Extracto
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por enfermedades malignas en todo el mundo, con el subtipo de células no pequeñas (NSCLC), que representan la mayoría de los casos. NSCLC se caracteriza por desequilibrios genómicos frecuentes y variaciones del número de copias (CNV), pero las aberraciones epigenéticos que están asociadas con pronóstico clínico y el fracaso terapéutico no permanecen identificar completamente. En el presente estudio, se incluyeron un total de 55 pacientes con cáncer de pulmón y que lleva a cabo genómica y análisis de la expresión genética, la detección inmunohistoquímica de proteínas, metilación del ADN y la cromatina immunoprecipitation ensayos para obtener perfiles genéticos y epigenéticos asociados al pronóstico y chemoresponse de los pacientes con CPNM. Por último, siRNA transfección mediada por silenciamiento genético y ensayos de citotoxicidad celular de cisplatino en líneas celulares de cáncer A-427 y INER-37 fueron evaluados para describir los mecanismos implicados quimio-resistencia. Nuestros resultados identifican altas frecuencias de las VNC (66-51% de los casos) en las regiones citogenéticas 7p22.3-p21.1 y p15.2-7p15.3. Sin embargo, la sobreexpresión de los genes, como
MEOX2
,
HDAC9
,
TWIST1
y
Ahr
, en 7p21.2-p21.1 ocurrieron locus a pesar de la ausencia de CNV y pequeños cambios en la metilación del ADN. Por el contrario, las secuencias promotoras de
MEOX2
y
TWIST1
muestran significativamente menor /disminución de la marca de la histona represiva H3K27me3 y el aumento en la marca de histonas activo niveles H3K4Me3. Finalmente estos resultados se correlacionan con una pobre supervivencia en pacientes con CPNM y quimio-resistencia celular a fármacos oncológicos en líneas celulares de cáncer en un
MEOX2 Opiniones y
TWIST1
sobreexpresión dependiente de la forma. En conclusión, se presenta por primera vez que
MEOX2
participa en la quimio-resistencia con independencia de alta CNV, pero depende significativamente H3K27me3 enriquecimiento probablemente asociado con la agresividad y el fracaso de la quimioterapia en pacientes con CPNM, sin embargo los estudios clínicos adicionales deben estar realizado para confirmar nuestros hallazgos como nuevos marcadores clínicos probables en pacientes con CPNM
Visto:. Ávila Moreno-M, L Armas-López, Álvarez-Moran AM, López-Z Bujanda, Ortiz-Quintero B, Hidalgo-Miranda A, et al. (2014) La sobreexpresión de
MEOX2
y
TWIST1
se asocia con niveles H3K27me3 y determina el cáncer de pulmón quimiorresistencia y pronóstico. PLoS ONE 9 (12): e114104. doi: 10.1371 /journal.pone.0114104
Editor: Santosh Patnaik, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Agosto, 2014; Aceptado: 29 de octubre de 2014; Publicado: Diciembre 2, 2014
Derechos de Autor © 2014 Ávila-Moreno et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel y sus pretensiones, indicando cantidades de información y archivos. matriz de datos se han presentado a la base de datos GEO (GSE62407)
Financiación:. FAM autor fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), fondos para la investigación en ciencia básica, Proyecto 0.053.643; Dirección de Investigación del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias (INER); y la Universidad Nacional Autónoma de México, UNAM, Proyectos IACOD-PAPIIT IA201611, PAPIIT IB202512 y PAPIIT RR282512. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cáncer
pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer tanto en los EE.UU. [1] y en todo el mundo, con el subtipo de células no pequeñas (NSCLC), que representan la mayoría de los casos en los fumadores y los no-tabaco pacientes relacionados [2]. diagnósticos tardíos y terapias ineficaces contribuyen a un mal pronóstico y con las tasas promedio de 5 años de supervivencia inferior al 15% [1], [3], [4], [5].
CPNM se caracteriza por alteraciones genómicas, que incluyen variaciones en el número de copias de ADN somáticas comunes (CNV). La hibridación genómica comparada (CGH) por cariotipo espectral [6] o ensayos de microarrays de ADN genómico de baja resolución [7], las pérdidas [8], [9] han puesto de relieve /deleciones en 2q36-37, 3p21, 8p22, 9p21-22, 9q22 , 13q22 y 17p12-13, y las ganancias /amplificaciones en 1q23, 1q31, 3q25-27, 5p13-14, 6p, 7q y 8q23-24; Sin embargo, algunas de estas alteraciones se han demostrado estar involucrados en la agresividad del tumor [9] o la progresión clínica de CPCNP.
SNP arrays de alta densidad Recientemente, consorcios internacionales para el estudio del cáncer de pulmón han utilizado (250 K) para describir CNVs, como 5p15.33, 7p11.2, 14q13.3 y 17q12, así como microdeleciones en 5q11.2, 7q11.22 y 9p23 [10]. Algunos de estos CNV, tales como ganancias en 14q13.3 que contienen el
NKX2-8
[11] y
NKX2-1
genes [10], han demostrado ser funcionalmente implicados en el crecimiento , la supervivencia y la actividad tumorigénico en NSCLC [10], [11]. Los aumentos en la CNV en los 5p13.2 locus se han propuesto como un nuevo marcador molecular de pre-invasión precoz [12]. Además, una firma genética de la sobreexpresión de ARNm de 7q11.23, 14q23.2 y 17q21.2 (
STX1A
,
HIF1A
y
CCR7
, respectivamente) ha sido identificado como una firma la progresión del pronóstico predictivo durante las etapas clínicas iniciales de pacientes con NSCLC [13].
mal pronóstico se han asociado con el locus 7p, que puede ser debido, en parte, al aumento de la CNV y la sobreexpresión de oncogenes potenciales en 7p15.3-11.2, que han sido descritos en el 56% de las líneas celulares de cáncer [14]. Asimismo, las utilidades en 7p12-21 se han identificado en casi el 50% de los pacientes con CPNM con enfermedad metastásica [15], que pueden representar uno de los modelos de evolución del cariotipo de NSCLC en base a las ganancias del cromosoma 7 [16]. Por otra parte, las aberraciones epigenéticas, como la hipermetilación del ADN en 7p15.2 [17], pueden representar mecanismos pertinentes de regulación y /o marcadores, no sólo para la biología del cáncer de pulmón [16], sino también para la progresión de NSCLC, debido a su presencia durante la temprana [ ,,,0],17] y las etapas clínicas tardías [10], [11], [15]. Sin embargo, hasta la fecha, las relaciones moleculares entre las VNC alta frecuencia, las aberraciones epigenéticas, pronóstico del paciente oncológico y el fracaso en el CPNM aún no se han investigado a fondo.
En el presente estudio, hemos intentado correlacionar los posibles modificaciones epigenéticas con el patrón de ADN copia cambios de número de NSCLC mediante el uso de alta resolución de suelo de baldosas arrays de SNP (500 K). Se identificaron las amplificaciones en 7p22.3-p22.1, 7p21.3-p21.1 y p15.2 7p15.3-regiones citogenéticas en el rango de 66-51% de los casos. Estas amplificaciones dieron como resultado la sobreexpresión
MEOX2
,
HDAC9
,
TWIST1
y
Ahr
a pesar de los pequeños aumento de los niveles de metilación del ADN. Sin embargo, el enriquecimiento significativamente inferior de la represiva marcador de histona H3K27me3 y el aumento significativamente la activación de H3K4me3 tanto en el
MEOX2
y
TWIST1
regiones promotoras se correlacionaron con los pronósticos clínicos pobres. Por lo tanto, como hemos demostrado en modelos de líneas celulares de NSCLC, la quimio-resistencia cisplatino se correlaciona con una expresión excesiva de
MEOX2
y
TWIST1
genes, debido principalmente a la pérdida de las histonas marcas represivas H3K27me3. Nuestros resultados sugieren que los mecanismos epigenéticos exceden aberraciones genéticas (CNV) en 7p21 y los complementan, contribuyendo así a la agresividad y el fracaso de la terapia oncológica en pacientes con CPNM.
Materiales y Métodos Selección
Ejemplo
Un total de 55 tumores de pulmón (LT), 15 tejidos adyacentes no implicados pulmonares emparejado (LNAT) y 20 lesiones precursoras de pulmón (LP) de fresco congelado (FF) y fijado en formol e incluidas en parafina (FFPE) tejidos métodos de procesamiento, se recogieron del Servicio de Cirugía Torácica y Servicio de Patología del Instituto Nacional de Enfermedades respiratorias (INER). Además, las líneas celulares de NSCLC SK-MES-1, A-549, A-427, se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) y INER-37, INER-51 se obtuvieron a partir mestiza mexicana pacientes, como se informó anteriormente [18], [19].
Declaración de Ética
la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Instituto Nacional de Enfermedades respiratorias (INER) aprobó los protocolos con B17 registro -07 y B09-08, y de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), FES-Iztacala, Unidad de Investigación Biomédica revisado y aprobado los protocolos para estos estudios de genética y biología molecular. El consentimiento informado se obtuvo de los pacientes con diagnóstico de LT y sometidos a procedimientos quirúrgicos. Todos los sujetos firmaron el consentimiento informado escrito para estos estudios de investigación al servicio de cirugía torácica, INER, y se autorizó el almacenamiento de sus muestras biológicas en el INER y la UNAM repositorios para este y futuros estudios. En este estudio no se recogieron muestras de los menores /niños, adultos jóvenes sólo se incluyeron más de 18 años.
SNP cartografía de matriz 500 K de hibridación y la bioinformática análisis
Un total de 30 LNAT, LT, la línea celular de muestras de ADN LP y NSCLC fueron incluidos en la plataforma de la gama de hibridación (SNP 500 K) y en algunos casos por SNP 6,0 matrices, de acuerdo con las instrucciones recomendadas por el fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.), y se analizaron usando el método descrito previamente [20] mediante la comparación de 300 donantes sanos humanos de la población mestiza mexicana base de datos de haplotipos Mapa describió anteriormente [21]. Se importaron los datos de Affymetrix SNP (Affymetrix Console versión 4.1.3), normalizado y se identificaron los aumentos de la CNV mediante programas predeterminados Partek Genómica Suite y Partek Genoma Ver herramientas (Partek, Saint Louis, MI, USA), cuando el promedio de 20 SNP superó una relación del número de copias de 2,5 o era inferior a 1,5 (
FDR
≤0.02). predicción de vía análisis de los genes con los cambios de número de copias en nuestras muestras de NSCLC (Archivo S1) se realizaron utilizando el programa del sistema Ingenio software (versión 7.0). La lista de genes aberrantes incluidos en nuestra predicción vía celular análisis, fueron seleccionados en base a la disponibilidad de los perfiles de expresión en los tejidos pulmonares humanos y tejidos de carcinoma de pulmón, utilizando los datos de navegación EntrezGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /gen) y el navegador GeneCards Human gene base de datos (http://www.genecards.org/). SNP serie de datos incluidos en el presente estudio fueron presentados y aprobados por el Omnibus (GEO) de bases de datos de expresión génica con el número oficial GEO:. GSE62407
inmunohistoquímicos ensayos en muestras histológicas
Se realizaron análisis inmunohistoquímicos en LNAT, muestras de tejido LT y PT se fijaron con formaldehído al 10% o II Método esperanza I /reactiva (Diagnostik-sistema innovador, Alemania), y, posteriormente, de 1-2 microgramos de anticuerpos específicos anti-MEOX2, anti-TWIST1, anti-HDAC9 y anti-Evx1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EE.UU.), por incubación en una cámara de humedad y, además, de la reacción antígeno-específica con el sistema de peroxidasa /diamino-bencidina avidina-biotina (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU. ). Un dispositivo de Sistema de Ventana (Roche, Tucson, Arizona, EE.UU.) y un estudio de microscopía de luz transmitida (Leica, Bannockburn, IL, EE.UU.), se utilizaron para obtener microfotografías a 40X y 80X de aumento.
Real-Time PCR expresión de ARNm y ADN cuantificación Ensayos
para los análisis de la expresión de mRNA, cDNA fue sintetizado a partir de 2 g de ARN total usando el kit de alta capacidad (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). ADNc y ADN genómico también se amplificaron utilizando los ensayos de SYBR Green qPCR y conjuntos de oligonucleótidos diseñados por Primer Design y /o programas de software Vector NT, y sintetizados por Sigma-Genosys (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), que se describe para el ARNm ensayos de expresión en el cuadro S1, y para el análisis de secuencias de ADN del promotor en la Tabla S2.
cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR) se realizó en un Paso Uno Plus y 7500 dispositivo (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City , CA, EE.UU.), y en un sistema LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Alemania), utilizando la energía SYBR Green (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) y máxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific , Fermentas, Ciencias de la vida, Foster City, CA,).
Condiciones para la reacción de PCR cuantitativa relativa usando Fermentas SYBR Green ha sido el siguiente, un ciclo de 50 ° C durante 2 min, un ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 30 s, y etapa de extensión adicional a 60 ° C durante 30 s. Mientras que para Applied Biosystems energía SYBR Green fueron las siguientes: un ciclo de 50 ° C durante 2 min, un ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s. Al final de la reacción de PCR, las muestras se sometieron a un análisis de fusión para confirmar la especificidad de la amplificación, y el gen de β-actina se utilizó como el servicio de limpieza para el análisis de la normalización.
Ensayos de enzimas de restricción sensibles a la metilación
estado de metilación de ADN genómico (200 ng) que se deriva de LNAT, LT y LP tejidos y las líneas celulares de cáncer de pulmón se examinó utilizando 0,5 unidades de cada una de una combinación de enzimas de restricción sensibles a la metilación
HpaII
,
HpyCH4IV
y /o
AciI gratis (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.) e incubando a 37 ° C, durante 4 horas. Seguido por ensayos de amplificación de PCR sensibles a la metilación utilizando conjuntos de oligonucleótidos (Tabla S2), diseñados en el interior de las islas CpG predichos de los genes diana del promotor (
MEOX2
,
HDAC9, TWIST1
, y
Ahr
), siguiendo criterios como el tamaño de la isla & gt; 100, y GC Porcentaje & gt;. 50.0, utilizando MethPrimer para encerrar el mayor número de sitios de restricción para alcanzar las enzimas sensibles al estado de metilación, dentro del amplicón y se indica en el cuadro S3
los ensayos de PCR sensible a la metilación
el estado de metilación (%) se calculó sobre la base de ensayos de PCR metilación sensible, mediante el uso de series de oligonucleótidos que contienen sitios CpG en el interior de la amplificación de los genes diana de promotor estudiados (
MEOX2
,
HDAC9, TWIST1
, y
Ahr
) describieron en el cuadro S3. Brevemente, 50 ng de ADN digeridos se utiliza como entrada en 25 l de reacción total de PCR, y tamaños de los productos analizados, de acuerdo con la Tabla S3, sigue las siguientes condiciones de PCR: un ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55ºC durante 30 s y 72 ° C 45 s.
Además, las líneas celulares (CPNM) pulmón humano a-427 y INER-37 fueron utilizados para estandarizar las condiciones de restricción enzimática, desarrollo
in vitro
ensayos de metilación CpG utilizando metil-transferasa (M.SssI) y S-adenosil metionina (SAM), incubando a 37 ° C durante 4 h. ADN metilado estándar y ADN de esperma humano extraído de donantes sanos se utilizaron como controles de ADN hiper-metilados y hipo-metilado para ensayos de restricción enzimáticas.
In Vitro
metilación del ADN y la histona Modificación Ensayos de inhibición
El 37 INER líneas de NSCLC humanos (adenocarcinoma) de células (5 x 10
5 células) fueron tratados
in vitro Chat con 5'-aza-desoxicitidina [4 micras, a-427 y ], para inhibir
de novo
la metilación del ADN en la secuencia de promotores y /o con TSA [300 nM], para inhibir la actividad de histona desacetilasas (HDACs) durante 48 h.
inmunoprecipitación de cromatina (chIP)
Fresh LT congelado (3 mm
3) se pulverizaron bajo congelación de nitrógeno líquido y se fijaron con formaldehído al 1% durante 10 min, e inmediatamente se neutralizó con 0,125 M de glicina durante 5 min. las células resultantes se lavaron con 1% PBS, y se lisaron con el tampón de lisis (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, NaCl 140 mM, 1 mM EDTA pH 8, Triton X-100 1%, 0,1% desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS) que contiene inhibidor de la proteasa
Completo Mini
1 comprimido en 10 ml (Roche, Indianapolis, IN, EE.UU.).
La cromatina de las muestras se sometió a ultrasonidos utilizando LT 10 pulsos de 20 segundos W /U de 60 vatios. 10 g de la cromatina se inmunoprecipitó (ChIP) utilizando el kit comercial EZ-Magna ChIP G (Millipore, Temecula, CA, EE.UU.), y utilizando 2,5 g de anti-H3K27Ac, anti-H3K4me3, anti-H3K27me3, anti-H3K9me3 y anti ARN-Pol II anticuerpos activados (Abcam, Cambridge Science Park, Cambridge, Reino Unido). 1 g de anti-IgG de ratón se utilizó como control negativo para la viruta (Millipore, Temecula, CA, EE.UU.). La integridad y la calidad de las secuencias promotoras de ADN precipitado-Immuno (IP-DNA) fueron evaluados por PCR producto de amplificación de 166 pb para la secuencia promotora de la GADPH gen como se recomienda por el proveedor (Millipore, Temecula, CA, EE.UU.).
IP-amplificación de ADN y el chip análisis cuantitativo mediante qPCR ensayos
ADN inmunoprecipitado (IP-ADN) 20 ng se amplificó linealmente utilizando la amplificación del genoma entero (WGA1) Kit (Sigma, St. Louis, MO , EE.UU.), y después de eso se purificó mediante columnas MiniElute (Qiagen, Hilden Renania-Westfalia, Alemania).
El IP-ADN obtenido a partir de ambas muestras y líneas celulares LT LT fueron analizados por qPCR cuantificación absoluta utilizando LightCycler Sistema 480 (Roche, Mannheim, Alemania), y SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Fermentas Life Science, Foster City, CA, EE.UU.) y oligonucleótidos conjuntos para los objetivos y controles (Tabla S2).
IP-ADN 20 ng fueron utilizados por reacción, se han desarrollado asimismo la amplificación de las curvas de calibración, a través de diluciones seriadas de ADN nativo a partir de células mononucleares de sangre periférica de donantes sanos (100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng y 0,01 ng), y el uso de objetivos secuencias de oligonucleótidos (Tabla S2), y los controles de secuencia de oligonucleótidos como promotor c-fos tomado del Sistema kit Ampliar inmunoprecipitación de cromatina (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.).
Ensayos de citotoxicidad celular
análisis viabilidad celular se realizaron en placas de 96 pocillos usando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfo-fenil) 2H-tetrazolio (MTS ) (Promega, Madison, WI, EE.UU.) en ausencia o presencia del cisplatino drogas oncológicas. Para ello, las placas de 96 pocillos se sembraron con 3000 a 5000 células en 200 l de medio RPMI-1640 para 48 h y, posteriormente, se incubaron con 10 l de MTS [5 mg /ml] durante 3 h, para más tarde la lectura en 550 nm y /o 570 nm, utilizando la fórmula: viabilidad celular = (OD de la muestra /DO del control) x 100. Del mismo modo, las curvas de resistencia a fármacos se desarrollaron de una manera dependiente de la dosis-respuesta utilizando diluciones seriadas del cisplatino medicamento contra el cáncer.
El silenciamiento genético (siRNA transfección ensayos)
Utilizamos pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) dirigido contra
MEOX2 gratis (sc-106233),
TWIST1 gratis (SC-38604) y no humanos relacionados con el ARNm como control negativo (sc-37007 y SC-44230) todos obtenidos de Santa Cruz de Biotecnología (Dallas, Texas, EE.UU.). Brevemente, los cultivos celulares con 3% de FCS libres de antibióticos se incubaron en placas de 96 pocillos durante 12 horas y después se transfectaron con ARNi Reactivo, Lipofectamina (Life Technologies Corporation, Invitrogen, Foster City, CA, EE.UU.) y siRNAs a 50 nM, en un volumen total de 100 l.
Western Blot
las proteínas se extrajeron y se purificó por el método de Trizol (Invitrogen), se suspendió en SDS 5% con inhibidores de proteasa (completo mini, Roche, Indianapolis, IN, EE.UU.), y se cuantificó por el método de Lowry. Las proteínas totales (30 g) se sometieron a electroforesis vertical en geles de acrilamida al 12%, y luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa usando un equipo Trans-Blot-Turbo /sistema de transferencia (BioRad, Hercules, CA, EE.UU.). Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C, el bloqueo con leche baja en grasa al 5% en PBS 1X /Tween 20 al 0,1%, y se incubaron 2 hr con anticuerpos (MEOX2) 1:1500, (TWIST1) 1:1500, (β-actina) 1 :3000, o (GAPDH) 1:3000 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EE.UU.). Las membranas se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo secundario (anti-ratón HRP /anti-conejo HRP) 1:10000, a temperatura ambiente y reveló con Luminol 1 min a temperatura ambiente usando el escáner C-Digit (Li-Cor, Lincon, Nebraska, EE.UU. ) y Hypercassette y Películas (Amersham, Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra).
análisis estadísticos
la prueba exacta de Fisher,
t
pruebas estadísticas Mann Whitney-U-test y eran utilizado para analizar las diferencias entre los grupos de pacientes,
p
valora ≤0.05 se consideraron estadísticamente significativos. También utilizamos Log-Rank (Mantel Cox) y pruebas curva de supervivencia Gehan-Breslow-Wilcoxon. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software estadístico SPSS para Mac OS X (versión 11.0) y GraphPad (versión 5.0).
Resultados
cromosómico Microaberrations y aumento de las variaciones del número de copia (CNV) con alto las frecuencias en 7p22-21 y 7p15 en los pacientes con cáncer de pulmón
con el fin de identificar los microaberrations genéticas más frecuentes con sus probables perfiles de expresión genética y aberraciones epigenéticas en pacientes con cáncer de pulmón, LNAT-, LP, LT y NSCLC de células derivado de la línea de muestras de ADN (n = 30) se sometieron a ensayos de hibridación genómica en SNP 500 K microarrays. El análisis bioinformática segmental permitió la identificación de aberraciones cromosómicas y aumentó CNVs en las muestras derivadas de la LT, que no se observaron en los tejidos emparejados derivados de LNAT. aberraciones cromosómicas típicas en el cáncer de pulmón incluyendo 3p supresiones; amplificación de múltiples regiones en los cromosomas 5, 12, 14, 16, 18, 19 y 20; y la amplificación /eliminación de varias regiones del cromosoma 8 se identificaron (Figura 1A).
análisis focal de todo el genoma y el cromosoma 7. (A) Una amplificación de todo el genoma y un análisis de la bioinformática segmentaria de tres cáncer de pulmón los pacientes se llevó a cabo utilizando emparejado, el tejido adyacente histológicamente no participan de pulmón (LNAT) y carcinomas de pulmón (LT). (B) Todo el genoma y el análisis focales de pulmón normal, las lesiones precursoras de pulmón y carcinomas de pulmón (18-14 de 27 lesiones pulmonares con alta CNV). (C) Un análisis focal del cromosoma 7 reveló una alta frecuencia de la CNV en la región 7p21 (flecha) en las lesiones pulmonares precursoras y los carcinomas de pulmón.
Una alta frecuencia de la CNV mediante genómica focal análisis en 7p22. 3-p22.1, se detectaron 7p21.3-p21.1 y 7p15.3-p15.2 (Figura 1B). En particular, se observó amplificaciones de ADN en el locus 7p21.1 en las muestras de LT y derivados de LP en casi 55% de los casos (15/27 lesiones pulmonares), incluyendo 3 de 4 lesiones precursoras (Figura 1C y Figura S1), que no se observaron en las muestras derivadas de LNAT (Figura 1C).
Además, se confirmó aumentos en la CNV en el locus 7p tanto en las muestras de LP-y derivados de LT que utilizan la plataforma SNP 6,0 (Figura S2 ). Los 39 genes con las mayores tasas de cambio en la CNV se muestran en la Tabla S4. Estos cambios fueron localizados en las regiones citogenéticas 7p22.3-p22.1 y p21.1-7p21.3, y que incluyen
ZNF12
,
RPA3
,
MEOX2
,
BZW2
,
TSPAN13
,
AGR2
,
AGR3
,
Ahr
,
TWIST1
y
HDAC9
. Los cambios en la
TWISTN
,
hnRNPA2
,
CBX3
, el
HOXA
clúster y
Evx1
, que se encuentra en 7p15. 3-p15.2, también fueron identificados (Tabla S4).
Hemos detectado un total de 1.376 genes con el número de copias cambios en nuestras muestras de cáncer de pulmón humano (archivo S1). De estos genes, 809 genes fueron amplificados a una frecuencia de 37 a 66% en el cromosoma 7.
Sobre la base de este análisis, encontramos un enriquecimiento de genes implicados en varias vías de señalización celular, en particular el control del ciclo celular, movimiento celular , la muerte celular y redes de desarrollo de embriones (datos no mostrados), algunos de ellos enumeran en la Tabla S4, lo que sugiere que las aberraciones genéticas y /o epigenéticos están jugando un papel importante funcional en la biología del cáncer de pulmón.
el aumento de la CNV en 7p21 y 7p15 se correlaciona con el ARNm y la sobreexpresión de la proteína y no con la metilación del ADN en el cáncer de pulmón
se analizó la correlación entre el aumento de la CNV y los niveles de expresión de ARNm relativos, así como el impacto de la metilación del ADN en los perfiles de expresión de ARNm en carcinomas pulmonares. El uso de ensayos QRT-PCR, se observa que sólo
MEOX2
,
HDAC9
y
TWIST1 gratis (Figura 2A), así como
Ahr
y
Evx1
genes (Figura S3A-B) estaban sobreexpresados y se correlacionó positivamente con la CNV-alta contexto (Figura 1B y C, y la Figura S1), en comparación con otros genes en 7p21 (no mostrados). La expresión de estos genes fue significativamente mayor en las muestras de LT derivada de que en las muestras derivadas de LNAT (
p
≤0.05). Además, los niveles de proteína nuclear de
MEOX2
,
HDAC9
y
TWIST1
fueron aumentado de manera constante en las muestras derivadas-LT (Figura 2B), así como
MEOX2
y
TWIST1
niveles de proteína /abundancia en líneas celulares de cáncer (Figura S4A-C), mientras que la expresión de estas proteínas en el parénquima pulmonar adyacente al y las muestras derivadas de LNAT no se incrementó (Figura 2B ), como se detectó mediante inmunohistoquímica. Un aumento en
se detectó Evx1
expresión en las membranas de las muestras derivadas LT-LP- y y las líneas celulares de cáncer (Figura S5A-B).
(A)
MEOX2
,
HDAC9
y
TWIST1
la expresión del ARNm. Las barras de error representan el 95% de intervalo de confianza de la media. (B) Expresión de proteínas en tejido no involucrado pulmón adyacente (LNAT), las lesiones precursoras de pulmón (LP) y los carcinomas de pulmón (LT) (microfotografías en 200X y 400X), así como fijado en formalina y embebido en parafina (FFPE) y (FF) tejidos frescos congelados, se compararon. análisis de la secuencia de metilación (C) Promotor. Las diferencias fueron estadísticamente significativas con respecto a la LNAT y se detectaron utilizando la prueba exacta de Fisher, no apareado
t
una prueba de Mann-Whitney U-test y, *
p
≤0.05; **
p
≤0.005; ***
p
≤0.001. Las barras de error indican que el máximo rango minutos con intervalo de confianza del 95%, y los diagramas de cajas representan desviaciones estándar de la media.
Para estudiar más a fondo el efecto sobre la expresión génica de los genes asociados a la CNV, la participación de epigenética se evaluaron los cambios, en particular la metilación del ADN. Los ensayos enzimáticos de restricción sensibles a la metilación reveló pequeñas diferencias en el porcentaje de metilación del ADN entre las muestras derivadas LT-LNAT- y en las secuencias promotoras de
MEOX2
,
HDAC9
y
TWIST1
(Figura 2C), lo que sugiere una falta de correlación entre la expresión de ARNm y la metilación del ADN (Figura 2A y 2C). Además, hemos identificado una reducción en la metilación del ADN para
MEOX2
,
HDAC9
y
TWIST1 gratis (
p
≤0.005 y
p
≤0.001, respectivamente), en las muestras derivadas de LP que no se observaron en los LNAT- y derivados de LT muestras (Figura 2C).
Como complemento, un análisis pareado entre el LNAT- y LT -derivado muestras en algunos pacientes CNV-libres también reveló una sobreexpresión de ARNm de
MEOX2
,
HDAC9
, y
TWIST1
, lo que sugiere una falta de genética (CNV) y la epigenética (metilación del ADN) de correlación (Figura S6A-C), y la falta de correlación genética-epigenética en pacientes CNV-alta (Figura S7A-C); con excepción de la
Ahr
de genes entre LNAT- y LT-muestras (Figura S3 A, S3C), y entre los pacientes CNV-libres y CNV-alto (S6D y S7D). En resumen, nuestros datos sugieren que la metilación del ADN no es el principal responsable de los patrones de expresión observados en la región 7p21 citogenético en los carcinomas pulmonares, como el NSCLC.
Las disminuciones del Código de histona H3K27me3 y aumentos en H3K4me3 son asociado con
MEOX2
y
TWIST1
la sobreexpresión y correlacionaron con un pronóstico clínico pobre en CPNM
por lo tanto, nos preguntamos si otras modificaciones epigenéticas podrían participar en la regulación de los genes afectados, centrándose en la región 7p21 citogenética en el CPNM.
por esto, según un estudio de validación completamente independiente, el papel de las modificaciones de las histonas en la sobreexpresión de
MEOX2
y
Hoteles en TWIST1 se evaluó pacientes con CPNM. Para este análisis se estudió un grupo adicional de pacientes que habían sido sometidos a un seguimiento clínico para determinar si
MEOX2
y
TWIST1
sobreexpresión en el tejido tumoral se asoció con los niveles de H3K27me3
vs.
H3K27Ac y H3K4me3 y podría determinar el pronóstico y /o la capacidad de respuesta al tratamiento oncológico en pacientes con CPNM.
Un análisis pareado entre las muestras derivadas LT-LNAT- y, en asociación con
MEOX2
y
TWIST1
sobreexpresión (Figura 3A-B), revelaron una reducción en H3K27me3 (Figura 3C-D). Aquellos pacientes con bajos niveles de enriquecimiento de la histona represiva H3K27me3 y alta
MEOX2
y
TWIST1
expresión de ARNm (Figura 3A-D) muestra bajas tasas de supervivencia, con una media de 6,2 meses (DSE, RSCL, MGGR, GOMJ y GCH pacientes), mientras que los pacientes con niveles de enriquecimiento H3K27me3 más altos y bajos
MEOX2
y
TWIST1
expresión de ARNm (Figura) D-3A muestran mejores índices de supervivencia, con un promedio de 53,4 meses (pacientes GMRM, AEE, SPN, GHM y PMA, con
p
≤0.0027) (Figura 3E, Tabla 1).
(A)
MEOX2
expresión en el CPNM y las muestras derivadas de LNAT, y (B)
TWIST1
expresión en NSCLC y las muestras derivadas de LNAT. Las barras de error representan los errores estándar de la media de tres repeticiones. perfil de enriquecimiento (C) la modificación de histonas de la
MEOX2
secuencia promotora. perfil de enriquecimiento (D) la modificación de histonas de la
TWIST1
secuencia promotora. Los diagramas de caja representan la media de tres repeticiones. El análisis reveló una correlación entre la expresión de ARNm de baja y enriquecimiento H3K27me3. curva (E) Los análisis de supervivencia basada en Log-Rank (Mantel Cox) y las pruebas de Gehan-Wilcoxon-Breslow del índice relativo de expresión
MEOX2
más
TWIST1 gratis (
p
≤0.0027).
Además, el aumento de los niveles significativamente (
p
≤0.008) del marcador de la histona represiva H3K27me3 tanto en el
MEOX2 Opiniones y
TWIST1
secuencias promotoras fueron confirmados para aquellos pacientes con mayores tasas de supervivencia (Figura 4A-B). Sin embargo, no se observaron cambios significativos en los niveles H3K27Ac (Figura 4C-D). Por el contrario, se detectaron niveles reducidos de los H3K4me3 marcador de activación, tanto en el
MEOX2 gratis (
p
≤0.028) y
TWIST1 gratis (
p ≤
0,0006) secuencias de promotor en el grupo de alto supervivencia de pacientes (Figura 4E-F) y se correlacionaron con respuesta parcial al tratamiento adyuvante cisplatino o carboplatino, como la quimioterapia de primera línea en pacientes con CPNM (Tabla 1).
(a ) el enriquecimiento H3K27me3 en el
MEOX2
secuencia promotora (** prueba de Mann-Whitney,
p
≤0.01, y la prueba F,
p
≤0.0003) y (B ) el enriquecimiento H3K27me3 en el
TWIST1
secuencia promotora de supervivencia en pacientes de alto en comparación con los pacientes con mal pronóstico (*** prueba de Mann-Whitney,
p
≤0.01, y la prueba t no pareada ,
p
≤0.02). enriquecimiento (C) H3K27ac en la secuencia del promotor de
MEOX2 gratis (no hay cambios significativos) y (D) el enriquecimiento H3K27ac en la secuencia del promotor de
TWIST1
en pacientes de alto supervivencia en comparación con los pacientes con mal pronóstico (sin cambios significativos). (E) H3K4me3 enriquecimiento en el
MEOX2
secuencia promotora (* prueba F,
p
≤0.02) y (F) el
TWIST1
secuencia promotora en pacientes de alto supervivencia en comparación a los pacientes con peor pronóstico (*** prueba F,
p
≤0.0006). Las barras de error representan la media con la estufa.
Estos hallazgos sugieren que la disminución de los niveles del marcador de la histona H3K27me3 y aumento de los niveles de H3K4me3 se correlacionan con
MEOX2
y
TWIST1
sobreexpresión, probablemente asociado con el pronóstico de la respuesta clínica en pacientes con CPNM (Tabla 1), o que participan en la adquisición de la quimio-resistencia.
Disminución de los niveles de H3K27me3 y aumento de los niveles de plomo H3K4me3 a Cisplatinum fallo en un
MEOX2 <