Extracto
Antecedentes
Lisina desmetilasa específica 1 (LSD1) ha sido identificado y bioquímicamente caracterizado epigenética, pero los papeles patológicos de su disfunción en el cáncer de pulmón aún no se han dilucidado. El objetivo de este estudio fue evaluar la importancia pronóstica de la expresión de la LSD1 en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y definir su papel exacto en el cáncer de pulmón de la proliferación, la migración y la invasión.
Métodos
Los niveles de proteína de la LSD1 en muestras resecado quirúrgicamente de pacientes con CPNM se detectaron mediante inmunohistoquímica o transferencia Western. Los niveles de mRNA de LSD1 se detectaron mediante qRT-PCR. La correlación de la expresión de la LSD1 con características clínicas y el pronóstico se determinó por análisis estadístico. tasa de proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de MTS y la inmunofluorescencia. La migración celular y la invasión fueron detectados por la prueba de marcar, y ensayo de Matrigel Transwell ensayo de invasión.
Resultados
LSD1 expresión fue mayor en el tejido de cáncer de pulmón más que en el tejido pulmonar normal. Nuestros resultados mostraron que la sobre-expresión de la proteína LSD1 se asocia con más corta supervivencia global de los pacientes con NSCLC. LSD1 fue localizada principalmente en el núcleo de células de cáncer. La interrupción de la LSD1 utilizando siRNA o un inhibidor químico, pargilina, la proliferación suprimida, la migración y la invasión de la A549, H460 y células 293T. Mientras tanto, la sobre expresión de un mayor crecimiento de células LSD1. Por último, se mostró LSD1 para regular la transición epitelio-mesenquimal de las células de cáncer de pulmón.
Conclusiones
La sobreexpresión de la LSD1 se asoció con un mal pronóstico en CPNM, y promovió la proliferación de células tumorales, la migración y la invasión. Estos resultados sugieren que la LSD1 es un factor promotor de tumores con potencial terapéutico prometedor para NSCLC
Visto:. Lv T, Yuan D, Miao X, Lv Y, Zhan P, Shen X, et al. (2012) La sobreexpresión de la LSD1 promueve la proliferación, migración e invasión de células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (4): e35065. doi: 10.1371 /journal.pone.0035065
Editor: Pan-Chyr Yang, el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 22 Noviembre 2011; Aceptado: 11 de marzo de 2012; Publicado: 6 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Lv et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es una de las principales causas de cáncer muerte en el mundo. cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es el tipo más común de cáncer de pulmón [1]. La tasa de supervivencia a 5 años para el cáncer de pulmón sigue siendo pobre. Con el fin de desarrollar terapias más eficaces, es importante para obtener una mejor comprensión de la biología molecular del cáncer de pulmón.
Las alteraciones genéticas son un sello del cáncer humano. En los últimos años, el campo de la genómica del cáncer ha hecho importantes avances en la identificación de lesiones genéticas en el cáncer. Por otra parte, también se ha reconocido la importancia de los cambios epigenéticos que ocurren durante el desarrollo del cáncer de pulmón [2]. Los cambios epigenéticos están asociados tanto con la metilación del ADN y modificaciones de las histonas [3]. modificaciones de las histonas, tales como acetilación, fosforilación y la metilación, son los interruptores que alteran la estructura de la cromatina para permitir la activación posttranscriptional o represión de las proteínas aguas abajo [4]. La comprensión de estos cambios epigenéticos será identificar nuevos genes relacionados con el cáncer que pueden representar objetivos atractivos para el tratamiento del cáncer y proporcionar nuevos conocimientos sobre la biología de los cánceres de pulmón. Por lo tanto, un enfoque integrador en la investigación del cáncer de pulmón, la combinación de información epidemiológica, genética y epigenética, se ha convertido en un concepto importante para la terapia del cáncer [5].
El estado de metilación de las histonas methyltransferases y desmetilasas histonas juega un papel fundamental en la regulación de la expresión de genes [6]. Histona desmetilasa lisina desmetilasa específico 1 (LSD1), la primera desmetilasa histona que fue descubierto como un homólogo nuclear de amina oxidasas, elimina los grupos metilo de la lisina mono- y dimetilado (Lys) 4 de la histona H3 (H3K4me1 /2) y Lys9 de histona H3 (H3K9me1 /2) [7]. LSD1 es esencial para el desarrollo de los mamíferos e involucrado en muchos procesos biológicos, como la diferenciación de tipo celular y la activación de genes y la represión [8]. Un estudio reciente indica que la LSD1 podría promover la transición de fase de células (deficiencia en LSD1 llevado a la detención del ciclo celular en G parcial
2 /M) y la proliferación celular, lo que sugiere que su sobre-expresión podría promover la tumorigénesis [9]. La expresión de LSD1 ha sido asociada con la recurrencia del tumor durante la terapia en diversos cánceres, lo que implica más LSD-1 como un promotor de tumores [10] - [12]. Tejido cDNA microarray análisis también reveló transactivación LSD1 en el pulmón y carcinomas colorrectales [11]. El derribo de la LSD1 con pequeñas (SI) RNAs de interferencia resultó en la supresión de la proliferación de diversas líneas de células de la vejiga y el cáncer de pulmón [11]. Sin embargo, aunque estos estudios demostraron que la LSD1 puede estar asociada con la patogénesis del cáncer de pulmón, la expresión y la importancia de la LSD1 en NSCLC es oscura.
En este estudio, se intentó investigar la expresión y función de LSD1 en NSCLC, su relación con las características clínico-patológicas, y su valor pronóstico para la supervivencia de los pacientes con NSCLC. Por último, también El objetivo fue determinar el papel exacto de la LSD1 en el cáncer de pulmón de la proliferación, la migración y la invasión.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
Las muestras quirúrgicas de 80 CPNM pacientes obtenidos en el hospital del Tórax de Nanjing y el hospital Jinling desde enero de 2001 hasta diciembre de 2003 recogieron de forma retrospectiva para su estudio. Estos consistían en 38 carcinomas escamosos y adenocarcinomas 42, junto con muestras de tejido no tumorales adyacentes de pacientes emparejados. Ninguno de los pacientes había recibido radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía. Todos los pacientes habían sido seguidos durante cinco años después de la operación, y los datos clínicos completos fueron grabados por medios electrónicos. Todos los tejidos tumorales fueron clasificados de acuerdo a las directrices de clasificación de la Organización Mundial de la Salud. La puesta en escena de los tumores siguió el 7
º Clasificación Internacional de la Unión en criterios definidos cáncer en 2009. Este estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Jinling en Nanjing. Todas las muestras fueron anónimos, y ninguno de los investigadores que realizan los experimentos tenido acceso a los datos clínico-patológicos.
inmunohistoquímica (IHC) tinción
Todas las muestras fueron fijadas en formol al 10%, embebidos en parafina, seccionado consecutivamente a las 5 micras, y teñidas por hematoxilina y eosina. Las secciones se deparaffinized y rehidratada acuerdo con el protocolo de rutina. Las secciones se incubaron durante la noche con los anticuerpos primarios específicos LSD1 (1:100 dilución; Cell Signaling, Danvers, MA, EE.UU.). Los portaobjetos se incubaron durante 30 min con inmunoglobulinas de cabra anti-conejo (E0432; señalización celular) después de ser lavado con solución de NaCl tamponada con Tris. Los portaobjetos se incubaron durante 30 min con despojado AB complejo /AP (K0391, Dako, Pekín, China). Contratinción se realizó con hematoxilina. El porcentaje de células positivas se determinó contando 500 células en cinco áreas al azar por sección. resultados de inmunotinción nucleares para LSD1 se evaluaron usando un sistema de semi-cuantitativa Remmele de puntuación [13], que calcula la intensidad de la tinción y el porcentaje de células positivas. IHC tinción se obtuvo de acuerdo con los siguientes criterios: -, ninguna de las células teñidas; +, 1 a 40% de las células teñidas; ++; 40-70% de las células teñidas; +++, 70-100% de las células teñidas. puntuación de IHC de expresión LSD1 era [0 (negativo) ≤ score & lt; 2 +] y [2 + ≤ puntaje ≤3 +], lo que representó baja y alta expresión, respectivamente.
Western Blot
Los tejidos tumorales de cáncer de pulmón y los tejidos no tumorales adyacentes se homogeneizaron . Las proteínas totales (30 g) a partir de muestras clínicas o cultivos de células se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, seguido por electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa mediante el uso de una célula de transferencia (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Western Blot se llevó a cabo mediante incubación secuencial en tampón de bloqueo 5% de leche no grasa a temperatura ambiente durante 60 min, seguido de anticuerpo primario contra cualquiera de LSD1 (1:500; Cell Signaling), AcH3K9, TWIST1, E-cadherina, N- cadherina o β-actina a 4 ° C durante la noche, y anti-anticuerpo de conejo finalmente peroxidasa de rábano conjugada secundaria (1:5000) a temperatura ambiente durante 90 min. Las bandas inmunorreactivas se detectaron por reacción con los reactivos ECL sistema de detección (Amersham, Arlington Heights, IL, EE.UU.) y la exposición a película de rayos X, que fue la desarrollaron y se fotografiaron.
ARNm Extracción y cuantitativo de transcripción reversa ( QRT)-PCR
los tejidos fueron homogeneizados y ARNm celular total fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El ADNc se transcribió usando M-MLV transcriptasa inversa (Promega, Madison, WI, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. QRT-PCR se realizó utilizando el kit de Mix Master SYBR Green Comienzo Acelerado universal (Roche, San Francisco, CA, EE.UU.). Los niveles relativos de ARNm de la LSD1 se normalizaron a los niveles de la limpieza gen GAPDH y se calculan por el método 2-ΔΔCt. Se utilizaron los siguientes cebadores: GAPDH, hacia adelante: 5'-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3 'y revertir: 5'-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTG-3'; LSD1, hacia adelante: 5'-GAAACTGGAATAGCAGAGAC-3 'y revertir: 5'-GGTGGACAAAGCACAGTATCA-3'.
Cultivo celular, transfección y tratamiento
A549, H460 y células 293T se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en medio RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina y 100 mg /ml de penicilina /estreptomicina. El plásmido Bandera-LSD1 (3UG); amablemente proporcionados por el Dr. Yang Shi, Universidad del Sur de California, Los Ángeles, CA, EE.UU.), la sobre-expresión plásmido LSD1 (3 g) y la LSD1 siRNA (3 g) se transfectaron en células A549 y H460 en líneas placas de 6 pocillos (1 mg /ml) usando el reactivo Lipofectamine (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pargilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), un inhibidor de monoamina oxidasa, se utilizó para bloquear químicamente LSD1 mediado por desmetilación [14]. Las células se trataron con pargilina durante 48 h, y luego se sometieron a ensayo de MTS. Los datos se presentan como factores de cambio en unidades relativas de luz /mU de pargilina, y representan la media de tres experimentos independientes.
proliferación celular, el crecimiento, MTS Ensayos
Para el ensayo de crecimiento celular, 50.000 células /pocillo se sembraron por triplicado en una placa de 24 pocillos con medio de crecimiento completo. Las células se contaron más de seis días utilizando un hemocitómetro. Para el ensayo de MTS (Promega), 500 células /pocillo se sembraron por triplicado en una placa de 96 pocillos para cada línea celular. A los 12, 24, y 48 h, se añadió 20 l de reactivo MTS a cada pocillo, se incubaron durante 1 h a 37 ° C, y los resultados se analizaron mediante un lector de placas a 490 nm. Los datos de muestra se normalizó a lecturas de fondo de los medios de comunicación solamente.
Cultivo celular tridimensional, colágeno invasión de ensayo, y Scratch Ensayo
Se establecieron cultivos de membrana basal tridimensional como se describe anteriormente [15 ]. Brevemente, 5000 células /pocillo fueron cultivadas en el 2% de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) con factor de crecimiento epidérmico (EGF) en una capa de base matrigel 50%. El ensayo de invasión de colágeno se realizó como se describe anteriormente [16]. Brevemente, 5000 células /pocillo se sembraron en 2% matrigel en una capa de colágeno 1:01 (BD Bioscience) a la mezcla de matrigel. crecimiento del cultivo se registró el día 5. Para el ensayo de cero, se cultivaron las células en medio de crecimiento completo hasta que se alcanzó 90 a 100% de confluencia. Una herida 3 mm se introdujo a través del diámetro de cada placa. La migración celular se observó por microscopía a las 24 y 48 h más tarde.
A, B) la expresión de la LSD1 fue hasta reguladas en el pulmón tejido de cáncer epidermoide. Las flechas indican las células cancerosas LSD1-positivos, los cuales estaban ubicados en los núcleos de las células. Ampliación: A, × 20; B, × 60. (C, D) la expresión de la LSD1 fue hasta reguladas en el tejido pulmonar adenocarcinoma. Ampliación: C, × 20; D, × 60. (E, F) IHC reveló que la expresión de LSD1 era débil en los tejidos pulmonares normales. Ampliación: E, × 20; F, × 60. IHC resultados de la expresión de la LSD1 fueron: baja, [0 (negativo) ≤ score & lt; 2 +]; alta, [2 + ≤ puntaje ≤3 +].
P Hotel & lt; 0,05. Indicadas diferencias estadísticamente significativas entre los grupos
(A) El nivel de proteína de la LSD1 en el tejido de cáncer de pulmón fue significativamente mayor que en el tejido normal (
P
& lt; 0,01), como se detectó por Western blot. β-tubulina se utilizó como control de carga. (B) Muestra 122, 206 y 207 se muestran como representantes de los tres grupos: N, tejidos pulmonares normales: C, tejidos de NSCLC; P, tejidos paracarcinoma. (C) El nivel de mRNA de LSD1 se detectó mediante qRT-PCR, y la expresión de mRNA de LSD1 fue significativamente mayor en el tejido tumoral que en el tejido normal (
P
& lt; 0,05).
Las líneas azules representan altos niveles de expresión de LSD1, y las líneas rojas representan los niveles bajos de expresión de la LSD1 en muestras de NSCLC. (A) los pacientes con CPNM con los niveles de proteína LSD1 más bajos tenían mejor pronóstico. (No ajustado
P-valor = 0,0003
; casos de expresión bajos, los casos n = 52 y la alta expresión, n = 28). (B) Los pacientes con bajos niveles de mRNA de LSD1 también tuvieron una supervivencia más larga (
P Hotel & lt; 0,05).
Análisis estadístico
Estudiante de
t
-test y ANOVA se utilizaron para investigar la asociación entre la expresión de LSD1 y los factores clínicos (edad, sexo, tabaquismo, estadio tumoral, histología, el tamaño del tumor, estado ganglionar, y la supervivencia global). Se utilizó el análisis de correlación de Pearson para evaluar el grado de correlación lineal entre dos variables. Se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para determinar el valor pronóstico de la LSD1, y log-rank test fue utilizado para comparar la igualdad de las dos curvas de supervivencia. Un
P-valor
& lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo y
P Hotel & lt; 0,01 se consideró altamente significativa. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS v17.0 para Windows (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
Expresión LSD1 es regulada hasta en los tejidos tumorales de NSCLC
primero se examinaron los niveles de expresión de la LSD1 en 80 tejidos tumorales de NSCLC y 20 tejidos pulmonares normales mediante tinción IHC. se detectó la expresión de alta LSD1 en los núcleos de las células malignas, mientras que se observó tinción débil a lo largo de los tejidos no neoplásicos (Fig. 1). Específicamente, se observó la expresión de la LSD1 en 90,0% de los carcinomas de pulmón (72/80) y 10,0% de las muestras de pulmón benignos (2/20). Los altos niveles de expresión de la LSD1 (Puntuación: ++ - +++). Se detectó en 37 (46,3%) los tejidos tumorales de pacientes con CPNM
A continuación examinó la expresión de la LSD1 en 40 tejidos tumorales de NSCLC seleccionados al azar, de pulmón paracarcinoma los tejidos y los tejidos pulmonares normales por transferencia Western. Los resultados revelaron una elevación estadísticamente significativa de la expresión LSD1 en tumores, en comparación con los tejidos pulmonares normales utilizando β-tubulina como la referencia emparejado (dos colas
t
-test, n = 40,
P
& lt; 0,01) (Fig 2A).. El nivel de proteína de la LSD1 en muestras de 122, 206 y 207 se muestran en la Figura 2B.
A fin de validar los resultados anteriores de proteínas, que también examinó los niveles de mRNA de LSD1 en estos 40 tejidos tumorales de NSCLC seleccionados y normales tejidos pulmonares por QRT-PCR utilizando como referencia GAPDH. Se encontró que el nivel de mRNA de LSD1 en tejidos de cáncer (Ct = 19,9 ± 1,01) fue significativamente mayor que en los tejidos pulmonares normales (Ct = 22,1 ± 0,9) (dos colas pareada
t
-test, n = 40,
P Hotel & lt; 0,05) (figura 2C)
expresión LSD1 se asoció con la supervivencia global
Para evaluar la importancia clínica de la LSD1 sobre-expresión en.. cáncer de pulmón, se analizó si los niveles de expresión de la LSD1 se asociaron con la supervivencia global en el CPNM. Como se muestra la Tabla 1, los niveles altos de proteína de la LSD1 se asociaron significativamente con la supervivencia (χ
2 = 12.87,
P = 0,0003
), pero no se correlacionó con ninguna de las características clínico-patológicas (como la edad, el hábito de fumar , el sexo, el diámetro del tumor, el tipo histológico, la invasión de la pleura visceral, el estadio patológico, o tipo de operación; todo,
P Hotel & gt; 0,05). Durante el periodo de seguimiento de 5 años, 52 de los pacientes 80 (65%) de NSCLC murieron como resultado de la progresión de la enfermedad. Las curvas de Kaplan-Meier se indica que los pacientes con una mayor expresión de LSD1 (28 casos) tuvieron una supervivencia global significativamente más corto que aquellos con disminución de la expresión de LSD1 (52 casos) (
P = 0,0003
) (Fig. 3A).
La expresión de la LSD1 en las células de cáncer de pulmón A549 y H460 fue mayor que en las células 293T. El nivel de proteína en la línea celular H460 fue mayor que en la línea celular A549. β-actina se utilizó como control de carga.
La serie de curvas representan la proliferación de células en 0 h a 48 h después de la exposición a diferentes concentraciones de tratamiento pargilina y transfección con los diferentes plásmidos. (A) El inhibidor de LSD1, pargilina (de arriba a abajo: 1 mM, 2 mM, 3 mM y 4 mM), y la LSD1 siRNA inhibe la proliferación de la línea celular A549. La proliferación de las células A549 se redujo significativamente en los diferentes grupos, en comparación con los controles (*
P
& lt; 0,05). (B) pargilina inhibió la supervivencia línea celular H460. Por otra parte, se observó un efecto inhibidor más fuerte en la línea celular H460, pero no hubo diferencias significativas entre las dos líneas celulares. La proliferación de las células H460 se redujo significativamente en los diferentes grupos de concentración, en comparación con los controles (*
P
& lt; 0,05). (C) pargilina inhibió la supervivencia de la línea celular 293T. (D) La curva de proliferación después de la transfección de Flag-LSD1 plásmido en la célula A549 y transfección de LSD1 siRNA plásmido en la célula H460. En las células A549, la proliferación fue significativamente mayor después de la transfección del plásmido Flag-LSD1, en comparación con el control transfectadas con pCMV5 (*
P
& lt; 0,05). En las células H460, la proliferación fue significativamente menor después de la transfección de LSD1 el plásmido ARNsi, en comparación con las células transfectadas con el plásmido de control siRNA (*
P
& lt; 0,05).
Las imágenes se muestran en 20 × magnificación. fluorescencia verde, rojo y azul representan la LSD1, BrdU y Topro-3, respectivamente. La proliferación aumentó significativamente en las células A549 después de la transfección del plásmido Bandera-LSD1. Sin embargo, disminución de la proliferación en las células H460 después de la transfección del plásmido LSD1 siRNA. tratamiento pargilina redujo la proliferación en ambas líneas celulares. Topro-3 tinción muestra la localización nuclear, y la tinción BrdU muestra las células en proliferación.
La velocidad de migración disminuye gradualmente desde 6 h a 48 h después de la transfección del plásmido LSD1 siRNA en las células H460, que se significativamente diferente de la velocidad a 24 h y 48 h (*
P
& lt; 0,05). La tasa de migración aumentó gradualmente después de la transfección de Flag-LSD1 plásmido en las células A549, que fue significativamente diferente de la velocidad a 24 h y 48 h (*
P
& lt; 0,05). Todos los grupos de transfección fueron significativamente diferentes entre los grupos de control (*
P Hotel & lt; 0,05).
De acuerdo con esto, también se determinó que el aumento de la expresión del ARNm de la LSD1 se asoció con disminución de la supervivencia global en pacientes con CPNM (
P Hotel & lt; 0,05). (. La Fig. 3B)
LSD1 Promovido proliferación de líneas celulares de cáncer de pulmón
La expresión de la LSD1 se más baja en la célula A549 que en la línea celular H460, como se muestra en la Figura 4. por lo tanto, el plásmido Flag-LSD1 se transfectó en las células A549 y el plásmido LSD1 siRNA se transfectó en las células H460. Las células epiteliales normales 293T se utilizaron como un control negativo.
Hemos detectado el valor de DO de A549, H460 y células 293T por MTS para generar curvas de crecimiento celular. En las tres líneas celulares, la proliferación celular disminuyó junto con el tratamiento pargilina de una manera dependiente de la concentración. Era notablemente inferior en el grupo de 4 mM tratados que en los grupos 1 mm- o 2 mM tratados. Además, fue también menor en el grupo 1 mM-tratado que en el grupo 3 mM tratados; sin embargo, no hubo diferencias entre el 1 mm- y grupos de 2 mm de tratar o el 3 mm- y grupos de 4 mm tratada (
P
& gt; 0,05)., como se muestra en la Figura 5A-C
la cantidad de células atravesada fue significativamente mayor para las células A549 transfectadas con el plásmido de Flag-LSD1; Sin embargo, la transfección de plásmido LSD1 siRNA en las células H460 llevado a la disminución de cantidades de células invasoras. El número de células invasoras de ambos grupos fueron significativas transfección diferente del grupo de control (*
P Hotel & lt; 0,05).
La expresión de H3K9 totales no cambió notablemente. Cuando la actividad de LSD1 fue hasta reguladas, TWIST1 y N-cadherina expresión aumentó y AcH3K9 y la expresión de E-cadherina se redujo. Cuando se regula por disminución en la actividad de LSD1, TWIST1 y la expresión de N-cadherina y disminuyeron AcH3K9 y la expresión de E-cadherina se incrementaron. El plásmido Bandera-LSD1 se transfectó en la línea celular A549, y el plásmido LSD1 siRNA se transfectó en la línea celular H460. β-actina se utilizó como control de carga
La proliferación aumentó significativamente en el grupo de A549 después de la transfección del plásmido Flag-LSD1 (
P
& lt; 0,05).; sin embargo, se redujo significativamente en el grupo H460 después de la transfección del plásmido LSD1 siRNA (
P
& lt; 0,05). El plásmido pCMV se utilizó como control en el grupo de A549 de la transfección, y el plásmido de control LSD1 siRNA se utilizó en el grupo de la transfección de células H460 (Fig. 5D).
Se identificaron aún más la función de LSD1 en A549 y la proliferación de células H460 mediante tinción de inmunofluorescencia. El cambio en el número de células proliferantes se observó por tinción con BrdU. Los resultados demostraron que la proliferación celular fue significativamente mayor después de la transfección del plásmido LSD1 sobre-expresión en la línea celular A549. Mientras tanto, la proliferación celular se redujo en las células H460 transfectadas con el plásmido de LSD1 siRNA. Disminuyó en ambas líneas celulares después del tratamiento pargilina, como se muestra por la tinción de inmunofluorescencia (Fig. 6), que también confirmó que la LSD1 está implicada en la proliferación de células tumorales.
LSD1 promovió la migración de las células del cáncer de pulmón
la migración celular se investigó mediante el ensayo cero celular. En comparación con el grupo control, el número y la tasa de células migradas se redujo gradualmente después de la transfección con LSD1 siRNA plásmido en las líneas de células H460. Las células que migran alcanzaron un pico a las 48 h, como se muestra en la Figura 7A. En contraste, el número de células migradas se incrementaron significativamente en la línea celular A549 después de la transfección con Flag-LSD1 plásmido, en comparación con el grupo control (
P
& lt; 0,05). La velocidad relativa de la migración se muestra en la Figura 7B.
El papel de la LSD1 en cáncer de pulmón invasión
La capacidad de las células para cruzar Matrigel indicó la invasividad de la A549 y líneas de células H460. células H460 transfectadas con siRNA LSD1 plásmido eran menos invasiva que el grupo de control (
P
& lt; 0,05). células A549 transfectadas con Flag-LSD1 plásmido eran más invasivos que las células control y células tratadas con pargilina (tanto,
P
& lt; 0,05). La cantidad de células invasoras que cruzan a través de la membrana basal de matrigel se muestra en la Figura 8.
LSD1 Regulado epitelio-mesenquimal transición (EMT) en células de cáncer de pulmón
Para investigar si la LSD1 regula la transición EMT en las células del cáncer de pulmón, hemos examinado la expresión de la EMT transcripcional TWIST1 clave represor y los marcadores de EMT e-cadherina y N-cadherina en células A549 LSD1--sobreexpresan (transfectadas con la bandera-LSD1 LSD1 sobre-expresión de plásmido) y LSD1 derribado células H460 (transfectadas con el plásmido LSD1 siRNA, o tratados con pargilina 4 mM). Se examinaron los efectos sobre H3K9, AcH3K9, TWIST1, E-cadherina y la expresión de N-cadherina inducida por la alteración de la actividad de LSD1. Mientras que la expresión de H3K9 total fue afectada, la LSD1 sobreexpresión condujo a la disminución de la expresión de acetilación H3K9 y E-cadherina y el aumento de TWIST1 y la expresión de N-cadherina. Mientras tanto, los niveles de acetilación H3K9 y la expresión de E-cadherina se incrementaron en LSD1 derribar las células, lo que sugiere que la expresión de LSD1 podría estar correlacionado con AcH3K9, TWIST1, E-cadherina y la expresión N-cadherina, como se muestra en la Figura 9.
Discusión
en los últimos años, la epigenética se ha convertido en un tema candente en la investigación del cáncer. El saldo de metilación y desmetilación en la modificación epigenética afecta a la expresión de genes y la actividad celular. Los estudios han demostrado que la metilación aberrante de la histona lisina en el cáncer está asociado no sólo con la represión de la cromatina relacionados con genes específicos, pero también con la represión de grandes regiones cromosómicas. Los cambios epigenéticos en la LSD1 han demostrado que desempeñan un papel clave en la carcinogénesis [17]. LSD1 puede prevenir la acumulación de los grupos de dimetilo de p53, la represión transcripcional de p53 mediada por la regulación, prevención de la apoptosis, y contribuir a la carcinogénesis humana a través de un mecanismo de modificación de la cromatina.
Hasta la fecha, sólo unos pocos estudios han implicado LSD1 en el CPNM. Hayami
et al.
Demostró que siRNAs-LSD1 específica golpeó significativamente la expresión de la LSD1 y dio lugar a la proliferación suprimida de varias células de cáncer de pulmón [11]. Sin embargo, la asociación entre la LSD1 y la supervivencia de los pacientes con CPNM no estaba bien definida, y el papel de la LSD1 en la proliferación, la migración y la invasión en el CPNM era oscura. Nuestro estudio investigó las asociaciones de expresión LSD1 y las características clínicas de los pacientes con CPNM con diagnóstico de fase I /II. Con el fin de demostrar que los cambios epigenéticos se asociaron con cambios genéticos en cáncer de pulmón, lo primero que investigó la expresión de LSD1 en muestras clínicas de NSCLC.
Estudios anteriores demostraron que la proteína de LSD1 y los niveles de ARNm podrían actuar como biomarcadores para pacientes con tumores más agresivos de cáncer de mama, cáncer de próstata, y neuroblastoma [18] - [20]. En nuestro estudio, hemos detectado la LSD1 por análisis IHC, Western Blot, y QRT-PCR. Un punto fuerte de esta investigación es el descubrimiento de que la expresión de la LSD1 se correlacionó significativamente con la supervivencia global de los pacientes con CPNM. Nuestra investigación actual se investigó el papel de la LSD1 en el CPNM. Otros estudios sobre la LSD1 en otros tipos de tumores pueden revelar que los pacientes con niveles más altos de la LSD1 (independientemente de ARNm o proteína y /o independientemente del tipo de tumor primario) tienen una menor supervivencia que los pacientes con niveles más bajos de la LSD1.
además demostró que la LSD1 era importante para la proliferación de células de cáncer y la invasión. LSD1 inducida por la activación de la proliferación, la migración y la invasión en las células tumorales se inhibe por pargilina. El descenso de regulación de la expresión de la LSD1 de siRNA en líneas celulares tumorales condujo a un aumento del crecimiento celular, la migración y la invasión. Estos datos sugieren que la LSD1 puede influir en la transformación de las células tumorales y también puede promover la EMT en el epitelio pulmonar. La investigación adicional debe llevarse a cabo con el fin de determinar si la sobreexpresión de la LSD1 es un evento temprano o tarde en la tumorigénesis de pulmón y cuál es el mecanismo de expresión sobre-es. Hemos presentado datos que sugieren que la LSD1 está regulado en la vía de la promoción de tumores de cáncer de pulmón y que actúa para aumentar el crecimiento celular, la migración y la invasión, y para restaurar un fenotipo epitelial transformado. supresión farmacológica de LSD1 puede representar un enfoque prometedor para el tratamiento de NSCLC
.
Además se requiere un análisis funcional para determinar la red de regulación de LSD1. Transcripcional análisis reveló que los complejos de LSD1 /NuRD regulan varias rutas celulares de señalización [21], incluyendo la vía de señalización TGFß1 que está involucrado críticamente en la proliferación celular, la supervivencia, y la transición epitelio-mesenquimal. Hemos demostrado que la LSD1 promovió la invasión y potencial metastásico de células de cáncer de pulmón
in vitro
. También se encontró que la LSD1 está regulado en los carcinomas de pulmón y que su nivel de expresión se correlaciona negativamente con la de AcH3K9, TWIST1 y N-cadherina, y positivamente correlacionada con la de la E-cadherina. Nuestros datos proporcionan una base molecular para la interacción de la desacetilación de histonas en la remodelación de la cromatina, lo que indica que la LSD1 puede afectar a la EMT y la acetilación de H3K9.
El aberrante sobre-expresión de la LSD1 en el cáncer de pulmón puede hacer que sea un buen candidato como un objetivo terapéutico molecular [11]. Este tipo de información también indica que debemos continuar el desarrollo de la nueva terapia contra el cáncer basada en el estado epigenético. Ya que tiene implicaciones para el descubrimiento de marcadores epigenéticos, una pregunta importante para resolver es cómo definir objetivos potenciales para la terapia epigenética. Los fármacos de primera generación dirigidas a los metilación del ADN y la acetilación de histonas modificadores relativamente promiscuos han tenido éxito en el tratamiento de cánceres hematológicos [22]. Si la inhibición de LSD1 conduce a la significativa de la represión de algunos genes, la LSD1 podría ser un objetivo importante alternativa para la terapia. Control epigenético de la regulación de genes es un campo en rápido desarrollo con el potencial sustancial, y oncología es probable que sea la aplicación terapéutica en la que se hace el progreso más rápido. Hasta la fecha, los inhibidores sintéticos de las histonas desacetilasas clásicos han sido ampliamente utilizados como herramientas biológicas para estudios epigenéticos, y algunos han avanzado a los estudios clínicos. Además, el desarrollo de inhibidores de la metiltransferasa de histona y desmetilasa Recientemente se ha informado [21], [23]. En el cáncer de pulmón, la sobre expresión de LSD1 debe contribuir a la represión de genes para inhibir el crecimiento celular y la progresión maligna, pero donde no se desconoce un propósito real de LSD1. Tenemos la intención de investigar esto en futuros estudios.
En conclusión, hemos encontrado que la LSD1 estaba sobreexpresado en pacientes con CPNM, a través temprano para las últimas etapas de la carcinogénesis. LSD1 está presente en el núcleo y promueve la proliferación, posiblemente a través de la regulación de una amplia variedad de funciones de la cromatina. Mientras tanto, la sobre expresión de LSD1 promovido células tumorales proliferación, la migración y la invasión. Además de validación con los análisis funcionales de esta proteína en el contexto de la carcinogénesis humana pueden ayudar en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer de pulmón.