colorrectal se necesitan con urgencia
Resumen
Los biomarcadores y nuevas dianas terapéuticas en el cáncer colorrectal (CCR). La quinasa del receptor de la tirosina de pseudo 7 (PTK7) está implicado en la polaridad celular planar y está desregulado en diversos tumores malignos, incluyendo CRC. Sin embargo, poco se sabe sobre su expresión de la proteína en el CCR humana, o sobre una posible correlación de su expresión con puntos finales clínicos. El uso de un microarray de tejido clínicamente anotado (TMA) producido a partir de 192 pacientes con CRC consecutivos tratados por cirugía inicial, se analizó la expresión PTK7 por inmunohistoquímica en el tejido tumoral y mucosa normal correspondiente, y su expresión se correlacionó con las características clínico-patológicas y los resultados del paciente. Se encontró PTK7 agotamiento por shRNA específica en HCT116 y líneas celulares HCT15 CRC para afectar la proliferación celular, la resistencia a las drogas y la migración celular. El crecimiento del tumor y el fenotipo metastásico fueron investigados
in vivo
utilizando un modelo de ratón con xenoinjerto de células CRC con la expresión modulada de niveles PTK7. PTK7 fue significativamente hasta reguladas en el tejido CRC en comparación con las mucosas sanos de la misma, y la sobreexpresión significativa se encontró en el 34% de los pacientes. PTK7 sobreexpresión se asoció significativamente con una menor supervivencia libre de metástasis en pacientes no metastásicos. En las células HCT116 y HCT15, shRNA PTK7 reduce la migración, pero no afectó la proliferación de células y la resistencia a las drogas. En un ratón de xenoinjertos de células HCT15, regulación a la baja de PTK7 condujo a un crecimiento tumoral reducida, mientras que su sobreexpresión en las células cancerosas PTK7-negativos provocado un aumento de los eventos metastásicos. por lo tanto la expresión PTK7 representa un potencial biomarcador pronóstico y una nueva diana terapéutica en el CCR
Visto:. Lhoumeau A-C, Martínez S, Boher J-M, G Monges, Castellano R, Goubard A, et al. (2015) La sobreexpresión de la Promigratory y Prometastatic PTK7 receptor se relaciona con unos resultados clínicos adversos en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (5): e0123768. doi: 10.1371 /journal.pone.0123768
Editor Académico: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG
Recibido: 2 Octubre, 2014; Aceptado: February 21, 2015; Publicado: 11-may 2015
Derechos de Autor © 2015 Lhoumeau et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel y su apoyo a los archivos de información
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Ligue Nationale de la Contra el cáncer (Etiqueta de la Ligue JPB) http://www.ligue-cancer.net/, Fondation pour la Investigación Médica (ACL) http://www.frm.org/, Región PACA (SM) http://www.regionpaca.fr/, Siric (Inca-DGOS-Inserm 6038) http://www.oncopaca.org /fr /. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Con 447 000 casos y 215 000 muertes por año en Europa, el cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo un importante problema de salud pública [1,2]. Integración de 5-FU y la quimioterapia adyuvante basada en oxaliplatino a la resección quirúrgica en el nodo-positivo pacientes ha mejorado la supervivencia [3,4], pero un número significativo de estos pacientes sigue siendo en última instancia, la recaída y morir de la enfermedad metastásica. En el mismo tiempo, los pacientes con ganglios negativos normalmente no son tratados con un tratamiento sistémico adyuvante, mientras que algunos de ellos podrían beneficiarse de esta estrategia [5]. Por lo tanto, se necesita urgentemente la identificación de biomarcadores válidos y sólidos que pueden distinguir a un grupo de pacientes que presentan un riesgo significativo de recurrencia. Además, a pesar de que algunas terapias dirigidas moleculares han contribuido a aumentar la supervivencia en CCR metastásico [6-9], ninguno de ellos se ha demostrado que mejora la supervivencia en el tratamiento adyuvante [10,11]. Por lo tanto, todavía es ansiosamente necesario identificar agentes moleculares que juegan un papel relevante en la biología del cáncer de colon y pueden servir como objetivos para nuevas terapias biológicas.
El receptor de superficie celular PTK7, también conocido como carcinoma de colon quinasa-4 (CCK-4), es un miembro conservada evolutivo de la superfamilia del receptor tirosina quinasa, que se identificó primero en melanocitos humanos normales [12] y en el carcinoma de colon humano [13]. Compuesto de siete dominios de inmunoglobulina extracelulares, una región transmembrana y un dominio de tirosina quinasa intracelular, que tiene una actividad de cinasa defectuoso y no ligando conocido. Aunque su papel biológico exacto no está claro, la evidencia reciente ha vinculado PTK7 a la polaridad celular plana (PCP) vía [14]. Mientras que la polaridad apico-basal organiza la unión de células epiteliales a lo largo de un eje XY, PCP controla la posición de las células dentro del plano de una estructura epitelial, garantizando que se orientan en la misma dirección, y por lo tanto juega un papel importante en diversos procesos de desarrollo, incluyendo la diferenciación y los movimientos de las células epiteliales [15]. Es de destacar que la desregulación de la PCP puede causar diversos trastornos patológicos, incluyendo el cáncer. reguladores bien conocidos de PCP incluyen ligandos Wnt y receptores Frizzled (Fz), que activan el adaptador Dishevelled en la membrana plasmática, e inician la llamada vía de Wnt, ya sea en su canónica (β-catenina-dependiente) o no canónica (β-catenina-independiente) organización [16]. PTK7 fue sugerido para regular PCP ya que su mutación en Xenopus o en el ratón dio lugar a trastornos del desarrollo relacionados con el PCP-evidentes, incluyendo defectos de cierre del tubo neural [17,18]. Además, PTK7 ha demostrado interactuar directamente con Dishevelled, llevando a su reclutamiento en la membrana y la posterior fosforilación /activación por FZ7 [19]. Nosotros y otros han demostrado que PTK7 también puede activar la vía Wnt canónica de una manera dominio quinasa dependiente de [18,20].
Recientemente, se encontró PTK7 que se sobreexpresa en varios cánceres humanos, incluyendo tumores epiteliales tales como gástrico, de mama, el esófago, el conducto biliar y los cánceres de pulmón [21-26], sino también en el sarcoma [27] y en neoplasias hematológicas, incluyendo leucemias mieloides agudas y crónicas [28-30]. Sorprendentemente, mientras que PTK7 fue descrita por primera vez en líneas celulares de cáncer de colon humano [13], no hay datos están actualmente en cuanto a su expresión de la proteína en los tejidos de los pacientes clínicamente CRC anotados. Por lo tanto, hemos evaluado la expresión de proteínas PTK7 en un TMA compuesto de CRC tejidos primarios y mucosas sanos emparejados, y se evaluó posibles correlaciones de su expresión con parámetros clínicos y patológicos convencionales, así como con el resultado del paciente. expresión PTK7 se muestra por lo tanto que se asocia con el resultado metastásico y reducción de la supervivencia en pacientes con CRC no metastásicos. Estamos entonces a analizar el impacto de la modulación de su expresión en modelos preclínicos y encontramos que PTK7 induce un fenotipo pro-migratoria y pro-metastásico, en consonancia con los datos clínicos.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el estudio fue aprobado por el Institut Paoli-Calmettes (IPC) Junta de Revisión Institucional (IRB, Comité d'Orientación Stratégique, COS). El IRB no consideró como obligatorios para obtener el consentimiento informado de los pacientes, pero los datos fueron analizados después de todo la información del paciente han sido totalmente anónima. Para la investigación con animales, todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices francesas para el manejo de los animales y aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal de Marsella (C2EA-14). Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicos, en jaulas ventiladas por separado (TECNIPLAST, Francia, Sealsafe Plus ratón-ratón Línea Verde IVC) con 4-5 compañeros.
Todos los ratones se les permitió el libre acceso a autoclave y se filtra el agua y los alimentos irradiados en un ciclo de luz de 10-14 horas /oscuro, con una temperatura ambiente de 21 ± 2 ° C y una humedad de 55 ± 15%. Todas las jaulas contenidas virutas de madera, ropa de cama y un nido de lana de madera de álamo (Anibed, Francia) para el enriquecimiento ambiental.
En el postoperatorio, el dolor se alivia con la administración subcutánea de meloxicam (Metacam inyectable, Boehringer Ingelheim, 1 mg /kg una vez al día durante 3 días) y Baytril (Bayer) -supplemented agua se administró adicionalmente a ratones durante 7 días antes de xenoinjertos para la prevención de la infección durante 3 semanas después de la cirugía.
matanza compasiva de los ratones se realizó a través la anestesia dióxido de carbono inhalado de acuerdo con el Comité de Ética de Experimentación Animal de Marsella (C2EA-14)
pacientes y tejidos
Archivo tejidos de 192 pacientes consecutivos con estadios I a IV de carcinoma colorrectal (CCR ) tratados en nuestra institución (Institut Paoli-Calmettes, Marsella, Francia) mediante la resección quirúrgica inicial fueron recogidos entre 1990 y 1998. la estadificación utilizaron el American Joint Committee on Cancer criterios [31]. Todas las muestras fueron fijadas con formalina y embebidos en parafina, y se evalúan en el departamento de Biopatología. Los pacientes recibieron quimioterapia adyuvante basada en 5-FU en caso de compromiso de los ganglios linfáticos o metástasis de acuerdo con las recomendaciones estándar. Después de la finalización del tratamiento, la vigilancia se lleva a cabo a intervalos de 3 meses durante los primeros 2 años y en intervalos de 6 meses a partir de entonces. Los pacientes fueron controlados por la recaída metastásica por el examen clínico y los análisis de sangre, anual radiografía de tórax y ecografía hepática y /o tomografía computarizada. Las características clínicas y patológicas, así como las características de resultados fueron extraídos de la base de datos institucional mantenida prospectivamente. Además, para investigar las posibles diferencias en la expresión PTK7 entre metastásico y tejidos primarios, metástasis hepáticas 7 PTK7-positivo y emparejado CRC primaria fueron seleccionados para inmunohistoquímica comparativa.
microarrays de tejidos construcción
TMA se prepararon como se ha descrito anteriormente [32,33]. Para cada muestra, 3 áreas representativas fueron seleccionados de una sección de hematoxilina-eosina-manchado de un bloque donante. cilindros de núcleo con un diámetro de 0,6 mm fueron perforados y poner en 3 bloques de parafina receptor separados usando un dispositivo de agrupación específica (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, EE.UU.). El bloque receptor contenía pares de tumor y mucosa normal, así como los tejidos normales y benignos de control (intestino delgado, adenomas) y pellets línea celular. Cinco micras secciones del bloque de TMA resultantes se utilizaron para el análisis IHC después de la transferencia en portaobjetos de vidrio. Dos líneas celulares de cáncer de colon (CaCo2, HT29) y una línea celular de cáncer gástrico (TGH1) se utilizaron como controles.
análisis de inmunohistoquímica
Para PTK7 tinción de IgG de cabra anti-humano /ratón /PTK7 rata /CCK-4 anticuerpo policlonal purificado por afinidad se obtuvo de I + amp; D Systems (Minneapolis, MN, USA). Deparaffinisation se realizó en Histolemon (Carlo Erba Reagenti, Rodano, Italia) y las secciones se rehidratada clasificado en el alcohol. Para la mejora de antígeno, las secciones se incubaron primero en solución Target Retrieval (Dako, Glostrup, Dinamarca). reacciones de tinción se realizaron a temperatura ambiente con una tinción automática (Dako Autostainer) y se llevaron a cabo de la siguiente manera: después de lavados en tampón de fosfato apropiado, seguido de inactivación de la actividad de la peroxidasa endógena con H2O2 al 3%, los portaobjetos se bloquearon primero con suero (Dako) durante 30 min y después se incubó con el anticuerpo PTK7 anteriormente descrito para 1 h (dilución 1/200). Después de lavados, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo biotinilado contra inmunoglobulina de cabra (dilución 1/200; Dako) durante 25 min y luego por la peroxidasa conjugada con estreptavidina (Dako REALkit). Diaminobencidina se utilizó como cromógeno. Hematoxilina se utilizó para la contratinción, y cubreobjetos fueron montados usando solución Curemount (Instrumedics, Hackensack, EE.UU.). Ellos fueron examinadas bajo un microscopio de luz por dos patólogos (GM, FP). Se trataron los siguientes parámetros: intensidad de la tinción (0: ausente, 1: bajo, 2: medio, 3: alto)., porcentaje de células teñidas, y las características de tinción (núcleo, membrana citoplasmática o tinción)
Para tinción Ki67 IgG de ratón, anti-humano Ki67 clon se utilizó MIB-1 de Dako como se describe anteriormente [34].
líneas celulares y cultivo celular
Las líneas celulares de CRC, HCT116 y HCT15 , fueron proporcionados por la ATCC. células HCT116 y HCT15 se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina.
Cultura de células L, la producción Wnt5a /Wnt3a, y ensayos de B16F10 in vivo de metástasis
Ver Materiales y Métodos S1.
Diseño del shRNA específica y la producción de partículas virales
shRNA secuencias específicas para las construcciones fueron diseñadas PTK7 como se describe en Materiales y Métodos S1. Estos oligonucleótidos se compraron de Invitrogen, Francia y se clonaron en vector pLKO.1-GFP usando AgeI y EcoRI sitio de restricción. Se utilizó un scramble no director shRNA como control
Las partículas virales que contienen shRNA fueron producidas por transfección transitoria de células HEK 293T con vectores del sistema de envasado (pspax:. plásmido 12260 y VSVG: 12259 plásmido, Addgene, Cambridge, EE.UU. ) y pLKO.1-shRNA-GFP. sobrenadantes virales se recogieron 48 h después de la transfección, se filtraron y se utilizaron para infectar HCT 116 y HCT15 células en presencia de 4μg /ml de polibreno. eficiencia de infección fue controlada por la expresión de GFP en células infectadas. Las células fueron ordenados por citometría de flujo utilizando la expresión de GFP (BD Aria2, Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.) y la eficiencia shRNA fue controlado por Western Blot y análisis de QRT-PCR.
La extracción de proteínas y
immunobloting
Las células se lisaron en tampón de lisis (50 mM de Hepes, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM de EGTA, 10% de glicerol, 1% Triton X-100, 25 mM NaF, 10μM ZnCl2) suplementado con 0,5 mm de fenilmetilsulfonilo fuoride (PMSF), ortovanadato 1 mM, 1 mM de β-glicerofosfato y un cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich, EE.UU.). Los lisados se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Los sedimentos se descartaron y la concentración de proteína se ajustó usando el ensayo de Bradford (BioRad). Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a filtros de nitrocelulosa, bloqueadas 1h a temperatura ambiente en Tris-Buffered Saline /5% de leche sin grasa seca /0,1% de Tween 20, y se transfirieron durante la noche con anticuerpos primarios en solución de bloqueo (monoclonal de rata anti-PTK7 generada en el laboratorio; anticuerpo de ratón monoclonal αTubulin, Sigma-Aldrich, EE.UU.). Después de extensos lavados en TBS /Tween 20 al 0,1%, los filtros se incubaron 1 hora a temperatura ambiente (RT) con un anticuerpo secundario conjugado con HRP antes de ser revelado con un sustrato de quimioluminiscencia (West Pico, Thermo Scientific, EE.UU.). La adquisición se realizó con una cámara G-BOX (Ozyme, Francia).
Análisis cuantitativo de RT-PCR
El ARN total fue aislado utilizando RNeasy mini kit (Qyagen, Países Bajos). Los sedimentos de ARN eran y se disolvió en agua ultrapura se secó al aire. Se generó ADNc con alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit (Applied Bio-Systems, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. SYBR Premezcla se preparó con los cebadores 10 pm y la plantilla 1μL ADNc. QRT-PCR en placas ópticas de 96 pocillos se realizó utilizando los reactivos anteriores, y los productos fueron analizados en un ABI Prism 7500 (Applied Bio-Systems, USA). El nivel de expresión de PTK7 se normalizó con GAPDH y representa como una expresión relativa. Las sondas fueron los siguientes: PTK7 fwd 5 'ATTTCCAAGAG CAGTTCCTGAGG -3 y rev 5'-TGCATAGGGCCA CCT TC-3'; fwd GAPDH 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGT-3 'y 5'-rev AAGCTTCCCGTTCTCAG-3'
La proliferación celular ensayo
La proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de CellTiter 96 (Promega, EE.UU.). Las células se sembraron a una densidad de 5000 células en placas de 96 pocillos y se incubaron en DMEM que contenía 10% de FCS durante el tiempo indicado. A continuación, las placas se incubaron con CellTiter 96 a 37 ° C durante 2 h. La absorbancia a 490 nm se midió utilizando un lector de placas de 96 pocillos.
ensayos de resistencia a los medicamentos
Las células se sembraron a una densidad de 5 000 células en placas de 96 pocillos y se incubaron en DMEM que contiene 10% FCS para las 24h. Después, se añadieron fármacos (irinotecan, 5-fluorouracilo y cisplatino) y las células se incubaron adicionalmente durante 72 h CellTiter 96 se añadió a continuación y las placas se incubaron a 37 ° C durante 2 h. La absorbancia a 490 nm se midió utilizando un lector de placas de 96 pocillos.
La migración de células de ensayo
Las células se sembraron a una densidad de 5 000 células en placas de 6 pocillos recubiertos previamente con colágeno I y eran se incubaron durante 24 h. Luego, las células se mueren de inanición durante la noche y se estimularon con DMEM% de FCS o DMEM sin FCS 10 como control. La migración celular se midió mediante el seguimiento de células usando vídeo-microscopía y software Metamorph (Molecular Device) durante 8 h.
modelos de xenoinjerto de ratón
NOD /SCID (diabético no obeso /grave inmunodeficiencia combinada) /? c ratones nulos (GSN) se obtuvieron de Charles River Laboratory (Francia). HCT15 células que expresan shCTRL o shPTK7 fueron infectadas con el vector lentiviral que expresa LUC2 y 2,10
6 células fueron inyectadas por vía subcutánea en ratones 9 semanas de edad (NSG peso: 25 g). LUC2 nivel de expresión fue controlado antes de la inyección. el desarrollo tumoral se siguió durante 8 semanas y se calculará según la fórmula V = 0.52x (L x A
2). En el día 50, la resección del tumor se realizó y se midió el peso del tumor. Entonces, el desarrollo de metástasis fue seguida por análisis de bioluminiscencia usando fotones imageur (Biospace Lab, Paris, Francia). Tras la aparición de señales metastásicos o terminación del análisis (día 130), los ratones fueron sometidos a autopsia y se realizó la luminiscencia de órganos. Análisis de imágenes se realizó utilizando el software de visión M3 (laboratorio Biospace). Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices francesas para el manejo de los animales.
El análisis estadístico
Comparación de la distribución variable categórica se realizó mediante χ2 o la prueba exacta de Fisher. Para las variables continuas, se utilizaron la prueba t de Student y el test no paramétrico de Mann-Whitney. El seguimiento se calcula desde el diagnóstico hasta la fecha de la última noticia para los pacientes vivos. la supervivencia libre de metástasis (MFS) se midió desde el diagnóstico hasta el primer evento metastásico o la muerte. Para los pacientes sin recidiva metastásica o la muerte en el momento de la última visita de seguimiento, la censura se llevó a cabo en la fecha de la última de seguimiento. La supervivencia global (OS) se midió desde el diagnóstico hasta la muerte o la fecha del último seguimiento. Supervivencias se estimaron con el método de Kaplan-Meier y se compararon entre grupos con la prueba de log-rank. Para el análisis multivariante, se utilizó un modelo de riesgos proporcionales de Cox. Los datos se presentan de acuerdo con las recomendaciones de informes de marcador tumoral estudios de pronóstico (observación) [35]. Con el fin de comparar las curvas de crecimiento del tumor en experimentos preclínicos, se realizó ANOVA de dos vías. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras. Se realizaron análisis estadísticos, ya sea con la versión de software 2.15 R o software Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.)
Resultados
PTK7 proteína está regulada de manera significativa en marcha en el CCR
con el fin de comprender mejor el papel de PTK7 en la tumorigénesis colorrectal, se analizó su expresión de proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica en una TMA contiene tejidos tumorales de 192 CRC primarias (las características clínicas de los cuales se muestran en S1 Tabla) y la mucosa normal correspondiente. PTK7 inmunotinción podría evaluarse en 138 CRC (72%) y 142 tejidos normales (74%), respectivamente. Se detectó la expresión PTK7 en tumores primarios de 78 pacientes (56%), con una intensidad de 2 o 3 en 48 pacientes (35%) y una localización subcelular esencialmente citoplasmática (Figura 1A y 1B). En comparación, sólo 32 pacientes (22%) tuvieron inmunotinción detectable en la mucosa normal correspondiente, con una intensidad de 2 o 3 en 20 pacientes (14%) (p = 1.91.10
-8, prueba de chi-2; 1A y 1B). Por otra parte, cuando se expresó PTK7, el número promedio de porcentaje de células positivas fue del 31% (IC del 95%: 25-37%) en el tejido tumoral frente al 2% (IC del 95%:. 1.2 a 3.8%; p = 5,74 10
-14, Mann-Whitney U Test) en la mucosa normal correspondiente (figura 1C y 1D). Utilizando un punto de corte de al menos 10% de células positivas con una intensidad de 2 o más (que será utilizado a partir de entonces como definición de PTK7 sobreexpresión), 47 pacientes tenían la sobreexpresión PTK7 detectable en el tejido tumoral (34%), pero sólo 3 en mucosa normal (2%) (Fig 1D). Por lo tanto, PTK7 se sobreexpresa en un número significativo de CRC primaria, pero no o apenas en el tejido normal
A- PTK7 expresión mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC) en TMA contiene tejidos CRC primarias:. Tinción de núcleos de tumor que muestra alta ( panel superior) y ninguna expresión /baja (panel inferior) en tejidos de cáncer de representación (aumento x 400). Intensidad B- de PTK7 tinción por IHC en CRC primaria y mucosa normal correspondiente: tinción se clasificó como 0, 1+, 2+ y 3+ como se describe en la sección de materiales y método. Las proporciones se compararon mediante Chi-2 prueba. C-porcentaje medio de células con tinción PTK7 en CRC primaria y la mucosa normal correspondiente. núcleos tumorales D- de CRC primaria que muestran sobreexpresión PTK7 (como se define por la tinción de 10% de las células o más, con una intensidad de 2 o más) y mucosa normal emparejado (aumento x 400). Los porcentajes se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney. *** = P & lt; 0,001. E- análisis de Kaplan-Meier de la libre de metástasis (derecha) y global (izquierda) supervivencias de los pacientes con CCR no metastásico acuerdo con PTK7 sobreexpresión de TMA. Supervivencias se compararon mediante la prueba de log-rank.
PTK7 sobreexpresión se asocia con una baja supervivencia en CCR no metastásico
Hemos investigado si la sobreexpresión PTK7 se correlacionó con las principales características clínicas y patológicas. Como se muestra en S2 tabla, no se encontró asociación significativa entre PTK7 sobreexpresión y parámetros como la edad, el sexo, el colon o la ubicación del recto, el estadio del tumor, extensión ganglionar, estadio metastásico, la invasión linfovascular (LVI), el grado de diferenciación y mucosas coloide componente. Es de destacar que hubo una tendencia no significativa hacia una menor expresión en los tumores con inestabilidad de microsatélites fenotipo-alta. a continuación, nos centramos en estadio I-III, los pacientes M0 CRC y evaluamos el impacto de PTK7 sobreexpresión en la supervivencia. Por el análisis univariado, junto con la implicación de los ganglios linfáticos y el componente mucosa coloidal, PTK7 sobreexpresión se asoció con una reducción significativa MFS (Tabla 1). El MFS 5 años fue del 75,7% (IC del 95%: 65 a 88,1%) en los tumores PTK7-negativas frente al 54% (IC del 95%: 38,8 a 75%) en los tumores PTK7-positivos (HR = 2,1 [1-4,1] ; p = 0,034, prueba de log-rank; la figura 1E). En el análisis multivariante, sólo el componente mucosa coloide retenido valor pronóstico independiente para el MFS, pero PTK7 acercó a la significación estadística (Tabla 1). Se observaron tendencias similares en términos de supervivencia global (figura 1E, Tabla 1). Por lo tanto, PTK7 sobreexpresión en CCR no metastásico se asoció con un resultado adverso. Para investigar las posibles diferencias entre los tumores primarios y metastásicos, se examinaron tejidos primarios adicionales a partir de una pequeña cohorte de 7 metástasis hepáticas PTK7-positivo. En todas las muestras, la expresión PTK7 fue similar en ambos tejidos (Fig S1) guía empresas
PTK7 regulación a la baja no afecta a la proliferación celular y la resistencia a las drogas, sino que reduce la migración de células de líneas celulares humanas CRC
Para investigar la base biológica del aumento de la agresividad en PTK7 sobreexpresión de CRC, establecimos un modelo desmontables de PTK7 en líneas celulares humanas CRC HCT15 y HCT116, que expresan una gran cantidad de PTK7 endógena (figura 2A). Las células fueron infectadas con lentivirus que expresan un control no la orientación shRNA (shCTRL) o dos shRNA diferentes dirigidos PTK7 (shPTK7-1 y shPTK7-2) y la eficiencia de PTK7 caída se verificó en ARNm y los niveles de proteína (Fig 2A y 2B).
nivel de expresión PTK7 en shCTRL- o shPTK7 (1 y 2) líneas celulares HCT15 infectado con HCT116 y se comprobó mediante western blot (a) y Q-PCR análisis (B). La viabilidad celular se cuantificó por ensayo de valoración de células durante 3 días (C-D). La viabilidad celular de shCTRL- y shPTK7 (1 y 2) infectados con HCT15 células se evaluó mediante ensayo de valoración de células, 72 h después de la adición de cisplatino, irinotecan y 5-fluorouracilo (E).
después se analizó el efecto de PTK7 sobre la proliferación celular y la supervivencia usando un ensayo de valoración de células. En este ensayo de proliferación, regular por disminución la expresión de PTK7 en las líneas celulares HCT15 y HCT116 no tuvo efecto sobre la capacidad proliferativa de las células cancerosas (Figura 2C y 2D). Debido PTK7 está implicado en vías de Wnt, hemos comprobado si su impacto potencial sobre la proliferación podría ser dependiente de la estimulación ligando Wnt [14,18]. Por lo tanto, la proliferación se examinó en presencia de medio condicionado de células L que expresan Wnt3a y Wnt5a, que son conocidos activadores de rutas canónicas y no canónicas, respectivamente. Sin embargo, incluso bajo la estimulación Wnt, que no detectó ningún impacto de expresión PTK7 sobre la proliferación celular CRC (S2 figura).
previamente encontró que la expresión PTK7 mejora la resistencia a fármacos en células de leucemia mieloide aguda [28]. Por lo tanto, para examinar su impacto en la resistencia a los medicamentos en las líneas celulares de CRC, se evaluó la viabilidad celular de las células que expresan HCT15 o no PTK7 después del tratamiento por diferentes dosis de cisplatino, irinotecan y 5-FU. Como se muestra en la Figura 2E, la regulación negativa de la expresión PTK7 no confería sensibilidad suplementaria de HCT15 a los citotóxicos. Resultados similares se obtuvieron con HCT116 (Figura S3).
A continuación se investigó el papel de PTK7 en la migración celular. HCT15 células se mueren de inanición durante 24 horas, luego se estimularon con FCS y la migración celular fue seguido por el seguimiento en vivo de células. Cuando se añadió FCS como un factor estimulante, la migración de células HCT15 shCTRL aumentó en 2,5 veces. Sin embargo, en las células HCT15 desmontables-PTK7, se abolió la migración inducida por el FCS. Se encontraron resultados similares para las células HCT116 (Figura 3A y 3B). Por lo tanto, la expresión PTK7 no afecta ni a la proliferación celular o la resistencia a los medicamentos, pero confiere capacidades pro-migratorias de CRC líneas celulares humanas.
shCTRL- y shPTK7 (1 y 2) con infección por HCT15 células se mueren de inanición durante la noche y se incubaron con o sin FCS. La migración celular se midió mediante el seguimiento de células usando vídeo-microscopía y software Metamorph. Distancia de la migración se calculó para cada condición y las medias se compararon mediante la U de Mann-Whitney U Test (A). cursos migratorias representativos se muestran en (B).
PTK7 regulación a la baja reduce el crecimiento tumoral y la metástasis desarrollo en modelos de ratones de xenoinjerto
Para examinar la actividad tumorigénico de PTK7
in vivo
, que por vía subcutánea trasplantaron células HCT15 bioluminiscentes (shCTRL o shPTK7) en ratones GSN y supervisado tanto el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica. Como se muestra en la figura 4A y 4B, la eficiencia de PTK7 desmontables se comprobó en los tumores, tanto a los niveles de proteína y mRNA. En desmontables células HCT15 PTK7, el volumen del tumor se redujo en casi 50% (Fig 4C; p = 0, 0125, ANOVA de dos vías), en comparación con las células control. Del mismo modo, la masa tumoral se redujo en 2.6 veces mayor en los tumores de derribo PTK7 (Figura 4D; p = 0, 0025, prueba de Mann-Whitney). Por lo tanto, PTK7 juega un papel pro-tumorigénicos
in vivo
. Para evaluar si este impacto pro-tumorigénicos es debido a la diferencia en la proliferación celular, se analizó el estado de Ki67 en xenoinjertos tumorales, con y sin PTK7 caída. Como se muestra en la figura S4, no se observó diferencia significativa entre HCT15 shCTRL y HCT15 shPTK7 xenoinjertos en términos de tinción Ki67.
Expresión de PTK7 se comprobó después de la resección del tumor por Q-PCR (A) y análisis de transferencia Western ( SEGUNDO). El crecimiento de xenoinjerto subcutáneo de shCTRL- y células infectadas por shPTK7 HCT15 fueron examinados (C- D). Las imágenes de un representante HCT15 shCTRL inyectaron ratón y sus órganos se muestran en el panel izquierdo. Se evaluó el número de ratones libres de métastase o-positivas en cada condición y se muestra en el panel derecho. Las proporciones se compararon mediante la prueba exacta de Fischer (E).
En cuanto al impacto clínico de PTK7 sobreexpresión de MFS y su efecto pro-migratoria
in vitro
, hemos examinado si PTK7 podría mejorar la metástasis en modelo de ratones xenoinjertado. Después de la resección de tumores derivados de HCT15, el desarrollo metastásico se controló
in vivo
usando un indicador de luciferasa. Hubo una tendencia no significativa por menos ocurrencia metastásico en ratones inyectados con PTK7-desmontables células HCT15, en comparación con shCTRL-HCT15 inyectado ratones (2 eventos metastásicos en 15 ratones frente a 6 eventos metastásicos en 12 ratones, respectivamente; p = 0,0871, Fischer de la prueba exacta) (figura 4E).
a fin de investigar un posible efecto pro-metastásico de PTK7, hemos construido un modelo celular de PTK7 sobreexpresión en células de cáncer de PTK7-negativas y se examina su impacto en el desarrollo de metástasis
in vivo. En ausencia de cualquier célula CRC humanos PTK7-negativas disponibles, se utilizó una línea de células de melanoma B16F10, una célula PTK7-negativa con capacidad bien documentada para producir metástasis pulmonares en modelos de xenoinjertos [36], como modelo. Transfectadas las células B16F10 con la expresión PTK7 o vector vacío, y comprobamos que PTK7 se expresó de forma estable en la membrana plasmática mediante análisis FACS (S5A y S5B figura). a continuación, se inyectaron por vía intravenosa células B16F10 y se analizó el desarrollo de metástasis de pulmón. Se encontró que la sobreexpresión de PTK7 mejora de forma significativa el desarrollo metastásico (p = 0,0024) (S5C y S5D Fig). Mirando el tamaño de las metástasis, se encontró que la sobreexpresión PTK7 condujo a un aumento del número de metástasis pequeñas y grandes (p = 0,0019 y 0.0080, respectivamente; S5E Fig). Sin embargo, la proporción de pequeñas metástasis fue mayor en las células que sobreexpresan PTK7, lo que sugiere un efecto predominante en la invasión celular y la adhesión, en lugar de sobre la proliferación celular. De este modo, la sobreexpresión PTK7 mejora el fenotipo metastásico
in vivo
.
Discusión
Mientras que la expresión del ARNm aberrante de PTK7 se detectó inicialmente en el CCR [13], se dispone de datos disponible de su expresión de proteínas en muestras de CRC clínicamente anotado. El uso de inmunohistoquímica, hemos confirmado su sobreexpresión de la proteína en una fracción correspondiente de los casos de CCR (alrededor de un tercio de los pacientes), en comparación con la mucosa sanos emparejados donde no era o apenas detectables. En esta serie, no se encontró expresión de estar asociado con ningún características clínicas o patológicas específicas, incluyendo la edad, el tamaño del tumor, la afectación ganglionar, estadio, LVI, componente mucosa coloidal, y el grado de diferenciación. Sin embargo, en CRC no metastásico, PTK7 sobreexpresión se asoció con una significativa reducción de MFS. Se encontró que este impacto de mal pronóstico en términos de potencial metastásico de acercarse a la significación estadística en el análisis multivariante, mientras que la afectación ganglionar no fue retenida. En cuanto a sistema operativo, se observaron tendencias similares, pero sin alcanzar significación estadística, probablemente debido al tamaño limitado de la muestra. Es de destacar que no se encontró una relación significativa entre la sobreexpresión PTK7 y la etapa metastásica en el diagnóstico, el aumento de la intrigante hipótesis de que la expresión PTK7 podría perderse una vez establecidas las metástasis.