Extracto
Los estudios han sugerido una posible correlación entre la ubiquitina E3 recientemente identificados proteína ligasa anillo de dedo 146 (RNF146) y el desarrollo de tumores. Sin embargo, hasta ahora, los estudios sobre RNF146 se han limitado a la poli (ADP-ribosil) ación y ubiquitina ligadura, mientras que el papel de RNF146 en la biología del tumor rara vez ha sido reportado. En el presente estudio, se investigó el papel de RNF146 en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Los resultados mostraron que la expresión de RNF146 se aumentó en las muestras de cáncer de pulmón clínicas y líneas celulares. RNF146 expresión correlacionada con el tamaño del tumor, el nivel de diferenciación, metástasis linfática, pTNM puesta en escena, y el pronóstico de los pacientes en estadio I. expresión RNF146 se correlacionó negativamente con la expresión Axin pero correlacionada positivamente con la expresión nuclear de β-catenina en los tejidos de NSCLC. RNF146 downregulated la expresión de axina en líneas celulares de cáncer de pulmón y se indujo la expresión y distribución nuclear de β-catenina. La sobreexpresión de RNF146 en líneas celulares de cáncer aumenta los niveles de cyclinD1, ciclina, y CDK4, promovido ciclo celular G
0 /G
1-S transiciones, y la proliferación celular regulada. La sobreexpresión de RNF146 condujo a niveles upregulated de metaloproteinasas de la matriz 2 y 7 y una mayor invasividad de las células del cáncer de pulmón, eventos que fueron mediadas por la vía de señalización /β-catenina clásica Wnt. En resumen, los datos del presente estudio indican que RNF146 regula el desarrollo y progresión de NSCLC mediante el aumento de crecimiento celular, la invasión, y la supervivencia, lo que sugiere que RNF146 puede ser un objetivo potencial tratamiento en el CPNM
Visto:. Gao Y, Song C, L Hui, Li Cy, Wang J, Tian Y, et al. (2014) La sobreexpresión de
RNF146 Hoteles en células no pequeñas de cáncer de pulmón aumenta la proliferación e invasión de tumores a través de la Wnt /β-catenina vía de señalización. PLoS ONE 9 (1): e85377. doi: 10.1371 /journal.pone.0085377
Editor: Tania V. Kalin, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 5 Septiembre, 2013; Aceptado: November 26, 2013; Publicado: 14 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Gao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias de China (Nº 30972967 y 30973502), Fondo de Investigación Especializada para el programa de Doctorado de Educación Superior (Nº 20092104110018), programa de Liaoning talentos excelentes en la Universidad y Liaoning Provincial de Ciencia y programa de plan de tecnología (No. 2012225072). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ligasas E3 ubiquitina juegan un papel importante en la regulación de las funciones celulares incluyendo la proliferación, la detención del ciclo celular y la apoptosis. También pueden tener funciones adicionales que dependen de la identidad de sus sustratos. Por ejemplo, si una ubiquitina ligasa E3 se dirige a un oncogén de la degradación, puede ser considerado como un supresor de tumores. Del mismo modo, si un E3 ligasa uniquitin degrada una proteína supresora de tumores, se puede considerar un oncogén. Muchas proteínas que contienen dominios dedo anular poseen actividad de ubiquitina ligasa, algunas de las cuales participan en la tumorigénesis y metástasis tumoral. La proteína recientemente identificada E3 ubiquitina ligasa anillo de dedo 146 (RNF146) interactúa con poli (ADP-ribosa) (PAR) a través de un motivo de unión a PAR-en el dominio Trp-Trp-Glu (WWE). El
RNF146
gen se localiza en el cromosoma humano 6q22, de 33 años [1]. RNF146 tiene actividad neuroprotectora debido a su inhibición de la Parthanatos través de la unión con PAR [2]. RNF146 puede facilitar la reparación del ADN contra la muerte celular inducida por agentes que dañan el ADN o γ-irradiación [3]. En respuesta al daño celular, RNF146 se transloca al núcleo y mejora la ubiquitinación y la degradación de diversos nucleoproteínas que participan en la reparación del daño en el ADN. Además, como un poli (ADP-ribosil) ación (PARsylation) -dirigida E3 ubiquitina ligasa, RNF146 regula la degradación tankirasa dependiente de Axin y positivamente regula la vía de señalización Wnt [1].
La señalización Wnt vía es altamente activo en células de cáncer de pulmón, que conduce a la metástasis y proliferación de estas células [4]. la señalización de Wnt aberrante puede ser activado por diversos mecanismos, y una función principal es la de inhibir la proteólisis de β-catenina, que es controlada por la fosforilación [5]. Libre de β-catenina puede entrar en el núcleo y activar los genes diana de Wnt. estado de los niveles de Axin son muy importantes, ya que esta proteína andamio inicia la formación del complejo de la degradación de β-catenina. Los investigadores han demostrado que la transferencia de PAR a los residuos de Axin catalizada por tankirasa conduce a la PARsylation de Axin [1], [6]. RNF146 participa en la degradación de PARsylated Axin a través de su motivo de unión a PAR-. Esta interacción conduce a la destrucción del complejo de degradación de β-catenina, la agregación de intracelular β-catenina, y el aumento de la señalización a través de la vía Wnt [1].
A pesar de muchos estudios sobre RNF146, su papel exacto en la tumorigénesis sigue siendo poco clara . En el presente estudio, se investigaron los papeles de RNF146 en el cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Muestras de Tejido de NSCLC
muestras de NSCLC primaria y tejidos de control fueron recogidos de 133 pacientes . muestras pulmonares normales se tomaron a partir de tejido pulmonar de más de 5 cm de la zona de resección del cáncer. Los procedimientos se llevaron a cabo en la Cuarta Hospital Afiliado de la Universidad Médica de China. Los pacientes no recibieron ningún tipo de radiación o quimioterapia antes de la operación. CPNM puesta en escena se basa en la Clasificación TNM de tumores malignos, séptima edición [7]. El tiempo de supervivencia se calculó a partir del día de la operación hasta la muerte a través de la evaluación de la recidiva y metástasis o hasta la última fecha de seguimiento. especímenes frescos se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. Para los experimentos con tejidos humanos, se obtuvo la aprobación del comité de revisión institucional de la Universidad de Medicina China. consentimiento informado por escrito se proporciona de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
Los anticuerpos y reactivos
El anticuerpo policlonal de conejo RNF146 anti-humano fue adquirido de Abcam (Cambridge Science Park). Anti-Axin y anticuerpos anti-β-catenina se compraron de BD Transducción Laboratories (San Jose, CA, EE.UU.). Los anticuerpos anti-ciclina A, anti-ciclina B, anti-cyclinD1, y anti-pRB eran de Cell Signaling Technology, Inc. (Boston, MA, EE.UU.). Anti-CDK4, anti-CDK6, anti-TIMP-1, anti-ciclina, siAxin, siβ-catenina, y siTCF4 eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra RhoA, RhoB, RhoC, y Rock1 eran de Proteintech (Chicago, IL 60612, EE.UU.). Los anticuerpos contra CDK2, P21, metaloproteinasa de matriz 2 (MMP2), MMP7, MMP9 y eran de NeoMarkers (Palo Alto, CA, EE.UU.). Anti-P27-P53 y anti eran de Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA, EE.UU.). Los plásmidos recombinantes sobreexpresión pEX4-hRNF146 y pGPHI-shhRNF146 y control plásmidos vacíos fueron construidas por GenePharma (Shanghai, China). El kit de inmunohistoquímica anticuerpo secundario fue adquirido de Dako (Copenhague, Dinamarca).
Líneas celulares y cultivo celular
La línea de células epiteliales bronquiales normales HBE, el adenocarcinoma de pulmón humano A549 líneas de células H1299 y eran comprado en la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Las líneas celulares de cáncer humano LK2, LH7, LTE, y SPC fueron adquiridos de la célula Banco de Shanghai de la Academia China de Ciencias. Las líneas celulares se cultivaron en Modificación de Ham F-12, Park Memorial Institute Roswell (RPMI) -1640 o medio del Águila-F12 modificado por Dulbecco con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) que contiene 100 unidades /ml de Kaighn penicilina y 100 unidades /ml de estreptomicina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) a 37 ° C con 5% de CO
2.
tinción inmunohistoquímica
secciones de parafina con un espesor de 4 m se prepararon y se tiñe inmunohistoquímicamente con Envision como se describe anteriormente [8] - [9]. especímenes de parafina fueron incubadas con anticuerpos anti-RNF146 (1:100), anti-Axin (1:200), y anti-β-catenina (1:200) a 4 ° C durante la noche. muestras incubadas con PBS se utilizaron como controles negativos.
Dos médicos de patología evaluaron los resultados de la tinción en una escala semicuantitativa. Cinco campos de gran aumento fueron seleccionados al azar de cada sección, y se contaron 100 células tumorales en cada campo para evaluar la intensidad y el alcance de la tinción RNF146. Un resultado negativo se le dio una puntuación de 0 (sin manchas), tinción de color amarillo pálido se registró como 1, amarillo fue marcado como 2, y profundo manchas marrones se registró como fueron asignados a 3. Puntuaciones Porcentaje de la siguiente manera: & lt; 5 %, 0; 5-25%, 1; 26-50%, 2; 51-75%, 3; ≥75%, 4. Dos puntuaciones independientes se multiplican entre sí para obtener el coeficiente de coloración del paciente, que se clasifica como "baja expresión" coeficiente de coloración & lt; 4 y "alta expresión" coeficiente de coloración ≥4. Axina y β-catenina se calificaron como se describe anteriormente [8] - [9].
Cell La transfección
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a aproximadamente 50% de confluencia y se transfectaron con el plásmido o siRNA 24 horas más tarde. La transfección de líneas celulares de cáncer de pulmón A549 y LTE se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para los experimentos de co-transfección, de 1 a 1,5 g de co-transfectadas o vector vacío y 45 pmol de siRNA se añadieron a la mezcla de transfección. Después de 5 horas a 37 ° C y 5% de CO
2, se añadió medio completo a la mezcla de transfección. La eficacia de transfección se determinó mediante Western blot.
RT-PCR ensayo
El ARN total fue extraído por medio de TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del kit de PCR de ARN de Takara (Takara, Dalian, China) . expresión de GAPDH sirvió como control interno. Las secuencias de los cebadores fueron: RNF146: hacia adelante: 5'-GGACGTCGCAGGAAGATTAAG-3 'y revertir: 5'-CAATGGAGGTGTCTGGTGCT-3'; Axin: hacia adelante: 5'-GACTTGCTGGACTTCTGGTT-3 'y revertir: 5'-TGTACTTTCGGTAGATGGCT-3'; ß-catenina: hacia adelante: 5'-CTAAACAGGAAGGGATGGAAG-3 'y revertir: 5'-ACAGATGGCAGGCTCAGTGAT-3'; GAPDH: hacia adelante: 5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3 'y revertir: 5'-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3'. Los productos de PCR para RNF146 (376 pb), Axin (109 pb), β-catenina (221 pb), y GAPDH (153 pb) se amplificaron con 30 ciclos de PCR.
Western Blot
Las células se lisaron en tampón que contenía NaCl 150 mM, 1% NP-40, PMSF, 0,1% de SDS, 2 mg /ml de aprotinina, y 1 mM. La proteína total se cosechó, y 60 g se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirió a fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Las proteínas en las membranas de PVDF se bloquearon con albúmina de suero bovino 5% (BSA) en solución salina tamponada con fosfato con Tween (PBST), se incubaron con anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche, y después se incubaron con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 2 horas. Las membranas se desarrollaron con el líquido químico mejorada (ECL) (Thermo Fisher Scientific), y los resultados se registraron utilizando un sistema de bioimagen (UVP Inc., Upland, CA, EE.UU.). los niveles de expresión de proteínas se evaluaron utilizando β-actina como control de carga.
tinción de inmunofluorescencia
Las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio fueron fijadas con paraformaldehído al 4% y se trataron con 0,2% Triton X-100. Después de lavar con PBS, las células se bloquearon con suero animal no inmunizado a 37 ° C durante 30 minutos, y después se incubaron con anticuerpos primarios anti-RNF146 (1:100), anti-Axin (1:100), y anti-β-catenina (1:100) a 4 ° C durante la noche. Controles positivos y negativos fueron incluidos en todos los experimentos. Las células se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con FITC o TRITC (1:100, Chemicon, EE.UU.), a 37 ° C durante 30 minutos. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con 0,1% 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Invitrogen) a 37 ° C durante 10 minutos. Las células se lavaron con PBS y se observaron con un microscopio de fluorescencia.
MTT Ensayo
Las células transfectadas y las células de control se sembraron en placas de 96 pocillos a 10
3 células por pocillo y se cultivaron durante 24 horas. La proliferación celular se detectó con la solución de recuento celular Kit-8 (Dojindo, Gaithersburg, MD) según las instrucciones del fabricante. El 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo se repitió en 4 días consecutivos. valores de densidad óptica se midió utilizando un lector de microplacas (Spectra Thermo, Männedorf, Suiza) a una absorbancia de 550 nm.
curación de heridas Ensayo
Cada pocillo de una placa de 6 pocillos se sembró con 5 × 10
5 células, cultivadas durante 24 horas, y se rascó con una punta de lanza. Las células se lavaron con PBS y se cultivaron en medio libre de suero a 37 ° C y 5% de CO
2. Las muestras se recogieron y se tomaron fotografías en 0, 6, 12 y 24 horas. Cada experimento se repitió al menos tres veces y se calcularon los valores medios.
Transwell
Las suspensiones celulares de 100 l que contenía 2,5 x 10
se añadieron 6 células /ml a la cámara superior de un inserto de transwell, y 600 l de medio que contenía suero bovino fetal al 10% se colocó en la cámara inferior. Una membrana de policarbonato microporosa con un diámetro de 8 micras separa la parte superior y las cámaras inferiores. Las células se cultivaron a 37 ° C y 5% de CO
2 durante 6 horas. Después de lavar con PBS, las células se fijaron con metanol a temperatura ambiente durante 15 minutos. Finalmente, las células tratadas se tiñeron con hematoxilina, se tomaron fotografías, y se contaron las células teñidas. Para medir la capacidad invasiva de las células, el medio sin suero previamente enfriado y Matrigel (BD Biosciences, EE.UU.) se mezclaron en una relación en volumen de 01:07 y se añadieron a la cámara superior. El volumen de la mezcla líquida era de 100 l. Se trataron las células durante 3 horas a temperatura ambiente, y los resultados se obtuvieron después de que las células se cultivaron durante 24 horas.
Ensayo de ciclo celular
Las células se sembraron a 5 x 10
6 células por placa de 6 cm de cultivo, cultivadas durante 12 horas, y transfectadas. Las células se sincronizaron por privación de suero durante 20 horas. Las células se mantuvieron en medio que contiene 10% de suero durante 24 horas. Las células se recogieron y se fijaron en etanol frío al 70%. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con 0,1 mg /ml ARNasa (Roche Indianapolis, IN) a 37 ° C durante 30 minutos y se trataron con 5 mg /ml de yoduro de propidio durante 30 minutos. Por último, las células tratadas se analizaron mediante citometría de flujo.
Análisis estadístico
Las bases de datos se creó utilizando Excel. Los datos se analizaron usando SPSS17.0. Las relaciones entre la expresión de RNF146, Axin, β-catenina, y los factores clínicos y patológicos fueron evaluados por el
χ
2
de prueba y prueba de Fisher. las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y Log-rank se utilizaron para detectar y evaluar las diferencias. Otros datos fueron comparados por
t-test
. Los datos de tres experimentos independientes se muestran como
± s
. Un
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
RNF146 sobreexpresión en el CPNM
Para investigar la expresión de RNF146 en el CPNM, 20 emparejado. NSCLC y no canceroso se recogieron muestras de tejido, y RT-PCR y Western blot se utilizaron para analizar el ARNm RNF146 y los niveles de expresión de proteínas, respectivamente. La expresión de mRNA RNF146 en las muestras de NSCLC fue mayor que la de los tejidos del pulmón no cancerosas (
P =
0,030) (Figura 1A). Los resultados de la transferencia Western y tinción inmunohistoquímica confirmaron que la expresión de proteínas RNF146 se incrementó en NSCLC (
P =
0,014,
P =
0,000) (Figura 1B), en consonancia con la RT-PCR resultados. La expresión de RNF146 también se analizó en el HBE y las líneas celulares de NSCLC. Se observaron diferentes niveles de expresión de RNF146 entre las líneas celulares de cáncer (Figura 1C). La expresión de ARNm y proteínas RNF146 tanto en el HBE y la LK2 líneas celulares (escamosas) eran bajos. La expresión de la proteína en el RNF146 LTE (adenocarcinoma) y líneas celulares LK2 (escamoso) fueron moderadas, y la expresión de la proteína RNF146 en el A549 y líneas celulares H1299 (adenocarcinoma) eran altos. Los datos indicaron que la expresión de RNF146 se aumentó en las muestras de cáncer de pulmón y líneas de células de NSCLC clínicas.
Detección de mRNA y expresión de proteínas de RNF146 en 20 muestras de NSCLC y control por RT-PCR (A) y Western blot (SEGUNDO). muestras de tumor;: T N: emparejado tejidos normales; M: marcador. (C) ARNm y la expresión de proteínas de RNF146 en la línea celular HBE y las líneas celulares de cáncer humano LK2, LH7 (cáncer epidermoide), H1299, LTE, A549 y SPC (adenocarcinoma). GAPDH y β-actina sirvieron como controles internos. (D) Expresión y distribución de RNF146 en CPNM mediante técnicas de inmunohistoquímica. D1, RNF146 no se expresa en el epitelio bronquial y alveolar normal. D2, RNF146 se expresó en el citoplasma de las células de cáncer de pulmón, y se detectó expresión RNF146 débil en el epitelio bronquial adyacente. D3 y D5 mostraron tinción débil RNF146 en el carcinoma de células escamosas bien diferenciado y adenocarcinoma. D4 y D6 mostraron una fuerte tinción RNF146 en el carcinoma de células escamosas y el adenocarcinoma pobremente diferenciado. (E) Relación entre la expresión RNF146 y el pronóstico de los pacientes con CPNM. E1 mostró correlación entre la expresión RNF146 y el pronóstico de los pacientes en estadio I (
P Hotel & lt; 0,05). E2 y E3, hay una correlación entre la expresión RNF146 y el pronóstico de la etapa II y pacientes en estadio III (
P & gt; 0,05
).
Para explorar el papel de RNF146 en CPNM adicional, la se analizaron las relaciones entre la expresión de proteínas y las características patológicas clínicas. No hubo correlación entre la expresión de RNF146 y el tamaño del tumor (
P = 0,044
), el tipo histológico (
P = 0,005
), pobre diferenciación (
P
= 0,002) , metástasis linfática (
P
= 0,009), y la etapa pTNM (
P = 0,015
). Sin embargo, la expresión RNF146 no se correlaciona con la edad o el sexo de los pacientes con CPNM (Tabla 1, Figura 1 D). Por otra parte, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier demostró que la sobreexpresión de RNF146 se correlacionó con la supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón en estadio I (
P = 0,016
). No hubo correlación entre la expresión RNF146 y el tiempo de supervivencia en todos los pacientes (
P = 0,616
) o aquellos pacientes con estadio II (
P = 0,437
), o NSCLC en estadio III (
P = 0,520
) (Figura 1E).
Expresión de RNF146, Axin y Distribución nuclear de β-catenina
a modo de ubiquitina ligasa E3, RNF146 regula la tankirasa la degradación dependiente de Axin y positivamente regula la vía de señalización Wnt [1]. Para investigar la relación entre RNF146, Axin, y β-catenina, las expresiones de Axin y β-catenina en 133 muestras de NSCLC fueron detectados por métodos inmunohistoquímicos y las correlaciones de las proteínas se calcularon. RNF146 se correlacionó negativamente con la expresión Axin (
P = 0,003
), pero no se correlaciona con la disminución de expresión de β-catenina en las membranas o el aumento de la expresión de β-catenina en el citoplasma (
P =
0,524). La expresión de alto RNF146 se correlacionó positivamente con la tinción de β-catenina nuclear (
P = 0,047
) (Tabla 2, Figura 2A).
(A) Expresión y distribución de RNF146, Axin, y β catenina en el CPNM mediante técnicas de inmunohistoquímica (x 200). expresión Axin Strong y asociada a la membrana β-catenina correlacionados con baja expresión de RNF146 en adenocarcinoma (A1). expresión Axin Low y citoplásmica y expresión nuclear de β-catenina se encontró en los cánceres escamosos con alta expresión de RNF146 (A2 y A3). Expresión y distribución de RNF146, Axin y β-catenina detectada por (B) RT-PCR, (C) de transferencia de Western, y (D) de inmunofluorescencia. Las células transfectadas con vectores vacíos sirvieron como controles.
LTE líneas celulares fueron transfectadas transitoriamente con el plásmido de sobreexpresión pEX4-RNF146 o el plásmido de control pEX4 vacía. Los experimentos confirmaron que RNF146 se upregulated. A549 y células H1299 líneas fueron transfectadas transitoriamente con RNF146-shRNA1, RNF146-shRNA2 o controlar SHNC, y los experimentos confirmaron que la expresión RNF146 se redujo (Figura 2C y la Figura S1A). Además, los niveles de expresión de axina y β-catenina se analizaron por RT-PCR, Western blot, y la inmunofluorescencia. La sobreexpresión o derribo de RNF146 no afectó a los niveles de mRNA expresión de axina y β-catenina (Figura. 2B). Sin embargo, los resultados de transferencia Western indicaron que la sobreexpresión de RNF146 en células de cáncer de pulmón LTE inhibió la expresión de la proteína de Axin y el aumento de la expresión de β-catenina (Figura. 2C). Inmunofluorescencia confirmó además que la sobreexpresión de RNF146 disminuyó la expresión citoplásmica de Axin y el aumento de la expresión de β-catenina en el citoplasma y el núcleo. Por el contrario, la reducción de expresión de RNF146 condujo a una mayor expresión de axina en el citoplasma y disminución de la expresión de β-catenina en el citoplasma y el núcleo (Figura. 2D).
Expresión de RNF146 y la proliferación de células del cáncer de pulmón
Para explorar las funciones de RNF146 en la proliferación celular, las células LTE y A549 fueron transfectadas con plásmidos, como se describe anteriormente, y la proliferación celular se detectó mediante el ensayo de MTT. En comparación con el grupo control y el grupo transfectadas con el plásmido vacío, la sobreexpresión de RNF146 mejora de forma significativa la proliferación celular en células LTE, mientras que desmontables de RNF146 inhibió la proliferación celular en A549 y células H1299 (Figura 3A y la Figura S1B). El ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo, y los resultados demostraron que la sobreexpresión de RNF146 disminuyó el porcentaje de G
0 células /G
1 LTE fase y aumentó el porcentaje de células en fase S. Por el contrario, desmontables de RNF146 en células A549 y H1299 aumentó el porcentaje de células en el G
0 /G
1 fase y la disminución del porcentaje de células en fase S (Figura 3B y la Figura S1C).
(A) ensayo de proliferación celular MTT con sobreexpresión de RNF146 y desmontables de RNF146 shRNA mediada. **
P Hotel & lt; 0,05. (B) Efectos de RNF146 sobre el ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. (C) detectar ciclo celular expresión de la proteína por Western blot.
Proteínas reguladoras relacionadas con el ciclo de
Western blot resultados también revelaron correlaciones entre los niveles de RNF146 en células de cáncer de pulmón y la expresión de células incluyendo cyclinD1, ciclina y CDK4 (Figura 3C). Los datos indicaron que RNF146 regula la expresión de cyclinD1 y ciclina y la progresión del ciclo celular regulado mediante la inducción de la G
0 /G
1-S transición.
Expresión RNF146 e invasión de células del cáncer de pulmón
la sobreexpresión y desmontables de RNF146 afectadas las capacidades de migración celular y la invasión de células de NSCLC. Curación de heridas y experimentos transwell demostraron que la sobreexpresión de RNF146 mejorado la migración celular y la invasión en las células de LTE, y que desmontables de RNF146 disminuyó la migración celular y la invasión en las células A549 (Figura 4A, B, C). Se obtuvieron resultados similares en células H1299 en el que se agotó expresión RNF146 (Figura S2, S3). Las proteínas relacionadas con la migración y la invasión también fueron detectados por Western blot. Los niveles de expresión de la MMP-2 y MMP7 se incrementaron en las células que sobreexpresan LTE RNF146, mientras que los niveles de RhoA, RhoB, RhoC, Rock1, y TIMP-1 se mantuvieron sin cambios. Además, los niveles de MMP-2 y MMP7 se redujo significativamente cuando la expresión RNF146 fue derribado (Figura 4D).
(A) Cicatrización de heridas de ensayo en células que sobreexpresan LTE RNF146 y células A549 tratadas con shRNA-1 focalización RNF146. El histograma muestra los porcentajes de células migradas en las áreas raspadas (abajo). (B-C) Análisis de la migración celular y la capacidad de invasión en el ensayo transwell. El histograma muestra el número de células migradas o invadido. (D) Western blot de la migración y las proteínas asociada a la invasión. β-actina sirvió como control interno.
Expresión RNF146 reguladas de cyclinD1 y MMP7
Hemos propuesto que la migración celular y la invasión RNF146 regulada mediante la regulación de la transcripción indirectamente diana de genes a través Axin /β-catenina señalización. Para probar esta hipótesis, hemos derribado RNF146 en las células tratadas con siRNA dirigidos Axin. Se encontró que los niveles de cyclinD1, ciclina, y MMP7 recuperaron en comparación con las células tratadas con shRNF146 solo (Figura 5A). La sobreexpresión de RNF146 en combinación con siRNA desmontables de β-catenina no causó niveles de cyclinD1, ciclina, o MMP7 a aumentar, mientras que los niveles de MMP2 todavía se aumentaron (Figura 5B). Desmontables de TCF-4 endógena en células LTE combinadas con RNF146 sobreexpresión no causó niveles de cyclinD1 y MMP7 para aumentar (Figura 5C). Sin embargo, cuando RNF146 y TCF-4 fueron derribados en las células A549 de forma simultánea, la expresión de cyclinD1 y MMP7 disminuyó más dramática (Figura 5D). Tomados en conjunto, los datos indicaron que RNF146 probablemente regula la expresión de cyclinD1 y MMP7 por la vía de señalización Wnt /β-catenina.
(A) Niveles de cyclinD1 /E y MMP2 /7 en células A549 después del tratamiento con shRNA dirigida a RNF146 y siRNA dirigido a Axin. (B) Los niveles de cyclinD1 /E y la MMP-2/7 en LTE después de la sobreexpresión de RNF146 y desmontables de β-catenina. (C y D) se detectaron niveles de cyclinD1 y MMP7 después desmontables de TCF-4 endógeno en células A549 y LTE con sobreexpresión o desmontables de RNF146.
Discusión
En el presente estudio, se encontró que RNF146 se sobreexpresa en el tejido NSCLC en comparación con tejidos pulmonares normales adyacentes. El nivel de expresión RNF146 mostró correlaciones con varios factores patológicos clínicos, incluyendo el tamaño del tumor, el nivel de diferenciación, metástasis linfática, puesta en escena pTNM, y el pronóstico de los pacientes en estadio I, que son factores importantes que representan el potencial de malignidad del cáncer de pulmón. Estos datos sugieren que la sobreexpresión de RNF146 en CPNM puede mejorar la metástasis en el cáncer de pulmón, y que RNF146 podría ser un indicador de mal pronóstico en la etapa I NSCLC.
Nuestros datos son consistentes con los hallazgos de dos informes recientes [10 ] - [11] que RNF146 podrían estar involucrados en el desarrollo de tumores. El oro
et al.
Descubrió un gen de riesgo del cáncer de mama en la población judía Ashkenazi situado en 6q 22.33 en un estudio de asociación de todo el genoma. Esta ubicación contenía dos genes,
RNF146 Opiniones y enoil CoA hidratasa dominio que contiene 1 [11]. Otro descubrimiento importante fue que RNF146 interactuó con PARsylated Axin a través de su motivo de unión a PAR, lo que lleva a la degradación Axin y la regulación positiva de la vía de señalización de Wnt. Estos resultados proporcionaron nuevas pruebas para el papel potencial de RNF146 en el desarrollo de tumores [1], [6]. Se ha indicado que los sustratos RNF146 recientemente identificados básica cremallera de leucina factor nuclear 1 (BLZF1) y la susceptibilidad al cáncer candidato 3 (CASC3) están involucrados en el desarrollo de tumores y la proliferación celular [12] - [13]. Estos informes sugieren que RNF146 podría desempeñar un papel importante en los tumores mediante la alteración de la expresión de genes o proteínas diana degradantes.
La vía de señalización Wnt afecta a la expresión génica y la migración celular. Como una molécula importante en la vía de señalización Wnt, Axin participa en la formación de la /glucógeno 3β Axin sintasa quinasa (GSK-3β) /poliposis adenomatosa coli (APC) /caseína quinasa I (CKI) complejo de degradación, lo que mejora la degradación de β catenina e inhibe la proliferación tumoral, invasión y metástasis [14] - [15]. Estudios previos han establecido que Axin juega un papel importante en NSCLC [14]. expresión Axin se ha demostrado que inhibe la proliferación e invasión de células de cáncer de pulmón [9]. estabilización citoplasmática y la acumulación de β-catenina nuclear, un transductor de señal importante, son procesos importantes en la transducción de señales Wnt.
Hemos encontrado que RNF146 se correlaciona negativamente con la expresión de axina y positivamente correlacionado con la expresión nuclear de β- catenina. La tinción inmunofluorescente demostró que RNF146 regula la distribución y la acumulación nuclear de β-catenina. Estudios previos han demostrado que la expresión de β-catenina nuclear conduce a la pérdida de la adhesión celular. Además, esta proteína aumenta la transcripción de genes diana, incluyendo c-myc, cyclinD1, VEGF, y MMP7, mediante la interacción con el factor promotor de factor de células T /linfoide, con lo que conduce a la proliferación y la metástasis de las células tumorales [16] - [ ,,,0],17]. En el presente estudio, RNF146 regulado Axin y β-catenina de la vía de señalización Wnt, lo que indica que RNF146 afectó a la proliferación y la invasión de las células tumorales.
Nuestra MTT y los experimentos del ciclo celular mostraron que no sólo RNF146 proliferación celular regulada y la progresión del ciclo celular, pero también afectó a los niveles de expresión de proteínas relacionadas con el ciclo celular. Ciclina D1 regula principalmente G
1 progresión de la fase [18], y la ciclina E mejora la G
1 /S transición [19] - [20]. Ciclina D1 podría interactuar con CDK4 /6 y aumentar la transcripción de genes aguas abajo [18]. Por lo tanto, se puede concluir que RNF146 controla la proliferación del tumor mediante la regulación del ciclo celular.
Nuestros datos también mostraron que RNF146 afectó la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón, lo que sugiere que RNF146 tiene múltiples funciones. Los resultados de la prueba de cero y de ensayo transwell mostraron que RNF146 mejorado la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón. MMP degradan diversas proteínas de la matriz extracelular, rompen las barreras de tejidos a la invasión de las células tumorales, y desempeñan un papel clave en la invasión y la metástasis de tumores [21]. Los datos del presente estudio revelaron que la MMP-2 y MMP7 estaban regulados por RNF146. La degradación de la matriz ósea y la matriz extracelular por MMP2 y MMP7 se ha demostrado que estar estrechamente relacionada con NSCLC invasión y metástasis [22] - [23]. Los datos sugieren que RNF146 podría regular la migración y la invasión de los cánceres de pulmón mediante la regulación de la MMP-2 y MMP7.
Antes de nuestro estudio, los papeles de RNF146 en la vía de señalización de Wnt se limitaron a la degradación de Axin y la promoción de la agregación nuclear de β-catenina. Debido a β-catenina interacciona con TCF-4 después de que entre en el núcleo [16] - [17], la hipótesis de que RNF146 podría regular la proliferación celular y la invasión mediante la regulación de la transcripción génica dirigida indirectamente a través Axin /β-catenina. Nuestros experimentos mostraron que RNF146 no jugó un papel regulador en las proteínas aguas abajo cyclinD1, ciclina, y MMP7 en las células con knockeddown Axin y β-catenina. Del mismo modo, la sobreexpresión o desmontables de RNF146 no indujo cambios en los niveles de proteínas específicas cuando TCF4 fue derribado. **
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doi:10.1371/journal.pone.0085377.s003
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Acknowledgments
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