Extracto
Antecedentes
El cáncer colorrectal (CCR) es una de las enfermedades más comunes, pero los enfoques terapéuticos actuales para CCR avanzado son menos eficientes. Por lo tanto, son muy necesarios nuevos enfoques terapéuticos. El propósito de este estudio es investigar la implicación de la proteína quinasa CK2 α subunidad nuclear (CK2α) en la progresión tumoral, y en el pronóstico de CRC humana.
Metodología /Principales conclusiones
Los niveles de expresión de CK2α nuclear fueron analizados en 245 tejidos colorrectales de pacientes con CRC por inmunohistoquímica, cuantitativa en tiempo real PCR y Western blot. Se correlacionaron los niveles de expresión con parámetros clínico y el pronóstico en pacientes con CRC humanos. La sobreexpresión de CK2α nuclear se correlacionó significativamente con la profundidad de la invasión, el estado ganglionar, Comité Conjunto sobre el Cáncer (AJCC), grado de diferenciación, y la invasión perineural. Los pacientes con altos niveles de expresión de CK2α nucleares tenían una tasa de supervivencia global significativamente más pobre en comparación con los pacientes con bajos niveles de expresión de CK2α nuclear. En multivariable análisis de regresión de Cox, la sobreexpresión de CK2α nuclear ha demostrado ser un marcador pronóstico independiente para el CCR. Además, se emplearon DLD-1 en las células de cáncer de colon humano como un modelo celular para estudiar el papel de CK2α sobre el crecimiento celular, y la expresión de CK2α en las células DLD-1 fue inhibida por el uso de la tecnología de siRNA. Los datos indicaron que el tratamiento CK2α-siRNA resultó en la inhibición del crecimiento.
Conclusiones /Importancia
En su conjunto, la sobreexpresión de CK2α nuclear puede ser un marcador útil para predecir el resultado de los pacientes con CCR.
Visto: Lin KY, Tai C, Hsu JC, Li CF, fang CL, Lai HC, et al. (2011) La sobreexpresión de la proteína quinasa CK2 α nuclear catalítico de la subunidad (CK2α) como un pronosticador pobre en el cáncer colorrectal humano. PLoS ONE 6 (2): e17193. doi: 10.1371 /journal.pone.0017193
Editor: Terence Lee, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 11 Agosto, 2010; Aceptado 25 de enero de 2011; Publicado: 17 Febrero 2011
Derechos de Autor © 2011 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca (DOH98-TD-I-111-TM006) del Departamento de Salud, Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) representó aproximadamente 1 millón de nuevos casos en 2002 (9,4% del total mundial), ya diferencia de la mayoría de los sitios, los números no eran tan diferentes en hombres y mujeres (relación, 1.2:1) [1]. En términos de incidencia, CRC ocupa el cuarto lugar en frecuencia en hombres y tercero en mujeres. Hay por lo menos una variación de 25 veces en la ocurrencia de CRC en todo el mundo. Las tasas de incidencia más altas se encuentran en América del Norte, Europa Occidental y, especialmente en los hombres, Japón. La incidencia tiende a ser baja en África e intermedia en las partes meridionales de América del Sur. En Taiwán, el CRC se ubica como el segundo cáncer más frecuentemente diagnosticado y causa más de 10.000 muertes al año (http://www.doh.gov.tw/statistic/index.htm; visitada en diciembre de 2008). A pesar de las técnicas quirúrgicas actuales y la quimioterapia que han hecho mejoras significativas, la tasa de curación de CCR avanzado sigue siendo baja y la morbilidad sigue siendo elevada [2]. Por lo tanto, los avances en el tratamiento de esta enfermedad es probable que venir de una mejor comprensión de su patogénesis y las características biológicas.
El pronóstico de los nuevos diagnósticos de CRC se basa predominantemente en el Comité Conjunto sobre el Cáncer etapa (AJCC) determinado por el profundidad de la invasión, la implicación de los ganglios linfáticos y metástasis a distancia [3], [4]. Sin embargo, de hecho, es bien sabido que los pacientes con la misma etapa CRC heterogeneidad supervivencia pantalla AJCC, con algunos pacientes que exhiben tiempos de supervivencia relativamente cortos. En consecuencia, la identificación de factores de pronóstico más prometedores que son de hecho altamente predictivo de pacientes con CRC sometidos a tratamiento quirúrgico es obligatorio. Muchos estudios han sugerido el papel que las alteraciones genéticas pueden tener en el desarrollo y progresión de la CRC [5], [6]. Patología molecular puede ser útil no sólo para entender la patogénesis de la enfermedad, sino también para dar los marcadores moleculares de pronóstico útiles. Algunos factores pronósticos biológicos sugeridos incluyen la sobreexpresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), potenciador de zeste homólogo 2 y transglutaminasa 2 [7] - [9].
CK2 proteína quinasa (anteriormente conocida como la caseína quinasa 2) es un altamente conservado de serina /treonina quinasa. Se distribuye de forma ubicua en los organismos eucariotas, donde más a menudo parece existir en los complejos tetrámeros que consisten en dos subunidades catalíticas (αα, α 'α' o αα ') dos subunidades beta de regulación [10] y [11]. CK2 es una proteína quinasa notablemente multifuncional con una amplia gama de más de 300 sustratos, muchos de los cuales están implicados críticamente en el proceso de crecimiento celular, proliferación y diferenciación [12], [13]. La interrupción de
Saccharomyces cerevisiae
genes que codifican las dos subunidades catalíticas CK2 conduce a un fallo en el desarrollo y la demostración de que knockout del gen que codifica la subunidad β CK2 reguladora en ratones también es letal refuerza la importancia de CK2 en el mantenimiento de la viabilidad celular en la vida normal de las células y durante la embriogénesis [14], [15]. En la subunidad β, ciertos residuos de cisteína pueden jugar un papel en el anclaje de la quinasa a las estructuras nucleares. actividad CK2 puede tener un papel en el crecimiento celular a través de su señalización a sitios clave en la matriz nuclear y las estructuras de cromatina [16]. Varios estímulos de crecimiento pueden mejorar CK2 shuttling nuclear, de manera que se observó una mayor localización nuclear en las células tumorales en comparación con las células normales [17], [18].
Además, CK2 desregulación en las células tumorales puede influir en la actividad apoptótica y para mejorar la supervivencia celular [19]. CK2 puede ejercer efectos anti-apoptóticas a través de diversos mecanismos. Por ejemplo, CK2 contrarrestar la apoptosis mediante la protección de la subasta de necrosis tumoral ligando inductor de apoptosis relacionada con el factor (TRAIL) inducida por la degradación mediada por la caspasa-8 [20]. CK2 también está implicada en la fosforilación de varias proteínas relacionadas con la apoptosis, incluyendo p53and factor nuclear-kB [21], [22]. Además, la muerte celular mediada por el receptor Fas está regulada por CK2 expresión [23].
El nivel de CK2 parece estar estrechamente regulado en las células normales, resistir un cambio en su nivel intrínseco de CK2 [24]. aumento de la evidencia indica que la enzima CK2 es un componente de las redes de proteína quinasa reguladoras que están implicadas en varios aspectos de la transformación celular y el cáncer [25]. Los aumentos en el nivel y la actividad CK2 consistentemente se han observado en una variedad de cánceres humanos, incluyendo la glándula mamaria, cabeza y cuello, y cáncer de riñón [26] - [28]. Sobreexpresión y significado pronóstico de CK2 subunidad α sólo se han observado en el cáncer de pulmón, cáncer de próstata y leucemia [29] - [31]. A nuestro entender, la expresión y la importancia pronóstica de CK2α nuclear en CRC humana es aún desconocido. Los objetivos de este estudio fueron investigar la relación entre la expresión CK2α nuclear y parámetros clínico y el pronóstico en pacientes con CRC humanos. También se evaluaron los efectos de la expresión CK2α siRNA inhibe la proliferación de células de cáncer de colon.
Resultados
Datos básicos
Dos cientos y cuarenta y cinco pacientes con CRC, 139 machos y hembras 106, se inscribieron en este estudio. La edad varió de 21 a 88 años o en el primer diagnóstico (media 64 años). Basado en la clasificación de la AJCC, hubo 36 pacientes en estadio I, 98 pacientes en estadio II, 110 pacientes en estadio III, y 1 paciente en estadio IV. El seguimiento de los pacientes varió de 2.93 a 123.97 meses (media 68,3 meses). Durante el seguimiento, 69 pacientes murieron de CRC. Las complicaciones postoperatorias no se producen en estos pacientes.
Expresión nuclear CK2α se reguló y se asocia con varios parámetros clínico en el CCR
Hemos investigado la expresión de CK2α nuclear en 245 pacientes con CCR mediante inmunohistoquímica, y en cuatro pacientes por Western blot. Los resultados indicaron que la expresión CK2α nuclear fue mayor en los tejidos tumorales que en los tejidos no tumorales (Figura 1). Además, en tiempo real el análisis cuantitativo de PCR demostró que la expresión de CK2α se incrementó sustancialmente en los tejidos tumorales en comparación con tejidos no tumorales (Tabla 1). Como se muestra en la Tabla 2, la expresión CK2α nuclear tiene una correlación estadísticamente significativa con la profundidad de la invasión (
P
= 0,008), el estado ganglionar (
P Hotel & lt; 0,001), estadificación del AJCC (
P Hotel & lt; 0,001), grado de diferenciación (
P = 0,011
), y la invasión perineural (
P = 0,041
). Las microfotografías representativas de expresiones CK2α nucleares para diferentes parámetros se muestran en la Figura 2. No hubo una asociación significativa entre la expresión nuclear CK2α y la edad, el género, y la invasión vascular.
La expresión nuclear CK2α en tejidos no tumorales y tumorales , analizada por inmunohistoquímica, se muestra en el panel a y B, respectivamente. Ampliación: 400 ×. expresión el panel C. CK2α nuclear en cuatro pares no tumorales /tumor fue examinado por Western blot
Ampliación:.. 400 ×
La sobreexpresión de CK2α nuclear como un marcador pronóstico independiente para el CDN
Las correlaciones de los resultados clínicos con la expresión CK2α nuclear se muestran en la Figura 3. supervivencia global inferior se asoció significativamente con la sobreexpresión de CK2α nuclear (índice & gt etiquetado decir, el 40%,
P Hotel & lt; 0,0001). Los pacientes con altos niveles de expresión de CK2α nucleares tenían una tasa de supervivencia global a diez años del 22,2% en comparación con el 72,5% de los pacientes con bajos niveles de expresión de CK2α nuclear.
Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras. El nivel de significación:.
P Hotel & lt; 0,05
El análisis uni-variable de marcadores pronósticos de CRC se resume en la Tabla 3. El estado ganglionar (
P =
0,025) y la sobreexpresión de CK2α nuclear (
P Hotel & lt; 0,0001) fue significativamente correlacionado con la supervivencia global
Esta asociación entre la sobreexpresión de CK2α nucleares y la supervivencia se mantuvo incluso después de controlar por otros. marcadores de pronóstico bien conocido en análisis de variables múltiples (tabla 4). En el análisis multivariado, la sobreexpresión de CK2α nuclear era vista pronóstico independiente (razón de riesgo = 4,53, intervalo de confianza del 95% = 2.46 a la 8.32,
P Hotel & lt; 0,0001).
Efecto de tumbar de CK2α sobre el cáncer de colon proliferación celular
Para determinar el efecto de la expresión CK2α en-1 sistema antibloqueo de frenos proliferación de células cancerosas de colon humano,
CK2
α gen fue derribado por transfección de CK2α- siRNA específico. siRNAs revueltos se utilizaron como controles. Después del tratamiento CK2α-siRNA, el nivel de expresión de CK2α nuclear en las células DLD-1 fue significativamente inhibida (Figura 4A). Sin embargo, revueltos siRNA no dio lugar a una inhibición significativa (Figura 4A). Se contó el número de colonias de células DLD-1 tratados con siRNA y un-tratado. Las colonias de células CK2α-siRNA tratados fueron significativamente menores que las de los no tratada y revueltas células siRNA tratados (se redujo a 33% (día 8) y 57% (día 14), de los de células no tratada, respectivamente ) (Figura 4B). Las fotomicrografías representativas se muestran en la Figura 4C. Los resultados indicaron un papel desempeñado por CK2α en la promoción de la proliferación celular y es consistente con los datos clínicos descritos anteriormente.
expresión Panel A. CK2α Nuclear en siRNA tratada y DLD-1 en las células de cáncer de colon un-tratado fue examinado por El análisis de transferencia Western. Panel B. Los histogramas representan los resultados del ensayo de proliferación celular basado en el promedio de tres experimentos independientes. * Denota
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con las células DLD-1 no tratada. Grupo C. Las microfotografías representativas.
Discusión
Nivel elevado CK2α ARNm se ha informado en varios cánceres humanos, incluyendo el melanoma y el cáncer de pulmón [32], [33]. Sin embargo, a pesar de estos estudios, los datos clínicos relacionados con la expresión específica de CK2α a nivel de proteínas son escasos. Un estudio reciente mostró una elevada expresión de proteínas CK2α en el cáncer de próstata [30]. Para nuestro conocimiento, este es el único estudio mediante inmunohistoquímica para evaluar la expresión CK2α en los cánceres humanos. La expresión de CK2α nuclear en CRC humano es aún desconocido. En el presente estudio, se evaluaron los niveles de expresión de CK2α nuclear en los tejidos colorrectales a partir de 245 pacientes con CRC, y los resultados mostraron que la expresión CK2α nuclear fue mayor en los tejidos tumorales colorrectales que en los tejidos colorrectales no tumorales.
Además, nuestros datos muestran la acumulación nuclear CK2α en el CCR, en consonancia con el estudio previo realizado en el cáncer de próstata. La base mecánica de la acumulación nuclear CK2α Actualmente no está claro, pero, como una subunidad catalítica CK2, su presencia continua en el núcleo podría no sólo estar relacionado con el aumento de la capacidad proliferativa de las células tumorales indiferenciadas, sino también a su resistencia marcada a las señales apoptóticas. ¿Cuál podría ser la consecuencia funcional de la acumulación nuclear de CK2 en las células cancerosas? Un estudio realizado por Scaglioni et al. demostró que CK2 fosforila la proteína de la leucemia promielocítica (PML, un supresor de tumor) y dirigido para la degradación por el proteasoma [34]. La pérdida de sitio de fosforilación de CK2 crítico en PML dio lugar a la estabilización de esta proteína, el aumento de la apoptosis inducida por PML. Por otra parte, en no pequeñas de cáncer de pulmón de células humanas, existe una relación inversa entre la expresión de PML y la actividad CK2. Desde PML es una proteína nuclear de matriz asociada, una acumulación nuclear de CK2 puede ser funcionalmente relevante para inactivar las funciones de tumor supresor de PML. En otro estudio, CK2 se ha descrito recientemente como un regulador clave de la Nkx3.1 supresor de tumores en las células de cáncer de próstata LNCaP. Al igual que la LMP, se ha descubierto que el bloqueo de la actividad CK2 en las células LNCaP con apigenina inhibidor condujo a una rápida disminución en la acumulación de Nkx3.1 que fue rescatado por la inhibición del proteasoma [35].
En el presente estudio, hemos demostrado por la primera vez que la sobreexpresión de CK2α nuclear en los tejidos de CRC se correlaciona estrechamente con varios parámetros clínico, incluyendo la profundidad de la invasión tumoral, metástasis en los ganglios linfáticos y la invasión perineural. Aunque los mecanismos subyacentes a estas asociaciones aún no están claros, varias líneas de evidencia para estas correlaciones se discutirán a continuación. En primer lugar, la evidencia de la asociación entre la sobreexpresión de CK2 nuclear y la profundidad de la invasión proviene de metaloproteinasas de la matriz (MMPs), que durante mucho tiempo han sido asociados con la invasión de células del cáncer y la metástasis [36]. Un estudio reciente mostró que las células de cáncer de próstata humano PC-3 que sobreexpresan membrana de tipo-1 metaloproteinasas de matriz (MMP-MT1) creció más rápidamente que las células de control transfectadas de manera simulada [37]. Este resultado sugiere que la invasión de promoción de MT1-MMP está directamente vinculada a la agresividad del tumor. De todo el genoma de perfiles de expresión de MT1-MMP-sobreexpresan frente a las células cancerosas silenciados-MT1-MMP y un análisis de minería de datos adicional de la base de datos de expresión preexistente de 190 tumores humanos de los 14 tipos de cáncer llevó a identificar 11 genes, incluyendo CK2, la expresión de que se correlacionaban con firmeza y universalmente con la de MT1-MMP [38]. En segundo lugar, mediante el uso de inmunohistoquímica, la asociación entre el VEGF-C y el desarrollo de metástasis en ganglios linfáticos ha sido descrito por Yonemura Y et al [39]. En respuesta a la hipoxia, sucedido en la mayoría de los tumores que crecen más grande que 1 mm
3, la expresión de VEGF-C puede ser estimulada por la hipoxia-inducible factor-1 de (HIF-1) [40]. Se ha demostrado que los inhibidores de CK2 bloquearon la activación de HIF-1, y luego la expresión de VEGF-C [41]. Por último, la formación de neuritas aumento demostrado en los
in vitro
estudios anteriores sugiere que la migración axonal puede ser un elemento clave de la invasión perineural. el crecimiento axonal es un proceso complejo que requiere de factores de crecimiento neurotróficos y moléculas de guía axonal [42], [43]. Un estudio realizado por Arévalo et al. mostró que el factor de crecimiento nervioso, uno de los factores de crecimiento neurotróficos, puede estimular el crecimiento de axones a través de la activación de CK2 [44].
Nuestro estudio demostró que la sobreexpresión de CK2α nuclear puede ser un marcador de pronóstico independiente para CRC. Los datos clínicos que tratan con el valor pronóstico de CK2α son limitadas. El uso de perfiles de expresión génica global, el gen CK2α se ha identificado como un marcador de pronóstico en pacientes con carcinoma de células escamosas del pulmón [29]. Laramas et al. proporcionado la evidencia de una fuerte asociación entre una localización nuclear de CK2α pobres y factores pronósticos en el cáncer de próstata humana [30]. Además, los estudios de Kim et al. mostró que la sobreexpresión de la proteína CK2α en la leucemia se asocia con un peor pronóstico de los pacientes [31]. Hasta donde sabemos, no hay ningún informe de mencionar la importancia pronóstica de CK2α nuclear en CRC humano. Es de destacar observar que, por primera vez, la sobreexpresión de CK2α nuclear puede ser un marcador de pronóstico independiente para CRC. La sobreexpresión de CK2α nuclear es por lo tanto un marcador útil para predecir el resultado de los pacientes con CRC que tenían una resección quirúrgica del tumor. Los pacientes con CCR que muestra la sobreexpresión de CK2α nuclear deben ser seguidos cuidadosamente.
Materiales y Métodos
Los sujetos del estudio
La cohorte de pacientes compone de 245 casos de CCR consecutivos desde 1998 hasta 2002 sustanciar los factores patológicos y clínicos y los resultados clínicos. Ninguno de estos pacientes habían recibido quimioterapia y /o radioterapia preoperatoria. La parte no tumoral fue tomado de la mucosa colorrectal macroscópicamente normal del tumor en la muestra de colorrectales resecados. parámetros clínico-patológicas de los CRC se determinaron de acuerdo con la clasificación de la AJCC. La duración del seguimiento fue definida como el período comprendido entre la fecha de la operación y el día de la última visita, de acuerdo con el expediente del paciente. La junta de revisión institucional a Chi-Mei Medical Center aprobó el protocolo de adquisición de tejido para realizar este estudio. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada participante antes de la adquisición de tejidos. pares de tumor /no tumor de tejidos colorrectales se analizaron para la expresión CK2α nuclear.
inmunohistoquímico análisis
expresión
CK2α nuclear se analizó mediante técnicas de inmunohistoquímica. bloques de tejido incluidas en parafina se seccionaron a 5 micras y se transfirieron a portaobjetos de microscopio (Muto Pure Chemicals, Tokio, Japón). Hepatoma se utilizó un control positivo para CK2α. El control negativo consistió en la omisión del anticuerpo primario y la incubación con solución salina tampón de fosfato. Después de rehyfration y recuperación del antígeno, bloqueo de antígeno se realizó usando Dako VERDADERO peroxidasa bloqueo Solution (Dako, Carpinteria, CA) durante 5 minutos. Las diapositivas fueron incubadas con un anticuerpo primario: policlonal anti-CK2α (Stressgen Bioreagents, Victoria, Canadá) durante 30 minutos a temperatura ambiente en una dilución de 1:50. La detección de la tinción inmunorreactiva se llevó a cabo por el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un sistema sensible Dako EnVision VERDADERO detección (Dako) se utilizó como sistema de detección. Después de la incubación con diaminobenzidina durante 5-8 minutos, las secciones se contratiñeron y se montaron para la interpretación microscópica. La inmunoreactividad se obtuvo de forma independiente por dos patólogos (C-F y C Li-fang L). El porcentaje de células tumorales con inmunoreactividad nuclear moderada o fuerte se registró, y las puntuaciones de la misma paciente se promediaron para obtener una media del índice de etiquetado CK2α nuclear. El punto de corte del índice de marcaje medio para definir la sobreexpresión CK2α nuclear era la reactividad nuclear en & gt; 40% de células (valor medio). recopilación de datos clínicos y análisis de inmunohistoquímica se realizaron de forma independiente el uno del otro, en un estudio investigador ciego.
extracción de RNA y la síntesis de ADNc
De acuerdo con las instrucciones del fabricante, el ARN total de 10 tumores y no el tumor pares de tejidos colorrectales se aisló utilizando un kit de extracción de ARN (Sigma, St. Louis, MO). la calidad del ARN se analizó mediante el uso de Agilant 2100 Bioanalyzer. Los valores de RIN de todas las 20 muestras estaban por encima de 7. síntesis de ADNc se realizó como se describe en nuestro estudio anterior [45]. ADNc sintetizado se almacenó a -20 ° C hasta su uso.
Los cebadores y sondas
Taqman Gene ensayos de expresión que incluyen cebadores y sondas de CK2α y β-actina, un control interno, se compraron de Applied Biosystems. Los números de ensayo de CK2α y β-actina fueron Hs00751002_s1, y Hs99999903_m1, respectivamente.
Cuantitativo PCR en tiempo real
Los niveles de expresión de los genes diana se midieron utilizando cuantitativa en tiempo real PCR en el Sistema de ABI Prism 7300 de detección de secuencias (Applied Biosystems) tal como se describe en nuestro estudio anterior [45]. ciclo umbral (
C
t
) es el número de ciclo fraccional al que la fluorescencia generada por la escisión de la sonda excede de un nivel fijo por encima de la línea de base. Para un umbral elegido, un número de copias más pequeñas de partida da como resultado una mayor
C
t
valor. La cantidad de CK2α mRNA en tejidos tumorales o no tumorales, estandarizado frente a la cantidad de ARNm de β-actina, se expresó como Δ
C
tumor
o Δ
C
no tumoral
=
C
t
(CK2α) -.
C
t
(β-actina)
cultivo celular y el tratamiento siRNA
línea celular de cáncer de colon humano (DLD-1) se obtuvo del Instituto de Investigación y Desarrollo de la Industria de Alimentos (Hsinchu, Taiwán). Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal (Moregate BioTech, Bulimba QLD, Australia), 100 unidades /ml de penicilina G, 100 mg /sulfato de estreptomicina ml, y 250 ml B ng /anfotericina (todo de Sigma). Las células fueron cultivadas a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. Para el tratamiento siRNA, las células fueron transfectadas con 30 nM de ARNsi CK2α específica o revueltos (Applied Biosystems), utilizando SIPORT NeoFX agente de transfección. 48 horas después de la transfección, se extrajeron las proteínas nucleares, y luego de Western blot se realizó para evaluar el efecto del tratamiento con siRNA.
preparación de proteína nuclear
Un total de proteínas nucleares celulares y tisulares se extrajeron con NE -por nucleares y citoplasmáticas de extracción de reactivos (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. La concentración de proteína se determinó usando un Kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce Biotechnology) con albúmina de suero bovino como estándar.
Immunoblotting
muestras de proteína desnaturalizadas se sometieron a 10% SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las transferencias bloqueadas se incubaron a temperatura ambiente durante la noche con anti-CK2α anticuerpo policlonal (1:161 dilución). β-actina (Sigma, 1:8000 dilución) se utilizó como un control interno para la igualdad de la carga de proteínas. Las transferencias se incubaron adicionalmente con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Sigma) durante 1 hora a temperatura ambiente. reactivos de quimioluminiscencia (Pierce Biotechnology) fueron utilizados para visualizar las proteínas específicas, que se midieron a continuación, semi-cuantitativamente por densitometría. Todos los experimentos se llevaron a cabo tres veces, de forma independiente.
La proliferación celular ensayo
Después de siRNA tratamiento, las células transfectadas se cultivaron en un 37 ° C, 5% de CO
2 incubadora durante 4 , 8 y 14 días. Las colonias individuales (& gt; 50 células /colonia) se fijaron, se tiñeron con una solución de 1% de cristal violeta en metanol durante 30 minutos, y se cuentan. El ensayo se llevó a cabo tres veces, de forma independiente. Para cada experimento, se utilizaron dos pocillos por condición. Las barras de error se SD
El análisis estadístico
diferencias en la expresión CK2α nuclear entre los tejidos tumorales y no tumorales en el mismo paciente y en la proliferación celular se analizaron mediante un emparejado
t
prueba. Algunos parámetros clínico fueron examinados en este estudio. Ellos fueron la edad, el género, la profundidad de la invasión, el estado ganglionar, puesta en escena, grado de diferenciación, invasión vascular y perineural. La correlación entre la expresión CK2α nuclear y parámetros clínico se examinó con χ
2 test. Todos los puntos finales del tiempo hasta el evento de acuerdo a diversos parámetros clínico se representaron mediante el método de Kaplan-Meier y la significación se determinó mediante una prueba de log-rank uni-variable. En principio, los parámetros significativos en el análisis uni-variable (
P
≤0.05) se introdujeron en multivariable modelo de regresión de Cox para determinar la razón de riesgo y la independencia de impacto pronóstico de un modo por pasos hacia atrás. Todos los datos fueron analizados utilizando el software SPSS versión 14 (SPSS, Chicago, IL). Un
valor de P Red de & lt; 0,05 se consideró significativo
Reconocimientos
Los autores desean agradecer a Kuo-Shan Wen por su ayuda con la inmunohistoquímica.. Los autores también desean agradecer a Wen-Chun Chen por su ayuda en la recopilación de datos clínicos.