Extracto
Antecedentes y Objetivo
Sí-asociado proteínas (YAP) y co-activador transcripcional con motivo de unión PDZ (TAZ) son efectores nucleares de la vía de Hipona. A pesar de que se expresan abundantemente en el citoplasma y núcleos de cáncer colorrectal humano (CRC), y se relacionan con el estado de la proliferación tumoral, se han realizado pocos estudios sobre el papel predictivo de la expresión YAP y TAZ en la supervivencia global de los pacientes con CCR. Este estudio investigó la expresión YAP y TAZ, tanto en pacientes con CRC y líneas celulares de cáncer de colon, y evaluó su valor pronóstico.
Métodos
incluido en parafina se utilizaron muestras de 168 pacientes elegibles para investigar y YAP TAZ expresión mediante técnicas de inmunohistoquímica, y en comparación con los resultados experimentales en la línea celular HCT116 cáncer de colon para explorar su significado clínico en el CCR.
resultados
correlaciones positivas estadísticamente significativas se encontraron entre la expresión de la proteína de YAP y TAZ en tejidos de CRC. Los pacientes con mayor YAP o expresión TAZ mostraron una tendencia de los tiempos de supervivencia más cortos; que es más importante, nuestro estudio de cohortes indica que los pacientes con sobreexpresión tanto YAP y TAZ presentan los peores resultados. Esto fue apoyado por el análisis multivariante. En las células de cáncer de colon HCT116, la capacidad de proliferación, metástasis y la invasión se redujo drásticamente por desmontables de YAP y TAZ expresiones de siRNA.
Conclusiones
Co-sobreexpresión de YAP y TAZ es una predictor independiente de pronóstico de los pacientes con CCR, y puede dar cuenta de la mayor proliferación, metástasis y mal pronóstico de supervivencia de estos pacientes
Visto:. Wang L, S Shi, Guo Z, X Zhang, Han S, Yang A, et al. (2013) La sobreexpresión de YAP y TAZ es un predictor independiente de pronóstico en el cáncer colorrectal y los relacionados con la proliferación y metástasis de las células del cáncer de colon. PLoS ONE 8 (6): e65539. doi: 10.1371 /journal.pone.0065539
Editor: Wanjin Hong, Instituto de Biología Molecular y Celular, Singapur
Recibido: 4 Febrero 2013; Aceptado: April 25, 2013; Publicado: 10 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81072117). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La vía Hippo es un importante regulador del crecimiento celular, proliferación y apoptosis. Fue descubierto por primera vez por las pantallas de mosaico genético en
Drosophila melanogaster
[1], [2]; sin embargo, hay un cuerpo creciente de evidencias que demuestran que la vía de Hippo también limita el tamaño del órgano en los sistemas de mamíferos [3], [4] mediante la inhibición de la proliferación celular y la promoción de la apoptosis. Componentes de esta vía están muy conservadas en mamíferos, e incluyen Mst1 /2; WW45; LATS1 /2; Mob1; LADRAR; TAZ; NF; FRMD6; y Fat4 [2]. Mst1 /2 y Last1 /2 son quinasas, y WW45 y actuar como Mob1 adaptadores /activadores en los mamíferos, en conjunto, estos representan el casete quinasa núcleo de la vía de Hipona. Los homólogos YKI: proteína Sí asociado-(YAP) y su paralog, co-activador transcripcional con motivo de unión PDZ (TAZ), son los objetivos principales del núcleo del hipopótamo cascada de quinasa, y se considera que son los efectores nucleares de vía de Hipona [5].
estudios previos han informado de que la alteración aberrante de los componentes clave de la vía Hippo conduce al crecimiento celular descontrolado, y se asocia con el desarrollo del cáncer [6], [7]. Esto implica que la vía de Hippo juega un papel crítico en la supresión del crecimiento del tumor [8]. la activación aberrante de YAP se ha asociado con un mal pronóstico en múltiples de los cánceres humanos [5], [9] - [11], incluyendo hepatocelular, de ovario, y el mesotelioma maligno, y puede actuar como un oncogén en el cáncer de mama [15]. Como tal, YAP se ha propuesto como un oncogén candidato. Por otra parte, se encontró que la sobreexpresión de YAP para mejorar el tamaño del hígado y eventualmente conducir al desarrollo de tumores en modelos de ratones transgénicos condicionales [5], [12], [13]. Estudios adicionales han demostrado que la TAZ, y la secreción TAZ dependiente de anfirregulina (AREG), también juega un papel importante en la tumorigénesis de mama y metástasis: cuando se sobreexpresa TAZ es derribado en el carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), su proliferación y propiedades oncogénicas se suprimen [16].
Aunque tanto YAP y TAZ han demostrado estar involucrados en la progresión de cánceres que se originan de diversos tejidos, es necesario investigar el papel específico de tejido de la expresión de YAP y TAZ con el fin de investigar el papel de YAP y TAZ en el cáncer colorrectal humano (CRC) y entender aún más la función de la vía de Hippo. Los datos recientemente publicados sugieren que sobreexpresa YAP puede Interacción con la β-catenina para conducir la proliferación de células de cáncer de colon, lo que implica que YAP podría desempeñar un papel en la terapia del cáncer [17]; Sin embargo, a nuestro conocimiento, la investigación sobre el significado clínico de YAP y TAZ, y el valor pronóstico de YAP y TAZ, ha sido limitado, y la importancia de YAP y TAZ co-sobreexpresión en el CCR, sigue siendo difícil de alcanzar.
en este estudio, se determinó el valor pronóstico de ambos YAP y TAZ en un estudio de cohorte retrospectivo con cinco años de seguimiento, para determinar el papel predictivo independiente de YAP y TAZ en pacientes con CCR. Hemos identificado una sinergia entre estas dos proteínas y un posible mecanismo por el cual la vía Hippo modula la progresión del CRC humano.
Materiales y Métodos
Los pacientes y el seguimiento
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Cuarta Universidad médica Militar (FMMU; Xi'an, china), y todos los pacientes participantes dieron su consentimiento informado por escrito. La cohorte retrospectivo incluyó 168 pacientes diagnosticados con CRC potencialmente resecable entre febrero de 2006 y diciembre de 2007 en el Departamento de Cirugía Gastrointestinal del Hospital Xijing, FMMU. Los pacientes con los siguientes criterios fueron excluidos de la participación: habían recibido quimioterapia adyuvante antes de la cirugía; habían sido diagnosticados con tumores del estroma gastrointestinal o linfoma; tenido diagnósticos cánceres adicionales; o denegado el consentimiento. Todas las muestras clínicas fueron recuperados desde el archivo de tejido Departamento de Patología, Hospital Xijing, FMMU. Seguimiento de la información se actualiza cada tres meses, de todos los participantes, por teléfono. La supervivencia global se definió como el tiempo transcurrido desde la cirugía hasta el momento de la muerte del paciente. la muerte del paciente se estableció a partir de su familia
La inmunohistoquímica y alcanzaron el
secciones de tejidos normales y tumorales fueron teñidas para YAP (H-125 incluido en parafina:. sc-15407; Santa Cruz Biotechnology, EE.UU. ) y TAZ (NP_056287: ab118373; Abcam, UK) expresión. A medida que el anticuerpo contra YAP utilizado en este estudio es un anticuerpo policlonal, que utiliza la transferencia Western para identificar la especificidad del anticuerpo de YAP (Figura S1). La inmunohistoquímica (IHC) para YAP y TAZ se realizaron como [7] se ha descrito previamente con modificaciones menores. En pocas palabras, las diapositivas se deparaffinized en xileno, y rehidratada a través de una serie graduada de alcohol, antes de la actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con el 3% de H
2O
2 en metanol. Después del bloqueo contra la proteína de unión no específica, las muestras se incubaron durante la noche con YAP o TAZ anticuerpos primarios, se diluye a las concentraciones recomendadas (1:500), en una cámara de humedad a 4 ° C. Las muestras se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), antes de que se aplicó el anticuerpo secundario biotinilado durante 30 min a temperatura ambiente. La visualización se realizó con 3,3 'diaminobencidina cromógeno (DAB) durante 2-3 minutos. Los controles negativos se prepararon mediante la sustitución del anticuerpo primario con suero de conejo preinmune. YAP y TAZ tinción fue evaluado por dos patólogos independientes, cegados a las características clínicas de los pacientes. El sistema de puntuación utilizado para evaluar la expresión de YAP y TAZ se describe en la Tabla 1.
Cell Cultura y
Las siguientes líneas celulares de cáncer de colon humano HCT116:, LS174T, Lovo SW480 y SW480 se utilizaron en este estudio. Todas las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). células HCT116 y LOVO se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS; HyClone); células SW480 y LS174T se cultivaron en RPMI1640 (Invitrogen, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de FBS; SW620 células se cultivaron en medio L-15 (Invitrogen, CA, EE.UU.) medio de Leibovitz con un 10% de SFB. Todas las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
La transfección y silenciamiento génico
Para la transfección pequeño ARN de interferencia (siRNA), el siguiente siRNA dúplex se sintetizaron (Genepharma, Shanghai, china): (5'-GGUGAUACUAUCAACCAAATT-3 '), en el gen YAP; (5'-GGAUACAGGAGAAAACGCATT-3 '), la orientación del gen TAZ; y el dúplex de control negativo, (5'-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3 '). Estos dúplex siRNA (100 nmol /L) se transfectaron en células HCT116 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. HCT116 células se cosecharon 48 h después de la transfección para el análisis de genes o proteínas.
Cuantitativo en tiempo real de la transcriptasa inversa-reacción en cadena de polimerasa
ARN total fue extraído a partir de líneas celulares usando el reactivo Trizol (Invitrogen) , y la síntesis posterior de ADN cíclico (ADNc; Takara, Japón), se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos de los fabricantes. En tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (QRT-PCR) se realizó utilizando el sistema CFX96TM PCR en tiempo real (BioRad, CA, EE.UU.) con el kit SYBR Green II (# DRR041A; Takara, Japón) de acuerdo con los fabricantes "instrucciones. análisis de QRT-PCR se realizó en un volumen total de 20 l con las siguientes etapas de amplificación: una etapa de desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min; seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s; y luego elongación a 55 ° C durante 30 s. Las expresiones se normalizaron con el gen de β-actina humana. Se utilizaron las siguientes secuencias de cebadores: 5'-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3 '(sentido) y 5'-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3' (antisentido) para YAP; 5'-GTCACCAACAGTAGCTCAGATC-3 '(sentido) y 5'-AGTGATTACAGCCAGGTTAGAAAG-3' (antisentido) para TAZ; 5'-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3 '(sentido) y 5'-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3' (antisentido) para β-actina.
Análisis Western Blot
Las células se recogieron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (Santa Cruz Biotechnology). Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE, y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore, MA, EE.UU.). Las membranas se bloquearon con 5% de leche sin grasa en tampón PBS durante 2 h a temperatura ambiente, antes de ser dirigido ith los siguientes anticuerpos según las instrucciones del fabricante: anti-Yap (1:500); anti-TAZ (1:500); y anti-actina (1:5,000; AC40: A4700; Sigma-Aldrich, EE.UU.). Las membranas se incubaron con sus (HPC) anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante asociados, y las proteínas de anticuerpos unidos se visualizaron mediante quimioluminiscencia (New England Nuclear, MA, EE.UU.).
Cell ensayo de crecimiento (MTT)
La proliferación celular
in vitro
se analizó utilizando sal de tetrazolio 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT); porque colorante MTT amarilla se reduce a un producto de formazán azul por las enzimas respiratorias que sólo son activos en células viables, el grado de cambio de color es indicativa de la proliferación celular. células HCT116 se transfectaron durante 48 h sin siRNA (parental); siRNAs específicos (si-Con, si-YAP, o si-TAZ); o co-transfectadas con si-si-YAP y TAZ (si-YAP-TAZ), y se suspendieron en DMEM con 10% de SFB. Brevemente, 2000 células de cada clon (los padres, si-Con, si-YAP, si-TAZ, y si-YAP-TAZ) se sembraron en cinco placas de 96 pocillos en 200 l de medio DMEM. Para el análisis: se añadieron 20 l de sustrato MTT (de una solución madre de 2,5 mg /ml en PBS) a cada pocillo; Las placas se devolvieron a la incubadora durante 4 h adicionales a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2; se retiró el medio; las células se solubilizaron en dimetilsulfóxido 150 l; y el análisis colorimétrico se realizó (longitud de onda, 490 nm). Una placa se analizó inmediatamente después de que las células adheridas (aproximadamente 4 horas después de la siembra), y las placas restantes fueron ensayados durante los próximos cuatro días consecutivos.
Análisis de citometría de flujo de células apoptóticas
células HCT116 fueron transfectadas durante 48 h sin siRNA (parental); siRNA (Si-Con, si-YAP, o si-TAZ); o co-transfectadas con si-si-YAP y TAZ (si-YAP-TAZ), antes de ser suspendido en PBS a una densidad de 1 × 10
6 células /ml. Las células apoptóticas se analizaron por citometría de flujo utilizando un 500 flujo Cytomics FC citómetro (Beckman Coulter), después de incubar las células con un reactivo que contiene Anexina V-FITC y yoduro de propidio (BD Bioscience, CA, EE.UU.) durante 15 min en la oscuridad a temperatura ambiente .
Análisis de la invasión y la Movilidad (migración y la invasión ensayos)
se midieron
invasión celular y la migración potencial de
in vitro fotos: por ensayos Transwell (Millipore, Billerica, MA) como la siguiente manera: las células HCT116 se transfectaron durante 48 h sin siRNA (parental); siRNA (Si-Con, si-YAP, o si-TAZ); o co-transfectadas con si-si-YAP y TAZ (si-YAP-TAZ); las células se suspendieron en DMEM con 10 g /l de BSA a una densidad de 50 células /l; 200 suspensiones de células se sembraron mu l en las cámaras superiores de los Transwells, en el que la membrana porosa era o bien revestido con Matrigel (BD Bioscience) para los ensayos de invasión, o se dejan sin revestir para los ensayos de migración. DMEM con 10% de suero (500 l) se añadió a la cámara inferior como un quimioatrayente. Después de la migración durante 24 h, o invasión durante 48 h, las células que habían penetrado en los filtros se fijaron en metanol, y se tiñeron en violeta 4g /l de cristal. El número de células que migraron e invasoras se determinaron a partir de cinco campos al azar bajo un microscopio Olympus (Olympus) a 10 × magnificación.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el software estadístico SPSS de IBM (versión 20.0). Se utilizó la prueba de rangos de Spearman para evaluar la correlación entre YAP y TAZ expresiones; Las curvas de supervivencia se estimaron utilizando el método Kalplan-Meier; y las distribuciones se evaluaron por el log-rank test. modelo de riesgos proporcionales de factores potencialmente relacionados con la supervivencia de Cox se llevaron a cabo para calcular los coeficientes de riesgo (HR), e identificar los factores que podrían tener una influencia significativa en la supervivencia. Las diferencias en las características entre los dos grupos fueron examinados por chi-cuadrado de Pearson (χ
2) prueba y la prueba exacta de Fisher. Todos los
P
valores se determinaron a partir de 2 colas pruebas y diferencias con un
P-valor
. & Lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
significado clínico de YAP y TAZ sobreexpresión en cáncer colorrectal tejido
Para determinar la prevalencia y la importancia clínica de YAP y TAZ en el CCR, se evaluó la expresión de la proteína YAP y TAZ por IHC en muestras de tejido tumoral de nuestra cohorte retrospectivo de 168 pacientes de CRC después de la resección del tumor. Entre los 168 pacientes, 122 (72,6%) fueron positivos para la expresión YAP, ya sea nuclear o citoplásmica (Figura 1A); mientras que 46 (27,4%) fueron negativos para la expresión YAP (Figura 1B); 97 (57,8%) muestras fueron positivas para la expresión TAZ; y 71 (42,2%) fueron negativas para la expresión TAZ (Figuras 1E y F, respectivamente). En contraste, sólo 3 (18,75%) y 2 (12,5%) de las 16 muestras de tejidos normales adyacentes se encontraron positivas para YAP y TAZ expresión, respectivamente (Figuras 1C, D, G, y H). Además, existía una correlación positiva significativa entre YAP y TAZ (r = 0,630,
P
& lt; 0,001; Tabla S1)., Lo que indica una correlación potencial entre estas proteínas en CRC
( A) tumor YAP-positiva; (B) del tumor YAP-negativas; (C) el tejido normal YAP-positiva; (D) el tejido normal YAP-negativas; tumoral (E) TAZ-positivo; tumoral (F) TAZ-negativas; el tejido normal (G) TAZ-positivo; el tejido normal (H) TAZ-negativo. Imágenes representativas fueron tomadas con un microscopio (x10). Estos resultados indican la importancia clínica de YAP y TAZ sobreexpresión en tejido CRC.
Como resultado de estas observaciones, se evaluó la relación entre YAP y TAZ expresión y las características clínicas de los pacientes con CCR por chi de Pearson -square prueba o la prueba exacta de Fisher. Nuestros resultados mostraron que la expresión de YAP y TAZ se asociaron significativamente con el estado de los ganglios linfáticos en los tumores colorrectales (
P = 0,001
y
P = 0,013
, respectivamente), pero no se correlacionó significativamente con sexo, localización del tumor, el tamaño del tumor, la diferenciación celular, o el estadio TNM (Tabla 2). El alto impacto pronóstico de metástasis en los ganglios linfáticos, y el número total de ganglios linfáticos para ser resecadas, está bien establecida. Un estudio reciente demostró que los valores de corte de la relación de los ganglios linfáticos (la relación entre los nodos infiltrado en el tumor a los ganglios linfáticos resecados) son fuertes factores pronósticos independientes para los pacientes con CRC, basado en el análisis de los datos clínicos e histopatológicos de 3026 pacientes en una un centro de cirugía sola durante un período de 25 años [18]. Estos resultados nos llevaron a investigar el papel de YAP y TAZ en el pronóstico de los pacientes con CCR.
YAP y TAZ co-sobreexpresión se asocia a peor supervivencia global
Para determinar el pronóstico significado de la expresión YAP y TAZ en pacientes con CRC, se intentó relacionar YAP y TAZ expresión de los resultados clínicos. La mediana de supervivencia global entre los pacientes de nuestra cohorte retrospectivo fue de 43 meses (rango: 1-56 meses), y al final del período de seguimiento (60 meses), 70 de los 168 pacientes estaban vivos, y 98 pacientes estamos muertos. La asociación entre la expresión de la proteína YAP y TAZ y la supervivencia global de los pacientes con CRC se investigó mediante análisis de Kaplan-Meier y log-rank test para las estimaciones de significación. Los pacientes fueron divididos en dos grupos: aquellos con expresión positiva de YAP o TAZ, y los que tienen expresión negativa de YAP o TAZ. Se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre la supervivencia global de los dos grupos (prueba de largo rango:
P Hotel & lt; 0,02 y
P Hotel & lt; 0,001, respectivamente). Los pacientes con expresiones más altas de YAP o TAZ tendían a tener un mayor riesgo de muerte en comparación con los pacientes con expresiones inferiores de YAP o TAZ, siendo el CRI no ajustado 1.617 y 1.643, respectivamente. Además, se encontró que la diferenciación celular, la metástasis de los ganglios linfáticos, y la etapa TNM estar asociada con el pronóstico de pacientes con CRC (Tabla 3). El análisis multivariado mostró que la mayor expresión de YAP o TAZ se asoció con una reducción de la supervivencia global, con el HR ajustado de ser 2.168 (IC del 95%: 1,125-4,179;
P Hotel & lt; 0,001) y 1,544 (95% IC:. 0,999-2,451;
P
= 0,05), respectivamente, lo que indica que la expresión de YAP o TAZ podría ser un factor pronóstico independiente de estas características clínico ajustados (Tabla 3) guía empresas
a continuación se investigó si los co-sobreexpresión de YAP y TAZ podría tener un papel pronóstico en el CCR. Nuestra cohorte de pacientes se dividieron en cuatro grupos de acuerdo con sus niveles de expresión combinados de YAP y TAZ. Se observó una diferencia estadísticamente significativa en el resultado de supervivencia global entre estos cuatro subgrupos de pacientes; aquellos con co-sobreexpresión positivo de YAP y TAZ tuvieron la peor supervivencia global (Figura 2). modelo de riesgos proporcionales de Cox, ajustado por sexo, la edad, el tamaño del tumor, localización del tumor, estado de diferenciación, y el estadio TNM, en comparación con YAP o expresión TAZ, mostró que la expresión negativa de ambos YAP y TAZ se asoció con una mejora significativamente la supervivencia global; mientras que, la expresión de ambos YAP y TAZ se asociaron significativamente con la pobre supervivencia global (Tabla 3), con el HR ajustado de ser 3.118 (IC del 95%: 1,017-9,559;
P Hotel & lt; 0,001). Estos datos demostraron que YAP y TAZ co-sobreexpresión puede tener un impacto pronóstico específico e independiente entre los pacientes con CRC
(A) Correlación de la expresión YAP con la supervivencia global.; (B) la correlación de expresión TAZ con la supervivencia global; (C) la correlación de la expresión combinada YAP y TAZ con la supervivencia global. Una diferencia estadísticamente significativa se muestra en los resultados de supervivencia global entre los diferentes grupos de pacientes, con los que tienen co-sobreexpresión positivo de YAP y TAZ tiene la peor supervivencia global.
La sobreexpresión de YAP y TAZ en HCT116 Colon Cancer Cell Line
con el fin de investigar más a fondo el efecto de YAP y TAZ en la progresión de la CRC, hemos probado nuestras conclusiones preliminares del estudio de cohorte en los experimentos de líneas celulares. Primero se examinaron los niveles de expresión de genes y proteínas de YAP y TAZ en HCT116, LS174T, LOVO, SW620 y SW480 líneas celulares de cáncer de colon. Las células HCT116 mostraron los más altos niveles de expresión de ambos YAP y TAZ (Figuras 3A y B); Por lo tanto, la línea celular HCT116 se eligió para posteriores experimentos para investigar YAP y TAZ en la progresión del CRC
(A) QRT-PCR análisis de YAP y TAZ expresiones.; (B) Análisis de transferencia Western de YAP y TAZ expresiones. β-actina se utilizó como control interno de carga. Las células HCT116 muestran los más altos niveles de expresión de ambos YAP y TAZ.
Efecto de YAP o siRNA TAZ TAZ en YAP o niveles en HCT116 humano líneas celulares de cáncer de colon
A continuación examinó la efecto de YAP y TAZ en la línea celular HCT116 través desmontables de YAP o TAZ expresión utilizando siRNAs dirigidos. La especificidad de siRNA dirigidos para YAP y TAZ se confirmó por análisis de transferencia Western. En comparación con células que habían sido transfectadas con ARNsi de control, la expresión de YAP y TAZ fue fuertemente suprimida en las células HCT116 transfectadas con 10 g de siRNAs dirigidos (Figura 4A y Figura S2).
(A) análisis de transferencia de Western de líneas celulares con niveles reducidos de YAP y TAZ después de la transfección con ARNip: células HCT116 los padres que llevan sin siRNA (de los padres); Control de siRNA (Si-Con); siRNA a YAP (si-YAP); siRNA para TAZ (si-TAZ); y co-transfectadas con siRNA de YAP y siRNA para TAZ (si-YAP-TAZ). (B) los ensayos de crecimiento celular MTT de las células de control (de los padres, si-Con); YAP células con expresión reducida o TAZ (si-YAP, si-TAZ); o células con YAP reducida y expresión TAZ (si-YAP-TAZ). Los datos se presentan como media ± SD, n = 3, *
P Hotel & lt; 0,05. (C) por citometría de flujo análisis de células teñidas con anexina-V-FITC y PI: células que llevan no siRNA (parental); Control de siRNA (Si-Con); siRNA a YAP (si-YAP); siRNA para TAZ (si-TAZ); y células con YAP reducida y expresión TAZ (si-YAP-TAZ). Estos resultados indican que la expresión YAP tiene un mayor efecto sobre la proliferación celular y la supresión de la apoptosis en comparación con la expresión TAZ; sin embargo, un papel sinérgico entre YAP y TAZ aumenta sus efectos individuales combinados.
Efecto de YAP y TAZ Expresión de Proliferación Celular
se utilizaron
ensayos de MTT para determinar los efectos de la reducción YAP y la expresión TAZ sobre las tasas de crecimiento de células de cáncer de colon HCT116. El grupo transfectadas con siRNA YAP mostró una reducción significativa en la tasa de proliferación con respecto al grupo transfectadas con siRNAs de los padres o de control. Una tendencia similar se observó con TAZ siRNA; sin embargo, el efecto no era tan fuerte. El grupo que fue co-transfectadas con YAP y TAZ siRNAs mostró el más dramático y altamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05), disminución de la tasa de proliferación en comparación con los grupos de siRNA de los padres o de control (Figura 4B); Por lo tanto, estos resultados demostraron que YAP y TAZ poseían un papel sinérgico de la proliferación de células de cáncer de colon.
Efecto de YAP y Expresión TAZ en células HCT116 Apoptosis Ratio
A continuación se investigó la diferencia en relación apoptosis entre los grupos de derribo TAZ YAP y /o y el grupo control para confirmar nuestros resultados del estudio de cohorte retrospectivo. Citometría de flujo El análisis mostró que la relación de la apoptosis se redujo en las células HCT116 transfectadas con siRNA YAP comparación con las células HCT116 transfectadas con Con si-parental o siRNA (17,48% frente a 1,62%,
P
& lt; 0,05; 17,48% vs. 2,28%,
P Hotel & lt; 0,05, respectivamente; Figura 4C); el efecto fue ligeramente más débil en las células HCT116 transfectadas con siRNA TAZ en relación con las transfectadas con los padres o Si-Con siRNA (6,48% vs.1.62%,
P Hotel & lt; 0,05; 6,48% frente a 2,28%,
P Hotel & lt; 0,05, respectivamente; Figura 4C); sin embargo, la relación de la apoptosis se redujo más dramáticamente en las células HCT116 co-transfectadas con YAP y TAZ siRNAs en comparación con las transfectadas con los padres y si-Con (33,60% frente a 1,62%,
P
& lt; 0,01; 33,60 % frente a 2,28%,
P Hotel & lt; 0,05, respectivamente; Figura 4C). En conjunto, estos resultados indicaron que la expresión YAP tenía un papel importante en la promoción de la proliferación celular y la supresión de la apoptosis de células; TAZ jugó un papel importante, aunque menos significativa, en este progreso; y un efecto sinérgico entre YAP y TAZ aumentó su impacto sobre la proliferación celular y la apoptosis aún más.
Efecto de YAP y TAZ sobre la migración y la invasión
YAP y TAZ actividad ha sido previamente demostrado que la mediación del tumor la migración celular y la invasión. Nuestra observación de que una reducción de la expresión YAP y TAZ jugó un papel sinérgico en la inhibición de la proliferación celular y el aumento de la apoptosis de las células HCT116 nos llevó a evaluar el efecto de YAP y TAZ siRNA co-transfección de las capacidades de migración y la invasión de cáncer de colon Células. Standard, y los ensayos Transwell recubiertas con Matrigel se utilizaron para evaluar la migración y la invasión, respectivamente. Tanto YAP y TAZ siRNA células transfectadas se muestra la migración estadísticamente significativamente reducido en comparación con las células control; la reducción fue más significativa en el grupo transfectadas con siRNA TAZ; Sin embargo, el grupo transfectadas tanto con YAP y TAZ mostró el efecto más significativo en la reducción de la migración (Figuras 5A y B). Las tendencias fueron similares en los ensayos de invasión de Matrigel: clones con niveles reducidos de YAP o TAZ mostraron una reducción estadísticamente significativa de la capacidad de invasión en comparación con las células control; El efecto fue más significativo en el grupo knockdown TAZ; Sin embargo, se observó la reducción más significativa de la capacidad de invasión cuando ambos YAP y TAZ fueron derribados (Figura 5C y D).
(A) Imágenes representativas (× 10) de los ensayos de migración de células HCT116 con niveles normales de YAP y TAZ expresión (de los padres y si-Con); células con niveles reducidos de YAP o TAZ expresión (si-si-YAP o TAZ); y células con YAP suprimida y la expresión TAZ (si-YAP-TAZ). (B) Media del número de células de los cinco ensayos de migración independientes descritos en anteriormente. (C) ensayo de invasión de las células HCT116 los padres; células de Si-Con; si-YAP; si-TAZ; y células si-YAP-TAZ en cámaras de Boyden modificadas con membranas recubiertas con Matrigel. Después de 24 h, las células invasoras que se habían movido a través de la membrana de Matrigel se tiñeron y se contaron bajo un microscopio a 10 × magnificación. (D) Representación gráfica de las células invasoras calculados como el valor medio ± SD de cinco campos. Estos muestran una reducción estadísticamente significativa la migración tanto en las células transfectadas YAP y TAZ siRNA en comparación con las células control; el efecto es mayor en el grupo transfectado con tanto YAP y TAZ. [Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas en YAP o TAZ siRNA células transfectadas vs. Si-Con o células de los padres, (*,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01) .].
Discusión
YAP y TAZ son los principales objetivos de abajo de la vía de señalización de Hipona. Hasta la fecha, no ha habido un cuerpo considerable de evidencia que vincula el oncogén YAP /TAZ a la tumorigenicidad en varios tipos de sólidos de cánceres, incluyendo ovario, mama, próstata, hígado y pulmón [7], [9], [12], [15]. La sobreexpresión de YAP ha informado para activar de forma aberrante un conjunto de genes diana responsables de la proliferación celular, la supervivencia, anti-apoptosis, y la migración [19], [20]. Por otra parte, estudios previos han identificado YAP como un marcador pronóstico independiente para la supervivencia y libre de enfermedad tiempos de carcinoma hepatocelular (HCC) de los pacientes; y clínicopatológicamente asociado a la diferenciación del tumor [21]. Sobre la base de los puntos de vista establecidos que YAP puede aumentar el tamaño del órgano y la función como un oncogén [5], [9]; y que TAZ puede promover la proliferación celular, inducir la transición epitelial-mesenquimal (EMT), y aumentar la migración celular y la invasión [22]; combinado con la similitud potencial de las funciones específicas de tejido de YAP y TAZ, se analizó y se caracterizó la importancia clínica de YAP y TAZ como un factor pronóstico independiente para determinar los resultados de los pacientes con CCR. Nuestros resultados fueron consistentes con un estudio previo [7], en que los niveles de expresión de ambos YAP y TAZ fueron significativamente elevados en la mayoría de tejidos de CRC en comparación con los tejidos normales adyacentes; Sin embargo, en contraste con los informes sobre el cáncer de mama y carcinoma de células escamosas de pulmón, hemos encontrado ninguna discrepancia entre la expresión citoplasmática y nuclear de YAP o TAZ en los tejidos de CRC [15]. Las variaciones en la expresión de YAP entre diferentes tejidos de cáncer son probablemente debido a su complicada microambiente tumoral. El uso de regresión de Cox análisis multivariado, se encontró que los altos co-expresión de YAP y TAZ fue un predictor de pronóstico para la supervivencia global de los pacientes con CCR, independientemente del sexo, la edad, el tamaño del tumor, estado de diferenciación, invasión vascular y el estadio TNM. Por otra parte, las tasas de supervivencia general más bajas fueron identificados en pacientes que co-expresan YAP y TAZ, y se asociaron con tumores que tiene las mayores capacidades de migración y la invasión.
YAP es reconocido como un oncogén candidato, y se convirtió en el foco de la investigación, después de que fue identificado en el cromosoma humano 11q22 amplicón que es evidente en varios cánceres humanos [14]. TAZ es un paralog YAP, identificado inicialmente como una proteína de unión 14-3-3 [23]; TAZ tiene aproximadamente 50% de identidad de secuencia con YAP, y una topología similar; TAZ actúa como un co-activador transcripcional de manera similar a YAP [23]; Es de destacar que fue el descubrimiento de que YAP y TAZ comparten el factor de transcripción aguas abajo, Tead, para promover la proliferación celular, la migración, el crecimiento independiente de anclaje, y la EMT, que son todos los involucrados en la iniciación y progresión del cáncer [24]. Además, los mecanismos de TAZ y regulación YAP por Hippo son similares. Estos hallazgos sugieren que la regulación y la función entre TAZ y YAP compartidos;