibles mecanismos de regulación que podría conducir a su alta expresión en las células cancerosas. Este estudio es novedoso ya que es la primera a nuestro conocimiento que describe E2F como un importante regulador transcripcional de la expresión Kpnβ1 y Kpnα2 en células de cáncer. E2F juega un papel en una amplia gama de procesos celulares y se ha informado de regular la expresión de genes implicados en la diferenciación, el desarrollo, la proliferación y la apoptosis [16]. Se informó anteriormente que E2F juega un papel en la regulación del gen RanBP1 [17], un socio importante de la GTPasa Ran y parte integral del proceso de transporte nuclear, y nuestro estudio, la descripción de E2F-regulación de las proteínas importador nuclear Kpnβ1 y Kpnα2 , implica más E2F en la regulación de genes implicados en el transporte nuclear.
actividad E2F es controlada por la ruta de Rb, con lo que en circunstancias normales RB unión a E2F reprime la actividad E2F, hasta que la fase G1 /S de la célula ciclo, con lo cual se convierte en Rb fosforilada por complejos de CDK4 /ciclina D, y se libera E2F para activar sus genes diana. Sin embargo, la actividad de E2F es a menudo desregulado en el cáncer, como resultado de la interrupción frecuente de la vía Rb [18] - [21]. mutaciones Rb se han observado en un amplio espectro de tumores, incluyendo osteosarcomas, pequeños carcinomas de pulmón de células, carcinomas de mama, y otros. Además, en muchos tipos de cáncer la p16
inhibidor INK4a cdk está mutado, o su función es la pérdida. Esto conduce a una elevada actividad D cdk4 /ciclina, lo que resulta en un aumento de la fosforilación de Rb y la acumulación de este modo E2F. expresión y /o amplificación de genes de ciclina D y CDK4 Finalmente, desregulado se han observado también en muchos tipos de cáncer. Esto conduce a un aumento del nivel de actividad de cdk4 /ciclina D y por lo tanto de manera similar la desregulación de la vía de E2F [21]. En el cáncer cervical, la inactivación del represor E2F, Rb, por HPV E7, se traduce en una mayor actividad E2F. Como resultado de la interrupción frecuente de la vía que regula la función E2F, genes E2F objetivo a menudo se sobreexpresa en células de cáncer debido a una mayor transactivación E2F [22].
Se demuestra que sobreexpresión de Kpnβ1 y Kpnα2 en el cáncer es debido a, en parte, el aumento de la activación de sus promotores por E2F. Un estudio murino por Ishida et al. [23] identificó un posible papel de E2F en la regulación de la expresión génica Kpnα2 durante el ciclo celular. Nuestro estudio se extiende este hallazgo y muestra un papel para E2F en la regulación de Kpnα2 humana, a través de un sitio de E2F específico ubicado en la posición -34 a -27 del promotor Kpnα2. Resulta indispensable que tanto basal y la expresión génica Kpnα2 activado este sitio E2F. Además, se identificaron tres sitios funcionales E2F en el promotor Kpnβ1 que parecen actuar en concierto para regular la expresión Kpnβ1. Se ha informado de que múltiples sitios E2F pueden existir en la región promotora de un gen, y que estos sitios a menudo cooperan para regular la expresión de genes [24].
El hallazgo de que genes Kpnβ1 y Kpnα2 están regulados por E2F sugiere que están regulados de manera dependiente del ciclo celular. Previamente se ha informado de que la importación nuclear de karyopherin /ß-sustratos es más eficiente en ciertas etapas del ciclo celular [25], de acuerdo con nuestros datos que muestran E2F-regulación de Kpnβ1 y Kpnα2. En general, nuestros resultados sugieren que la actividad desregulada de E2F en células de cáncer ocasiona un aumento de la activación de los promotores y Kpnβ1 Kpnα2, lo que lleva a niveles elevados de estas proteínas, y en última instancia afectar el fenotipo del cáncer.
Materiales y Métodos
cultivo de células
WI38 de fibroblastos pulmonares normales, SVWI38 transforman WI38 de fibroblastos, y se obtuvieron las células de cáncer de cuello uterino CaSki de la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, EE.UU.). Las células se mantuvieron en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 mg /ml) y 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco, Paisley, Escocia). Todas las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
cosecha de proteínas y análisis de Western Blot
células en cultivo se hicieron crecer hasta 80% de confluencia y se lisaron en hielo en tampón RIPA (10 mM Tris-Cl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de desoxicolato, 0,1% SDS, 1% de Triton X-100, 1 X completo de cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Basilea, Suiza)). Western Blot análisis se realizaron con el conejo anti-Kpnβ1 (H-300) (sc-11367, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), de cabra anti-Kpnα2 (C-20) (sc-6917), anti-conejo -Dp1 (K-20) (SC-610), de ratón anti-HPV16 E7 (ED17) (SC-6981), de ratón anti-Rb (4H1) (# 9309, Cell Signaling), y de conejo anti-β-tubulina ( H-235) (sc-9104, Santa Cruz Biotechnology) anticuerpos
amplificación por PCR de la Kpnβ1 (-2,013 a 100), el promotor
se diseñaron cebadores que amplificar la región de. - 2013-100 del gen Kpnβ1 (número de acceso de GenBank: NC_000017): Kpnβ1F 5 'AGGCTAGCCCAGCTACATCCAATTACCC 3' y 5 Kpnβ1R 'AGAAGCTTCTGGGGGCAGCTCAGA 3' (NheI sitio HindIII está subrayado y el sitio está en negrita), y -1.992-69 de la Kpnα2 gen (GenBank número de acceso: NC_000017): Kpnα2F 5 'AGTT
CCCGGG
GCAAAAGAAACTCAACTTGGC 3' y 'AGAAGCTTGGGAATCAGCGGCTGTAG 3' Kpnα2R 5 (SmaI sitio está en cursiva y HindIII sitio está en negrita). PCR se realizó usando 100 ng de ADN normal de la sangre como plantilla, y la alta fidelidad Expand Plus DNA polimerasa (Roche). 5% de DMSO fue incluido en el PCR para Kpnβ1 para mejorar la especificidad. Promotor productos de PCR se subclonaron en el (-1,992-69) fragmento de pGEM-T Easy (Promega) y la Kpnβ1 (-2,013 a 100) fragmento cortado con enzimas de restricción NheI y HindIII, y el Kpnα2 vector escindido con SmaI y HindIII enzimas de restricción, para la subclonación en el plásmido informador de luciferasa, pGL3 vector básico (Promega). Hubo dificultades con la digestión con SmaI, SacI, por tanto, se utiliza en su lugar, como un sitio SacI estaba presente en la posición -1900 del promotor Kpnα2. Subclonación en pGL3 básico coloca la Kpnβ1 (-2013 a 100) y Kpnα2 (-1990-69) fragmentos del promotor aguas arriba del gen de la luciferasa sin promotor para el análisis de la actividad del promotor. Construcciones fueron verificadas por secuenciación usando la Unidad de Secuenciación Genética Humana UCT.
Generación de Kpnβ1 y Kpnα2 construcciones de deleción del promotor
Se generaron construcciones de deleción del promotor para Kpnβ1 utilizando sitios de restricción comunes a ambos el promotor clonado fragmento y el sitio de pGL3-Basic clonación múltiple (KpnI para la construcción de -637 a 100; SacI para la construcción de -271 a 100), o cebadores directos específicos del gen (5 'AGGCTAGCGCCGTCAGGAGAGCTTGA 3' para la -861-100 construir; 5 'AGGCTAGCAGCGCCTGGCCAGTTAG 3' para la construcción de -108 a 100; sitio de restricción NheI está subrayado) y el cebador Kpnβ1 R. El -180-69 para la construcción de deleción Kpnα2 se generó usando NruI y SacI enzimas de restricción, que publicó el fragmento de -1900 a -180, mientras que la construcción -24-69 eliminación se ha generado utilizando SwaI y SacI enzimas de restricción, que dio a conocer los -1900--24 fragmento.
Los ensayos de luciferasa
100 ng de cada construcción de promotor se transfectó en 30 000 CaSki células de cáncer cervical /pocillo de una placa de 24 pocillos, con 0,3 l TransFectin ( Bio-Rad). Para normalizar la eficiencia de transfección, las células se co-transfectaron con 10 ng del plásmido pRL-TK (que codifica la luciferasa de Renilla). Lisados de células totales se prepararon a partir de células 24 horas después de la transfección usando 1 X tampón de lisis pasiva (Promega) y la actividad de luciferasa de luciérnaga se ensayó usando el kit de luciferasa Dual (Promega). La luminiscencia se controló usando el luminómetro de microplacas Glomax 96 (Promega). La actividad fue normalizada a la actividad de luciferasa de Renilla de pRL-TK en el mismo extracto.
mutagénesis dirigida al sitio de los sitios E2F putativo
Las mutaciones en los sitios de unión de E2F del promotor Kpnβ1 se prepararon mutagénesis dirigida al sitio, usando los cebadores mutagénicos: E2Fa: F: 5 'CGCTCAGGCCCGCtAgcACCTCGCGCAACAC 3'; E2Fa: R: 5 'GTGTTGCGCGAGGTgcTaGCGGGCCTGAGCG 3'; E2Fb: F: 5 'GAACCCAGCTCCGCCTCTTgCtaGcGGCGTCCCATCGTGCCCC 3'; E2Fb: R: 5 'GGGGCACGATGGGACGCCgCtaGcAAGAGGCGGAGCTGGGTTC 3'; E2Fc: F: 5 'GCTCCTAGGGTTGCtaGcCACCTCCCGCCTTCC 3'; E2Fc: R: 5 'GGAAGGCGGGAGGTGgCtaGCAACCCTAGGAGC 3'; E2Fd: F: 5 'CGGGCACCTCCCGCCTgCtaGCGCCCCGACCCCGAAC 3'; E2Fd: R: 5 'GTTCGGGGTCGGGGCGCtaGcAGGCGGGAGGTGCCCG 3'; E2Fe: F: 5 'CTCCTCTCCTTAGTTCTCgCtaGCACCCTATCCTATCAAC 3'; E2Fe: R: 5 'GTTGATAGGATAGGGTGCtaGcGAGAACTAAGGAGAGGAG 3' (bases mutadas se indican en minúsculas; sitio de restricción NheI está subrayado). La mutación del sitio de unión a E2F en el promotor Kpnα2 se llevó a cabo usando los cebadores mutagénicos: F 5 'CAATCGGAATGCGGAGTCgCtaGcAAATTTAAATCGCGCCGGGC 3' y R '5' GCCCGGCGCGATTTAAATTTgCtaGcGACTCCGCATTCCGATTG 3 '. PCR se realizó usando las siguientes condiciones: 95 ° C durante 30 segundos, seguido de 18 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 61 ° C durante 1 minuto, y 72 ° C durante 6 minutos, seguido de una etapa de extensión final de 72 ° C durante 20 minutos. Después de la amplificación PCR, 10 U DpnI (Promega) se añadió y la digestión llevada a cabo a 37 ° C durante 90 minutos, antes de la transformación en JM109 células altamente competentes (Promega). Se utilizó el análisis de digestión de restricción para identificar clones que lleva la mutación.
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayo
Las células fueron cultivadas a aproximadamente el 90% de confluencia y de proteínas de ADN complejos reticulado con 1% de formaldehído durante 10 minutos, seguido de la adición de 0,125 M de glicina, pH 2,5. Las células se recogieron, se lisaron en tampón de lisis (1% de SDS, EDTA 5 mM, 50 mM Tris-Cl, pH 8,1, 1 X Completo inhibidor de la proteasa (Roche)), y se sonicaron a longitudes de entre 400 y 1000 pb. Los lisados celulares se diluyeron en tampón de dilución (1% Triton X-100, EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 20 mM Tris-Cl, pH 8,1, 1 X Completo inhibidor de la proteasa) y después precleared con proteína-A perlas de agarosa (Merck, NJ, EE.UU.) durante 2 horas. Beads habían sido bloqueadas previamente en /ml de ADN de esperma de salmón 100 mg y 5% de BSA. La cromatina se incubó con 2 anticuerpos g (α-E2F 2 (C-20 X, sc-633 X, Santa Cruz Biotechnology); alfa-DP1 (K-20, sc-610, Santa Cruz Biotechnology), o ningún control negativo anticuerpo ) a 4 ° C durante la noche. Se añadieron cuentas de Proteína-A agarosa durante un 2 hr adicionalmente a 4 ° C, y inmunocomplejos unidos por las perlas se recuperaron por centrifugación y se lavaron dos veces secuencialmente en TSE I (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, 20 mM Tris-Cl, pH 8,1, NaCl 150 mM), TSE II (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, 20 mM Tris-Cl, pH 8,1, NaCl 500 mM), tampón III (0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% desoxicolato de sodio, EDTA 1 mM, 10 mM Tris-Cl, pH 8,1) y TE, pH 7,4.