oral
Extracto
Antecedentes
LIM y SH3 proteína 1 (LASP- 1) es una proteína de adhesión focal específico implicado en varios tumores malignos. Sin embargo, su papel en el carcinoma de células escamosas oral (CCCA) es desconocida. El objetivo de este estudio fue caracterizar el papel y la condición /mecanismo molecular de LASP-1 en COCE.
Métodos
Evaluamos
LASP-1 | ARNm y proteína expresiones en líneas celulares derivadas de CCCA y OSCCs primarias. El uso de un sistema de shRNA, se analizó el efecto de LASP-1 sobre la biología y la función de las líneas celulares CCCA, HSC-3 y Ca9-22. Las células también se inyectaron por vía subcutánea para evaluar el crecimiento del tumor
in vivo
. Los datos se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher o la prueba de Mann-Whitney. corrección de Bonferroni se utilizó para múltiples pruebas.
se detectó
Resultados
importantes sobre regulación de LASP-1 en líneas celulares derivadas de COCE (n = 7,
P & lt
; 0,007) y OSCCs primaria (n = 50,
P
& lt; 0,001) en comparación con los controles normales. LASP-1 desmontables células significativamente la proliferación celular inhibida en comparación con las células transfectadas con shMock (
P Hotel & lt; 0,025) al detener la progresión del ciclo celular en la fase G2. Se observó reducción dramática en el crecimiento de xenoinjertos shLASP-1 CCCA compararon con xenoinjertos shMock
in vivo
.
Conclusión
Nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión de LASP-1 está vinculada estrechamente a tumorigenicidad oral y además proporcionar nuevos evidencia de que LASP-1 juega un papel esencial en el crecimiento celular tumoral por mediación de transición G2 /M
Visto:. Shimizu F, Shiiba M, Ogawara K, Kimura R, y Minakawa , Baba T, et al. (2013) La sobreexpresión de la proteína LIM y SH3 1 que lleva a G2 acelerado /M fase de transición contribuye a la génesis tumoral en el cáncer oral mejorada. PLoS ONE 8 (12): e83187. doi: 10.1371 /journal.pone.0083187
Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemania |
Recibido: 21 Agosto, 2013; Aceptado: 11 de noviembre de 2013; Publicado: December 26, 2013
Derechos de Autor © 2013 Shimizu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que ningún interés en competencia existe
Introducción
Una considerable evidencia ha sugerido que los aumentos repentinos en la proliferación celular ocurrir debido a la interrupción del mecanismo de control del ciclo celular. Estudios previos han reportado una correlación entre la regulación y el desarrollo de carcinomas de células escamosas orales (OSCCs) del ciclo celular [1], [2], [3]. A pesar de la acumulación de datos, el mecanismo exacto de el beneficio clínico de la regulación del ciclo celular en OSCCs no ha sido dilucidado.
proliferación de células cancerosas sucede como resultado de la interrupción de los mecanismos de control del ciclo celular y la señalización continua de mitosis. Estudios recientes han informado de que la desregulación en G2 /M transición promueve la proliferación celular en muchos tipos de tumores [4], [5], [6]. Entre los genes que se correlacionan con la fase G2 /M, LIM nucleico y la proteína SH3 (LASP-1) en la fase G2 /M se considera esencial para la actividad oncogénica en pacientes con cáncer de mama [7]. LASP-1 se identificó originalmente a partir de una biblioteca de ADNc de metástasis de cáncer de mama metastásico [8]. Se localiza dentro de múltiples sitios de ensamblaje de F-actina dinámica como contactos focales [9] y está implicado en la arquitectura del citoesqueleto [10]. En las células de cáncer derivadas de ser humano, mientras que el silenciamiento de LASP-1 resultó en una fuerte inhibición del crecimiento celular [11], la sobreexpresión de LASP-1 promovió significativamente el crecimiento del tumor
in vivo
[12]. Por otra parte, la sobreexpresión de LASP-1 se ha observado en una variedad de tumores malignos tales como cáncer de mama metastásico [11], cáncer de ovario [13], cáncer de vejiga [14], meduloblastoma [15], y carcinoma hepatocelular [16].
Los estudios recientes han demostrado LASP-1 junto con otra proteína de adhesión focal juega un papel importante en la transición G2 /M mediante la inhibición de cdc2 [17], [18], lo que sugiere su posible relación con el ciclo celular en el cáncer. Sobre la base de estas observaciones la hipótesis de que LASP-1 está estrechamente relacionado con la tumorigénesis oral con G2 acelerado /M transición.
En el presente estudio, encontramos la expresión aberrante de LASP-1 y se evaluó la correlación entre la expresión y características clinicopatológicas en OSCCs. También se realizó el análisis funcional para definir los efectos biológicos de LASP-1.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Ético de la Graduate School de Medicina, Universidad de Chiba (el número de homologación, 236) y fue realizado de acuerdo con las normas éticas establecidas en la Declaración de Helsinki. consentimiento informado por escrito se recibió de todos los pacientes.
Todas las ratas fueron tratadas y cuidadas de acuerdo con las directrices de la Universidad de Chiba. Los animales experimentales fueron sacrificados por dislocación cervical. Hemos hecho todo lo posible para aliviar el dolor de los animales de experimentación. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de Chiba (El número de homologación, 25-221).
Cultivo de células y de tejidos Muestras
Las líneas celulares humanas CCCA (HSC -3, KON, y HO-1-N-1) fueron adquiridos de la investigación de la ciencia Banco de Recursos Humanos, Osaka, Japón. RIKEN BRC (Tsukuba, Japón) proporcionó Sa 3, HO-1-u-1, HSC-4, y Ca9-22 a través del Proyecto Nacional de Recursos Bio-del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. identidad celular se confirmó mediante repeticiones cortas en tándem de perfiles. queratinocitos primarios humanos normales en cultivo orales (HNOKs) se obtuvieron a partir de tres donantes sanos y sirvieron como los controles normales [19], [20], [21]. Todas las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Sigma) y 50 unidades /ml de penicilina y estreptomicina (Sigma) en una atmósfera humidificada de dióxido de carbono 5% /aire a 37 ° C.
Cincuenta pares de muestras primarias CCCA y los correspondientes tejidos epiteliales orales normales se obtuvieron durante la operación en el hospital de la Universidad de Chiba. La junta de revisión institucional de la Universidad de Chiba aprobó este estudio. El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. Los tejidos resecados se dividieron para el aislamiento de ARN y la inmunohistoquímica (IHC); el primero fue inmediatamente congelado y almacenado a -80 ° C, este último se fijó en una solución de formaldehído tamponado al 20%. Cada tejido fue diagnosticado histopatológicamente de acuerdo con los criterios de la Organización Mundial de la Salud por el Departamento de Patología, Hospital de la Universidad de Chiba. estadiaje clínico-patológico se determinó de acuerdo con la clasificación de tumores de nodo metástasis de la Unión Internacional contra el Cáncer. Todas las muestras fueron confirmados histológicamente CCCA que el tumor estaba presente en más del 90% de las muestras.
Análisis de expresión de ARNm
El ARN total fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. cDNA se generó a partir de 5 g de ARN total usando Ready-To-Go-Usted Primer primera cadena de los granos (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) y oligo (dT) (Hokkaido Sistema de Ciencia, Sapporo, Japón). cuantitativa de reacción en cadena polimerasa con transcriptasa inversa en tiempo real (QRT-PCR) se realizó utilizando LightCycler® 480 sistema de PCR (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) para evaluar el nivel de expresión de
LASP-1
mRNA en la CCCA líneas celulares -derivado y HNOKs. Las secuencias de los cebadores utilizados para QRT-PCR fueron:
LASP-1 |, adelante, 5'-CAGCCCCAGTCTCCATACAG-3 '; revertir, 5'-ATACTGATGTCGCGGCGG-3 '; y la sonda universal de#77. Los cebadores y sondas fueron diseñados utilizando el software de diseño de ensayo qPCR ProbeFinder, disponible en www.universalprobelibrary.com. Las amplificaciones QRT-PCR se llevaron a cabo como sigue: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 minutos, 45 ciclos de amplificación a 95 ° C durante 10 segundos, la desnaturalización a 55 ° C durante 30 segundos para la hibridación /extensión, y enfriamiento a 40 ° C durante 30 segundos. La cantidad de transcripción para el
LASP-1
se calculó a partir de las respectivas curvas de calibración y normalizado a la
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa gratis (
GAPDH
) (hacia delante 5 ' -CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3'cell, revertir 5'-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ', y la sonda#cantidad 60) transcripción universales determinados en muestras correspondientes.
Análisis de inmunotransferencia
Las células se lisaron en tampón ( 7 M urea, 2 M tiourea, 4% w /v de CHAPS, y Tris 10 mM [pH 7,4]) con el cóctel inhibidor de proteinasa (Roche) y se incubaron a 4 ° C durante 30 minutos. La concentración de proteínas se evaluó utilizando un ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Los extractos de proteína se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio en gel de 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa antes de la incubación durante la noche con anticuerpos primarios contra LASP-1 (Applied Materiales Biológicos, Richmond, BC, Canadá), ciclina A, ciclina B, o fosfo -cdc2 (Tyr15) (Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA) a 4 ° C. La membrana se lavó con 0,1% de Tween-20 en solución salina tamponada con Tris, se incubaron con anticuerpos secundarios, conjugados con peroxidasa de rábano picante anti-conejo o anti-IgG de ratón (Promega, Madison, WI, EE.UU.) durante 1 hora a temperatura ambiente. sustrato quimioluminiscente SuperSignal (Thermo, Waltham, MA, EE.UU.) se utilizó para la detección de proteínas. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron en un sistema de cámara CCD enfriado (ATTO, Tokio, Japón), y la versión de software del analizador CS 3.0 (ATTO) se utilizó para la cuantificación de la intensidad de la señal.
IHC
IHC se realizó en muestras incluidas en parafina cortadas en secciones de 4 micras utilizando anticuerpos de conejo anti-LASP-1 policlonal (Applied Materiales biológicos). La actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada por una incubación de 30 minutos en solución de peróxido de hidrógeno 0,3% en metanol al 100%. Las secciones fueron incubadas en el 1,5% de suero de bloqueo (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, EE.UU.) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 2 horas a temperatura ambiente antes de reaccionar durante la noche con anti-LASP-1 anticuerpo (1: 1000 dilución) a 4 ° C en una cámara húmeda. Antes de la incubación con el anticuerpo primario, los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS y se trataron con Histofine Simplestain Max-PO (G) (Nichirei, Tokio, Japón). se utilizó 3,3-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.) como cromógeno, y las secciones de tejido se counterstained ligeramente con hematoxilina, se deshidrataron con etanol, limpiado con xileno, y montadas con Marinol (Muto Pure Chemicals, Tokio , Japón). Para evitar la unión no específica de un anticuerpo a las proteínas diferentes de antígeno, se realizó un experimento de bloqueo péptido inmunizante. Triplicado secciones se immunostained sin reaccionar anticuerpo primario como control negativo para confirmar la especificidad de la tinción.
Para determinar LASP-1 los niveles de expresión, las diapositivas fueron evaluados utilizando sistemas de puntuación de IHC descritas anteriormente [22], [23]. Las intensidades de tinción se anotó como 1, débil; 2, moderado; y 3, fuerte. La puntuación de IHC se calculó multiplicando el porcentaje de las células tumorales positivas y la intensidad de la tinción. Los casos con una puntuación superior a 113,0 (3 desviación estándar [DE] puntuación para el tejido normal) se definieron como LASP-1-positivo. El punto de corte ± SD 3, que estadísticamente es sólo el 0,2% de la medición y se espera que caiga fuera de este rango, se utilizó porque era poco probable que sea afectado por un error experimental aleatorio producido por la manipulación de la muestra [24]. Dos patólogos independientes que no tenían conocimiento de la situación clínica de los pacientes emitieron estas opiniones.
La transfección con el plásmido shRNA
Las líneas celulares CCCA, HSC-3 y Ca9-22, con mayor LASP- la expresión de la proteína 1 fueron transfectadas de forma estable con la LASP-1 shRNA (shLASP-1) o el control shRNA (shMock) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) utilizando Lipofectamina LTX y Reactivos Plus (Invitrogen). Se seleccionaron las células transfectadas en medio que contenía 1 mg /ml de puromicina (Invitrogen).
Ensayos de proliferación celular
Para determinar el efecto de LASP-1 desmontables sobre la proliferación celular, shLASP-1- y shMock- transfectadas las células fueron sembradas en placas de seis pocillos a 1 x 10
4 células /pocillo, se trataron con tripsina y se contaron por triplicado cada día durante 7 días usando un hemocitómetro.
Análisis del ciclo celular
Siete días después del establecimiento de LASP-1 desmontables células, se comprobó la distribución del ciclo celular. Para sincronizar las células en la transición G2 /M, las células se trataron con 200 ng /ml nocodazole (Sigma) durante 20 horas [25]. Las células se sedimentaron, se aclararon con PBS, y se sondearon con el kit de reactivos de ADN CycleTEST Plus (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de centrifugación a 400 xg durante 5 minutos, se añadieron 250 microlitros de solución de A (tampón de tripsina), y la mezcla se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Doscientos microlitros de la solución B (inhibidor de la tripsina y la RNasa en un tampón) se añadió entonces y la mezcla se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 200 microlitros de solución C (solución de yoduro de propidio mancha), y la mezcla se incubó en la oscuridad durante 10 minutos en hielo. determinación de citometría de flujo del contenido de ADN se analizó mediante el Accuri C6 citómetro de flujo (Becton-Dickinson). distribuciones del ciclo celular se cuantificaron utilizando FCS Express 4 (De Novo Software, Los Ángeles, CA, EE.UU.). Los experimentos se realizaron por triplicado.
En vivo
crecimiento tumoral Ensayo
Para evaluar el crecimiento del cáncer
in vivo
, 2 × 10
7 shLASP-1 y las células transfectadas con shMock se inyectaron de forma independiente por vía subcutánea en la espalda de ratones desnudos hembra, BALB /c-nu, comprados de Oriental Yeast Co. (Tokyo, Japón). Todas las ratas fueron tratadas y cuidadas de conformidad con las directrices institucionales. Los tumores se midieron usando calibradores cada 3 a 4 días después de que se alcanzó un volumen de 100 mm
3. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula 4π /3 × (anchura /2)
2 × (longitud /2). Los ratones se sacrificaron después de 28 días. Los tejidos tumorales se fijaron en formalina al 10%, y se prepararon secciones de parafina (4 m) para inmunohistoquímica de LASP-1 y hematoxilina y eosina (H & amp; E). tinción
Análisis estadístico
Estadística significancia se determinó mediante la prueba exacta de Fisher o la prueba de Mann-Whitney.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo. corrección de Bonferroni se utilizó para múltiples pruebas. Los datos se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM).
Resultados
Evaluación de LASP-1 Expresión en CCCA-líneas celulares derivadas
Para analizar el estado de la expresión de
LASP-1 |, hemos realizado QRT-PCR e inmunotransferencia análisis utilizando siete líneas celulares derivadas de COCE (HSC-3, 4-HSC, Kon, HO-1-U-1, HO- 1-N-1, Ca9-22, y Sa3) y HNOKs.
LASP-1 | mRNA fue significativamente (
P Hotel & lt; 0,007) hasta reguladas en todas las líneas celulares CCCA comparación con la de los HNOKs (Figura 1A). La Figura 1B muestra resultados representativos de los análisis inmunotransferencia. Un aumento significativo de la LASP-1 expresión de la proteína se observó en todas las líneas celulares derivadas de CCCA en comparación con el HNOKs. El análisis de expresión indica que ambos productos de transcripción y traducción de LASP-1 fueron altamente expresado en líneas celulares derivadas de CCCA.
(A) Cuantificación de
expresión mRNA
LASP-1 en la celda de origen OSCC líneas por QRT-PCR análisis. los niveles de expresión de ARNm se normalizaron a GAPDH. Importantes sobre regulación de
LASP-1 | ARNm se ve en siete líneas celulares derivadas de CCCA comparación con la de HNOKs. Los datos se expresan como la media ± SEM de los resultados por triplicado (*
P
& lt; 0,007; prueba de Mann-Whitney U con corrección de Bonferroni). (B) Análisis de inmunotransferencia de la proteína LASP-1 en las líneas celulares derivadas de CCCA y HNOKs. LASP-1 expresión de la proteína está regulada hasta en las líneas celulares derivadas de CCCA comparación con la de los HNOKs. Densitométricos LASP-1 proteínas de datos se normalizan a los niveles de proteína GAPDH. Los valores se expresan como un porcentaje de los HNOKs.
Evaluación de LASP-1 Expresión en OSCCs primarios
Para averiguar el estado de la expresión de LASP-1 en OSCCs primarios y su relaciones con las características clínico-patológicas, se investigó LASP-1 de expresión de proteínas en OSCCs primarias y emparejaron los tejidos orales normales de 50 pacientes utilizando el sistema de puntuación de IHC. Strong LASP-1 inmunoreactividad se detectó en el citoplasma de la OSCCs, mientras que los tejidos normales mostraron inmunotinción negativa (Figura 2B, C). Los LASP-1 resultados de IHC iban desde 43 a la 265 en OSCCs (mediana, 178) y 2,5 a 97 en los tejidos orales normales (mediana, 35). IHC resultados en OSCCs primarias fueron significativamente (
P Hotel & lt; 0,05) superiores a los de los tejidos normales orales (Figura 2A)
(A) El estado de LASP-1 en la expresión de la proteína. OSCCs primaria (n = 50) y los homólogos normales basados en un sistema de puntuación de IHC. resultados de IHC se calculan de la siguiente manera: la puntuación de IHC = 1 × (número de células teñidas débilmente en el campo) + 2 x (número de células teñidas moderadamente en el campo) + 3 x (número de células teñidas intensamente en el campo). Los LASP-1 IHC resultados para los tejidos orales normales y OSCCs intervalo de 2,5 a 97 (mediana, 35) y 43 a 265 (mediana, 178), respectivamente. proteína LASP-1 en los niveles de expresión OSCCs son significativamente más altos que en los tejidos orales normales (*
P Hotel & lt; 0,001; Mann-Whitney U test). Resultados (B, C) Representante IHC de LASP-1 en los tejidos orales normales y OSCCs primarias. Aumento original, × 100. Las barras de escala, 5 m. LASP-1 es altamente sobreexpresado en OSCCs comparación con los tejidos orales normales.
La Tabla 1 muestra las correlaciones entre las características clínico-patológicas de los pacientes con COCE y el estado de LASP-1 de expresión de proteínas utilizando el marcador IHC sistema. Entre las clasificaciones clínicas, los LASP-1 OSCCs positivos se correlacionaron significativamente (
P = 0,02
) con el tamaño del tumor. Por otra parte, una disminución significativa (
P = 0,04
) se encontraron diferencias en los LASP-1 los niveles de expresión entre el grupo T1 /T2 y el grupo T3 /T4, lo que indica LASP-1 los niveles de expresión son más altos en etapas avanzadas en comparación con las primeras etapas. No hay relaciones significativas se encuentran en la edad, el género, el nodo N-linfático regional, el tipo histológico, y la localización del tumor.
Establecimiento de LASP-1 Las células de derribo
Para estudiar la posible función de LASP-1 en OSCCs, las líneas celulares derivadas de CCCA, HSC-3 y Ca9-22, fueron transfectadas con LASP-1 shRNA y el control shRNA (shMock). Los niveles de expresión de
LASP-1 | ARNm y proteínas en las células transfectadas con shLASP-1 mostró significativa (
P Hotel & lt; 0,025) en comparación con la disminución de las células transfectadas con shMock (Figura 3A, B .)
(a) Expresión de
células LASP-1 | mRNA en shMock- y shLASP-1 transfectadas (HSC-3 y derivados de Ca9-22 transfectantes; 2 clones cada uno) . La
LASP-1
la expresión de ARNm en el shLASP-1 es significativamente (*
P
& lt; 0,025; prueba de Mann-Whitney U con corrección de Bonferroni) menor que en las células transfectadas con shMock . (B) Análisis de inmunotransferencia de la proteína LASP-1 en las células transfectadas con shLASP-1 shMock- y (HSC-3 y transfectantes derivados de Ca9-22, 2 clones cada uno). La proteína LASP-1 en las células shLASP-1 transfectadas se agota notablemente en comparación con las células transfectadas shMock.
Reducción del Crecimiento Celular en LASP-1 Las células de derribo
Para estudiar la impacto de LASP-1 en la capacidad proliferativa celular, que supervisó el crecimiento celular en las células transfectadas con shLASP-1 durante siete días consecutivos. células transfectadas con shLASP-1 Tanto HSC-3 y Ca9-22 tenían una disminución significativa (
P
& lt; 0,025). disminución en el crecimiento celular en comparación con las células transfectadas con shMock (Figura 4) guía
Para determinar el efecto de shLASP-1 sobre la proliferación celular, shLASP-1 y células transfectadas con shMock se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células viables /pocillo. El shLASP-1 transfectadas HSC-3 y células Ca9-22 tener un efecto significativo (*
P Hotel & lt; 0,025; Mann-Whitney U test con corrección de Bonferroni) disminución en el crecimiento celular en comparación con las células transfectadas con shMock.
Desmontables de LASP-1 induce G2 fase de acumulación
para investigar el mecanismo por el cual las reguladas LASP-1 está relacionado con la progresión del ciclo celular, que luego investigó el por células distribuciones de ciclo de las células transfectadas con shLASP-1 utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). La proporción de células en la fase G2 en las células transfectadas con shLASP-1 fue significativamente (
P
& lt; 0,025) mayor que en las células transfectadas con shMock (Figura 5A). Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes (Figura S1, S2), lo que sugiere que la baja regulación de LASP-1 inhibe la proliferación celular, que induce la detención G2.
(A) de flujo se analizó por citometría de determinación del contenido de ADN utilizando el citómetro de flujo Accuri C6. células HSC-3 y Ca9-22 transfectadas con shLASP-1 muestran significativa (*
P
& lt; 0,025; prueba de Mann-Whitney U con corrección de Bonferroni) la acumulación de fase G2 a diferencia de las células transfectadas con shMock. (B) Análisis de inmunotransferencia muestra la baja regulación de la ciclina A y ciclina B y sobre regulación de fosfo-cdc2 en las células desmontables.
Para identificar el mecanismo por el cual el regulado LASP-1 bloquea transición G2 /M, se evaluó el nivel de expresión de la proteína de la ciclina A, ciclina B, o fosfo-cdc2 (Tyr15). Las expresiones proteína de la ciclina A y ciclina B se redujeron reguladas mientras fosfo-cdc2 (Tyr 15) fue hasta reguladas (Figura 5B), lo que indica la detención de la fase G2 /M en las células transfectadas shLASP-1.
LASP-1 promovió el crecimiento del tumor
in vivo
Para definir el efecto de LASP-1 en el crecimiento del cáncer de
in vivo
, shLASP-1- y shMock- células transfectadas de las líneas de células HSC-3 y Ca9-22 se inyectaron por vía subcutánea en la espalda de ratones hembras desnudos, respectivamente (3 ratones en cada grupo). De acuerdo con nuestros
in vitro
hallazgos en, el volumen medio del tumor de las células shLASP-1 fue significativamente (
P
& lt; 0,05) menor en comparación con las células transfectadas con shMock. H & amp; E tinción confirmaron la presencia de células tumorales en todos los grupos y LASP-1 inmunohistoquímica de secciones de tumores demostraron LASP-1 desmontables se ha mantenido
in vivo
(Figura 6). Estos resultados indicaron que LASP-1 promueve el crecimiento tumoral en ratones desnudos.
shLASP-1 y transfectadas con shMock células (HSC-3 y Ca9-22) se inyectaron por vía subcutánea en la espalda de ratones nude hembra (n = 3). El crecimiento del tumor de los ratones inyectados con shLASP-1 es significativamente (*
P
& lt; 0,05; prueba de Mann-Whitney U) inhibió en comparación con los ratones inyectados con shMock. La inmunohistoquímica demostró claramente disminuyó inmunotinción para LASP-1 en los tumores derivados de shLASP-1 que shMock ratones inyectados. H & amp; E tinción confirmaron la presencia de células tumorales. Aumento original, × 200.
Discusión
En el presente estudio, se encontró una alta prevalencia de aumento de la expresión de LASP-1 en pacientes con COCE y una correlación significativa con el tumor primario tamaño (Tabla 1). Por otra parte, desmontables de LASP-1 en líneas celulares derivadas de CCCA resultó en un efecto dramático en la inhibición del crecimiento
in vitro
y
in vivo
a través de la detención de la fase G2 /M. Los datos actuales proporcionan una visión novedosa sobre el papel de la función aberrante LASP-1 como un proceso oncogénico en esta enfermedad.
Se ha detectado una regulación significativa de LASP-1 en todas las células derivadas de la CCCA examinadas en proteínas niveles (Figura 1B), lo que indica que LASP-1 de expresión es necesario para la carcinogénesis oral. Por otro lado, los estados de expresión de ARNm dependían de las células (Figura 1A). Una posible explicación de esta discrepancia es que las proteínas de LASP-1 están afectados de manera diferente por la ubiquitinación después de la traducción y la proteolisis en cada uno líneas de células tumorales. En este contexto, las discrepancias entre
LASP-1
los niveles de expresión de ARNm y los niveles de proteína se ha informado en líneas celulares de cáncer de vejiga [14].
Análisis
FACS mostraron que LASP-1 es específicamente activo en la fase G2 /M en las células CCCA (Figura 5A). El G2 /M puesto de control es necesario para la célula para reparar el daño del ADN antes de la entrada mitótica. Cuando el ADN está dañado, cdc2, un importante regulador de la progresión de la célula, se inactiva mediante el aumento de residuos de fosforilación de Tyr 15, causando que las células para detener en la fase G2 [26]. Ciclina A y ciclina B son otros reguladores cruciales de la progresión del ciclo celular. Ciclina A se asocia con cdk2 y cdc2 y se requiere en el inicio de la fase S y G2 /M transición [27], [28]. Mientras tanto, la ciclina B se asocia con cdc2 y regula la entrada y salida [29] mitótico. Los niveles de expresión de la ciclina A y ciclina B a menudo son regulados hacia arriba en una variedad de tumores [30], [31]. El agotamiento de ciclina A y ciclina B conduce a la detención del ciclo celular en G2 [32], [33]. Durante la fase G2, el complejo B /cdc2 ciclina se inactiva por fosforilación en Try15 y Thr14 de cdc2 por los Wee 1 y Myt 1 quinasas [34], [35]. En el inicio de la mitosis, la fosfatasa cdc25C activa cdc2 mediante la eliminación de los fosfatos en Thr 14 y 15 TRY [36], [37] y evita que el complejo ciclina B1 /cdc2 de ser inactivado de nuevo [38].
Basado en estas observaciones, se determinó siguiente, el estado de la expresión de los genes relacionados mencionados anteriormente. Como era de esperar, mientras que la ciclina A y B fueron significativamente las reguladas, que hemos detectado sobre regulación de phoshpo-cdc2 en los desmontables células LASP-1. Esto fue consistente con estudios previos que implicaban LASP-1 es responsable de la proliferación celular debido a la detención del ciclo celular en la fase G2 en pacientes con cáncer de mama y de ovario [11], [13].
En conclusión, nuestros datos indicaban que LASP-1 puede estar asociada con la progresión tumoral mediante la promoción de la progresión del ciclo celular en la fase G2. Es de destacar que nuestros
in vivo
datos mostraron inhibición dramática del crecimiento del tumor por LASP-1 silenciamiento, lo que sugiere que esta molécula puede ser un biomarcador útil de la proliferación y una posible diana terapéutica para el desarrollo de fármacos contra el cáncer en humanos OSCCs porque la mayoría de nuestros pacientes con COCE han sobreexpresa la proteína LASP-1 (Tabla 1).
Apoyo a la Información
Figura S1.
FACS análisis de las células HSC-3-transfectadas shLASP-1 y shMock-. El porcentaje de la fase G2 /M en células HSC-3-transfectadas shLASP-1 fue mayor que en las células transfectadas con shMock
doi:. 10.1371 /journal.pone.0083187.s001 gratis (TIF)
Figura S2.
FACS análisis de las células y shMock- Ca9-22 shLASP-1-transfectadas. El porcentaje de la fase G2 /M en células transfectadas Ca9-22-shLASP-1 fue mayor que en las células transfectadas con shMock
doi:. 10.1371 /journal.pone.0083187.s002 gratis (TIF)
Reconocimientos
agradecemos a la Sra Lynda C Charters para la edición de este manuscrito.