Extracto
iniciación de la traducción eucariótica factor de 5A2 (EIF5A2) juega un papel importante en la progresión tumoral y la evaluación pronóstico. Sin embargo, hay poca información disponible sobre su posible papel en el cáncer gástrico. Este estudio tuvo como objetivo investigar la función de EIF5A2 en la progresión tumoral y sus mecanismos potenciales. EIF5A2 expresión se mide en líneas celulares de cáncer gástrico humano, la línea inmortalizada de células epiteliales de la mucosa gástrica (GES-1) y tejidos de cáncer gástrico humano y derribado por la interferencia de ARN o upregulated de EIF5A2 plásmido transfección. La proliferación celular, la migración y la invasión fueron evaluados
in vitro
. Los objetivos de abajo EIF5A2 fueron examinados por Western Blot. EIF5A2 y su potencial proteína 1 de expresión diana asociados a metástasis (MTA1) se examinaron en 160 pares de cáncer gástrico humano y las muestras no tumorales adyacentes mediante inmunohistoquímica tinción (IHC), y se investigó su correlación con las características clinicopatológicas y supervivencia. Desmontables de
EIF5A2
o
MTA1
causó una inhibición aparente de la proliferación celular HGC27, la migración y la invasión. Después de la caída
EIF5A2 Hoteles en HGC27 células, los niveles de E-cadherina fueron upregulated y vimentina, ciclina D1, ciclina D3, C-MYC y los niveles mta1 se downregulated. La regulación positiva de EIF5A2 en las células MKN45 dio lugar a la inversa. IHC resultados mostraron una correlación positiva entre la expresión y EIF5A2 MTA1 en los cánceres gástricos (
P Hotel & lt; 0,001). Tanto EIF5A2 y MTA1 sobreexpresión se correlaciona con el estadio pT (
P = 0,018
y
P = 0,042
), fase PN (
P = 0,037
y
P
= 0,020) y la invasión linfovascular (
P = 0,016
y
P = 0,044
). EIF5A2 o sobreexpresión MTA1 se asoció significativamente con una mala supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad (Todo
P Hotel & lt; 0,05). Un análisis multivariante identificó EIF5A2 como un predictor independiente tanto para la supervivencia global (
P = 0,012
) y la supervivencia libre de enfermedad (
P
= 0,008) en pacientes con cáncer gástrico. Nuestros resultados indican que la regulación al alza EIF5A2 juega un papel oncogénico importante en el cáncer gástrico. EIF5A2 puede representar un nuevo predictor de supervivencia de los pobres y es una posible diana terapéutica para el cáncer gástrico
Visto:. Meng Q-B, Kang W-M, Yu J-C, Liu Y-Q, Ma Z-Q, Zhou L, et al. (2015) La sobreexpresión de la traducción eucariótica factor de iniciación 5A2 (EIF5A2) se correlaciona con la agresividad y la célula pobre supervivencia en el cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (3): e0119229. doi: 10.1371 /journal.pone.0119229
Editor Académico: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, CHINA
Recibido: 22 Enero, 2014; Aceptado: 29 Enero 2015; Publicado: 20 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Meng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales Municipal de Beijing (Nº 7132209), provincia de Hubei, la salud y la planificación familiar de proyectos de investigación científica (núm WJ2015MB137) y los grandes proyectos de ciencia y tecnología en la ciudad de Beijing (núm D141100000414004). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es una enfermedad altamente metastásico y uno de los más letal de los cánceres gastrointestinales. [1] a pesar de los avances en las terapias quirúrgicas y citotóxicos para GC, los tratamientos actuales disponibles para los pacientes con cáncer gástrico avanzado son muy limitado. [2, 3] para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, es crucial para dilucidar los mecanismos moleculares que promueven las propiedades invasivas y metastásicas de células GC.
traducción eucariótica factor de iniciación 5A2 (EIF5A2) está situado en cromosoma humano 3q26.2, y es miembro de la
eIF5A
familia de genes. [4] la sobreexpresión de
EIF5A2
ARNm en ciertas células cancerosas humanas, en contraste con la sobreexpresión limitado a testículo humano y partes del cerebro, sugiere
EIF5A2
es un oncogén potencial. [4] Los estudios anteriores encontraron que EIF5A2 se sobreexpresa en muchos cánceres humanos tales como adenocarcinoma de páncreas ductal, cáncer de ovario, cáncer hepatocelular, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal y melanoma , y fue correlacionada con la pobre supervivencia de los pacientes de cáncer y /o agresividad de células de cáncer. [5-11] estudios recientes han demostrado que EIF5A2 tiene habilidades cancerígenos a través de su activación del eje EIF5A2-MTA1 /C-MYC. [8] Sin embargo, hay poca información disponible sobre la expresión de la proteína EIF5A2, su significado pronóstico y papel potencial oncogénico en GC humana.
de acuerdo con ello, lo primero que investigó la expresión de
EIF5A2 Hoteles en líneas celulares humanas GC y su papel potencial en la proliferación celular, la migración y la invasión. A continuación, hemos identificado posibles proteínas diana aguas abajo para dilucidar los efectos del agotamiento EIF5A2 o regulación al alza de las funciones celulares de las células de GC. Por último, analizamos la correlación de EIF5A2 y expresión MTA1 en GC humana y su relevancia a los factores clínico-patológicos y la supervivencia en pacientes con cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
La estudio fue aprobado por el Comité de Ética de PUMCH, Academia china de Ciencias Médicas y Pekín Unión Medical College, Beijing, china, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente.
pacientes y muestras
tejido GC y muestras de tejidos no tumorales adyacentes emparejados se obtuvieron de 160 pacientes consecutivos que fueron sometidos a resección quirúrgica primaria para GC en Union Medical College hospital de Pekín (PUMCH) entre enero de 2002 y diciembre de 2006. Ningún paciente recibió quimioterapia neoadyuvante o radioterapia. Se obtuvieron los datos de supervivencia basado en dos registros de los pacientes y el seguimiento telefónico. El tiempo medio de seguimiento fue de 53 meses (rango, 1-113 meses). Otros dos pares de tejidos frescos GC y tejidos de la mucosa gástrica no cancerosos fueron obtenidas de pacientes sometidos a resección quirúrgica para el adenocarcinoma pobremente diferenciado del estómago a PUMCH en 2014.
Hemos definido la invasión linfovascular como la presencia de émbolos de células tumorales dentro de los espacios rodeada por un revestimiento endotelial claramente visualizada en la periferia de las secciones del tumor. [12, 13] los pacientes se organizaron de acuerdo a la 7ª edición de la clasificación TNM de la AJCC para el carcinoma del estómago. [14] Lauren histotype se dividió en intestinal y diffuse- categorías de tipo mixto. [15]
cultivo de células
Hay cinco tipos de líneas celulares humanas GC se obtuvieron del Centro de células de Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas (AGS y MGC803, Shanghai, china) y el Centro Móvil de Instituto de Ciencias médicas básicas (MKN45, SGC7901 y HGC27, Pekín, china). La línea de la mucosa gástrica inmortalizada de células epiteliales GES-1 se obtuvo de Pekín ComWin Biotech Co., Ltd (Beijing, China). Todas las células se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS; Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) a 37 ° C en una atmósfera de aire húmedo que contenía 5% de CO
2. Las células en fase de crecimiento logarítmico fueron utilizados para experimentos adicionales.
Derribo EIF5A2 o MTA1 por pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) guía
El siRNA específicamente contra EIF5A2 y MTA1 [16] y su falta de focalización Control de siRNA (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) se sintetizaron químicamente para este estudio. Las secuencias de siRNA EIF5A2 fueron los siguientes:#1: 5'-GGAUCUUAAACUGCCAGAATT-3 ', 5'-UUCUGGCAGUUUAAGAUCCTT-3';#2: 5'-GGUUCACCUUGUUGGAAUUTT-3 ', 5'-3 AAUUCCAACAAGGUGAACCTT; y#3: 5'-GCUUCCAGCACUUACCCUATT-3 ', 5'-UAGGGUAAGUGCUGGAAGCTT-3; la no focalización de control (NC1) siRNA: 5'-NVND UCC GAA UGE GUC ACG UTT-3 '; 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3 '). Las secuencias de siRNA MTA1 (Target 2 siRNA, T2-siRNA) fueron: 5'-GCUGAGAGCAAGUUAAAGCdTdT-3 ', 5'-GCUUUAACUUGCUCUCAGCdTdT-3') y se utilizó FAM marcada con siRNA (AM4620) como control no director siRNA (NC2 ).
Veinticuatro horas después de la siembra en placas de seis pocillos, las células fueron transfectadas con GC 100pmol EIF5A2-siRNA, MTA1-siRNA o siRNA control usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU. ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se recogieron por transferencia Western a las 48 h después de la transfección.
Plásmido construcción y transfección transitoria
vector de expresión EIF5A2 (pIRES2-EGFP-EIF5A2) se sintetizó por Life Technologies. Las células fueron transfectadas con pIRES2-EGFP-EIF5A2 o el plásmido de control usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante.
cuantitativa en tiempo real RT-PCR
Se aisló el ARN total usando el reactivo Trizol (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se realizó la PCR utilizando las secuencias de EIF5A2: hacia adelante: 5'-AACTGCCAGAAGGTGAACTAGG-3 '; inversa: 5'-GTTTCCGTTTATTTGCAGGGT-3 'y las secuencias para MTA1: hacia adelante: 5'-CCGGGCCTGCGAGAGCTGTTACAC-3'; inversa: 5'-CACGGCTTCCAGCGGCTTGCGTAC-3 '. PCR se realizó usando UltraSYBR mezcla (CWbio.Co.Ltd) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La transcripción inversa se realizó usando un kit PrimeScript RT Master Mix (Takara Biotecnología Co. Ltd., Dalian, China). Los productos de ADNc se sometieron a PCR en tiempo real utilizando un kit SYBR Premezcla Ex Taq II (TAKARA Biotecnología Co. Ltd.). PCR en tiempo real se realizó en un Sistema de StepOnePlus Real-Time PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) usando el siguiente programa: 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, y 60 ° C durante 1 minuto.
GAPDH
ARNm en cada muestra se cuantificó como control endógeno.
Western Blot
La concentración de proteína se cuantificó usando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce Thermo Scientific). Electroforesis en gel de sodio dodecil sulfato poliacrilamida (SDS-PAGE) se utilizó para separar los lisados celulares. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF y se bloquearon con solución salina tamponada con tris-y 0,1% de Tween 20 (TBST) que contiene 5% de albúmina de suero bovino, y después se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche: conejo anti-EIF5A2 o -C- MYC (1: 1000; Epitomics, EE.UU., catálogo 5549-1 o 1472-1), de conejo anti-MTA1, -E-cadherina o -vimentin (1: 1000; Cell Signaling, EE.UU., Catalog#5647, 3195 o 5741 ), o el ratón anti-GAPDH (1: 1000; Santa Cruz, Catalog#sc-25778). Las membranas se lavaron tres veces con TBST y se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anti-conejo o anti-ratón secundaria de anticuerpos (1: 3000; Santa Cruz, EE.UU., Catalog#SC-2004 o sc-2005) durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando ECL reactivos de detección (Pierce, EE.UU.). Las proteínas niveles relativos de expresión se normalizaron a GAPDH.
La proliferación celular ensayo
La proliferación de las células HGC27 y MKN45 se examinó utilizando un Recuento celular Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japón ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, 24 h después de la transfección con siRNA o plásmido, las células se sembraron a una densidad de 1 × 10
4 células /pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 0, 24, 48 y 72 h. Luego, en los diferentes puntos de tiempo, se añadió solución de 10μL de CCK-8 a cada pocillo y se incubó durante 2 h. La absorbancia se leyó a 450 nm en un lector de placas.
Transwell ensayos
Se detectó la capacidad migratoria e invasiva de las células de GC usando 24 bien transwell cámaras de cultivo de células (tamaño de poro 8.0μm, Costar , Cambridge, MA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Para el ensayo de invasión de células, las membranas de inserción fueron pre-recubiertas con Matrigel (BD, San Diego, CA, EE.UU.). Para el ensayo de migración de células, no se utilizó Matrigel. A las 24 h después de la transfección, las células se sembraron a una densidad adecuada (HGC27, 5 × 10
5 /ml; MKN45, 1 × 10
7 /ml) en la cámara superior y se cultivaron en OPTI-MEM (GIBCO, EE.UU.) sin FBS durante otras 24 h. Se dejó que las células para migrar hacia el medio RPMI 1640 que contiene 20% de FBS en la cámara inferior. Las células no migratorias en la superficie de la membrana superior se eliminaron con una punta de algodón, y las células migratorias unidos a la superficie de la membrana inferior se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con H & amp; E. El número de células invadidas se contaron en cinco campos seleccionados al azar bajo un microscopio.
La inmunohistoquímica (IHC) tinción y evaluación
tinción
IHC se realizó en secciones 5μm de espesor a partir de muestras incluidas en parafina. conejo monoclonal anti-anticuerpos humanos EIF5A2 (Epitomics, EE.UU., catálogo#5549-1), anticuerpo MTA1 conejo anti-humano (Cell Signaling, EE.UU., Catálogo#5647) y PV-6000 Sistema de Detección de Polímeros (ZSBG-BIO, China) eran utiliza para la tinción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, los portaobjetos con las secciones de parafina fueron desparafinados con xileno y rehidratada con etanol. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min. Para la recuperación de antígenos, los portaobjetos se y se hierve en un tampón de citrato 0,01 M (pH 6,0) durante 10 min tratado por microondas, y después se incubaron con 0,1% de tripsina a 37 ° C durante 5 min. Los portaobjetos se incubaron con el conejo monoclonal EIF5A2 anti-humano o anticuerpo MTA1 (1: 100 dilución) durante 1,5 horas a 37 ° C en una cámara humidificada. Como control tinción negativa, el anticuerpo primario fue sustituido con IgG de conejo no específico. Dos patólogos independientes evaluaron la tinción inmunohistoquímica de EIF5A2 y MTA1. Un método de puntuación semicuantitativa se usa con referencia al estudio anterior. [7]
El análisis estadístico
Todos los análisis se realizaron utilizando el software SPSS 12.0 (Chicago, IL, EE.UU.). Se utilizó la prueba de McNemar para la comparación de EIF5A2 o manchas en MTA1 GC humana y las muestras no tumorales adyacentes. Se utilizó la prueba de chi-cuadrado para comparar las diferencias entre las variables categóricas, mientras que el emparejado, dos colas de Student
t
-pruebas se utilizaron para comparar las diferencias entre las variables categóricas. La correlación entre EIF5A2 y MTA1 se analizó mediante el test de Spearman. Para el análisis de supervivencia univariante, las curvas de supervivencia se construyeron utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank. El modelo de riesgos proporcionales de Cox con el análisis multivariado se utilizó para investigar los factores pronósticos independientes. Todos los
P
valores fueron de dos caras, y
Los valores P Red de & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Todos los experimentos se realizaron al menos por triplicado técnicos y biológicos.
Resultados
Expresión EIF5A2 en las células y tejidos de GC y la validación de la intervención
Hemos investigado la expresión de EIF5A2 en cinco líneas celulares de cáncer gástrico y la línea de la mucosa gástrica inmortalizada de células epiteliales GES-1
in vitro fotos: por tanto QRT-PCR (Fig. 1A) y Western Blot (Fig. 1B). proteína EIF5A2 en los tejidos humanos GC fue mayor que la de los tejidos no tumorales distantes pareadas (Fig. 1C). Debido al alto nivel de expresión endógena de EIF5A2 y la relativamente alta eficacia de transfección en HGC27, seleccionamos esta línea celular para el análisis de RNAi, y se seleccionaron células MKN45 para EIF5A2 experimentos sobrerregulación debido a su expresión EIF5A2 relativamente baja y alta eficiencia de transfección.
(a)
EIF5A2
la expresión de ARNm fue examinado por cuantitativa en tiempo real RT-PCR con
GAPDH
que sirve como control de carga. (B) Expresión de proteínas en líneas de células se confirmó por análisis de transferencia de western con GAPDH como control de carga. (C) EIF5A2 proteína en tejidos humanos GC fue mayor que la de los tejidos no tumorales distantes pareadas. (D) Los tres EIF5A2-siRNAs, especialmente#1, reprimió de manera eficiente
EIF5A2
la expresión del ARNm en células HGC27. (E) de Western blot revela que EIF5A2 fue derribado por el tratamiento de EIF5A2- siRNAs en células HGC27. (F)
EIF5A2
ARNm se reguló de manera significativa por transfección transitoria de EIF5A2 plásmidos en células MKN45. (G) de proteína EIF5A2 se upregulated significativamente por transfección transitoria de EIF5A2 plásmidos en células MKN45. (H e I) T2-siRNA pudo reprimir eficazmente la expresión en células MTA1 HGC27.
Los tres siRNAs pudo reprimir eficazmente la expresión EIF5A2 en HGC27 células (Fig. 1D, E). Utilizamos siRNA#1 como objetivo EIF5A2-siRNA (T1-siRNA) en los experimentos posteriores. expresión EIF5A2 se upregulated significativamente por transfección transitoria de EIF5A2 plásmidos en células MKN45 (Fig. 1F, G). T2-siRNA pudo reprimir eficazmente la expresión MTA1 en HGC27 células (Fig. 1 H, I).
EIF5A2 o expresión MTA1 niveles influyeron en la agresividad de las células in vitro GC
caída en de EIF5A2 por T1 siRNA proliferación celular inhibió significativamente (Fig. 2A), la migración y la invasión (Fig. 2B) en HGC27 células en comparación con las de las células parentales. La regulación positiva de la expresión EIF5A2 por EIF5A2 plásmido promovió una mayor proliferación (Fig. 2C), la migración y la invasión (Fig. 2D) de las células MKN45. Desmontables de MTA1 por T2-siRNA proliferación celular inhibió significativamente (Fig. 2E), la migración y la invasión (Fig. 2F) en HGC27 células en comparación con las de las células parentales.
(A) Proliferación de EIF5A2-dirigido siRNA (T1-siRNA) y el control no específica (NC) HGC27 células se mide por CCK-8 ensayo de cada 24 h después de la transfección de siRNA. (B) La migración celular y la invasión se redujeron después de la transfección de T1-siRNA en células HGC27 (de Student
t-test
,
P Hotel & lt; 0,001 y
P = 0,001
, respectivamente). Columna, significa; bares, ± SD (de los triplicados). (C) Proliferación de EIF5A2-plásmido y plásmido de control MKN45 células se mide por CCK-8 ensayo cada 24 h después de la transfección del plásmido. (D) La migración celular y la invasión se incrementaron después de la transfección transitoria de EIF5A2-plásmido en células MKN45 (Estudiante de
t-test
,
P
= 2.06 × 10
-5 y
P
= 7.65 × 10
-6, respectivamente). Columna, significa; bares, ± SD (de los triplicados). Insertar imagen (derecha B y D derecha) muestra un campo de vista representativos de cada tratamiento. (E) La proliferación de MTA1 orientada siRNA (T2-siRNA) y el control no específica (NC2) HGC27 células se midieron por CCK-8 ensayo cada 24 horas después de la transfección de siRNA. (F) La migración celular y la invasión se redujeron después de la transfección de ARNsi en T2-HGC27 células (de Student
t-test
, tanto
P
= 0,001). Columna, significa; bares, ± SD (de los triplicados).
Posible expresión del gen diana después de la caída EIF5A2 o sobreexpresión
Después de la caída EIF5A2 en HGC27 células, los niveles del marcador epitelial E-cadherina se upregulated, mientras que los niveles de vimentina marcador mesenquimal se downregulated y acompañados de proteínas relacionadas con la proliferación de ciclina D1 y ciclina D3 y la metástasis asociada a C-MYC y MTA1 regulación a la baja (Fig. 3A). Por el contrario, después de EIF5A2 sobreexpresión en células MKN45, la expresión de E-cadherina se downregulated, mientras que el nivel de vimentina se upregulated y acompañada de ciclina D1, ciclina D3, C-MYC y upregulation MTA1 (Fig. 3B). la sobreexpresión o derribo de EIF5A2 no tuvo efecto significativo sobre la expresión de MMP9 en células HGC27 y MKN45 (Fig. 3A, B).
(A) Después de desmontables de EIF5A2 en HGC27 células, se upregulated los niveles de E-cadherina, mientras vimentina se downregulated acompañado de ciclina D1, ciclina D3 y C-MYC, y downregulation MTA1. (B) la sobreexpresión ectópica de EIF5A2 después de la transfección transitoria de EIF5A2-plásmido ciclina D1 sustancialmente upregulated, ciclina D3, C-MYC y MTA1, acompañado de regulación a la baja de E-cadherina, mientras que la vimentina se reguló.
Asociación de EIF5A2 y expresión MTA1 con características clinicopatológicas en pacientes con GC
las señales positivas de EIF5A2 fueron predominantemente localizados en el citoplasma y núcleo de células tumorales, mientras que las señales MTA1 se localizaron principalmente en el núcleo de las células tumorales (Fig. 4). Hemos definido los valores de inmunotinción de 0-3 como el nivel de expresión normal de EIF5A2 o MTA1, mientras que los valores de inmunotinción de 4-12 se definió como la sobreexpresión de EIF5A2 o MTA1. EIF5A2 sobreexpresión se encontró en 75 de las muestras de tumor, en comparación con sólo siete de los 160 tejidos de las mucosas no tumoral emparejados adyacentes (
P Hotel & lt; 0,001). Representante IHC tinción de EIF5A2 en adenocarcinoma gástrico moderada- o pobremente diferenciado, las células tumorales invasión de vasos y tejido no tumoral se muestra en la Fig. 4A, B, C y D, respectivamente. De los 160 casos analizados, 70 (43.75%) fueron positivos para MTA1, el análisis estadístico de los patrones de expresión mostró que había una correlación positiva entre la expresión y EIF5A2 MTA1 (r = 0,510,
P Hotel & lt; 0,001) . Las imágenes de tinción típicos para la sobreexpresión de EIF5A2 y MTA1 en adenocarcinoma gástrico se muestran en la Fig. 4E y 4F.
(A) Imágenes de inmunohistoquímica representativo que muestra EIF5A2 sobreexpresión en el adenocarcinoma moderadamente diferenciado-(× 200). (B) La sobreexpresión de EIF5A2 en el adenocarcinoma gástrico pobremente diferenciado (× 200). (C) La sobreexpresión de EIF5A2 en las células tumorales de invadir vasos (× 200). (D) expresión normal de EIF5A2 en el tejido no tumoral (× 100). (E) Las imágenes de coloración típica que muestra tanto EIF5A2 y la sobreexpresión MTA1 en la misma adenocarcinoma gástrico; (G) curvas de supervivencia general para los 160 pacientes con cáncer gástrico que reciben gastrectomía, agrupadas de acuerdo a la expresión EIF5A2 (
P Hotel & lt; 0,001). (H) curvas de supervivencia libre de enfermedad para 145 pacientes con cáncer gástrico que recibieron cirugía curativa, agrupadas de acuerdo a la expresión EIF5A2 (
P
= 0,001).
Como se muestra en la Tabla 1, tanto EIF5A2 y la sobreexpresión MTA1 se correlacionaron positivamente con la etapa más avanzada de pt (
P = 0,018
y
P = 0,042
), fase pN (
P = 0,037
y
P = 0,020
) y la invasión linfovascular positiva (
P = 0,016
y
P = 0,044
), mientras que no se asociaron con otras características clinicopatológicas.
Aumento EIF5A2 o expresión MTA1 correlacionada con una peor supervivencia en pacientes GC
en el último seguimiento, 75 de los 160 pacientes habían muerto. De éstos, 73 personas murieron a causa de la recurrencia del tumor. El análisis de Kaplan-Meier mostró que tanto la supervivencia global a los 5 años (OS) y la supervivencia (DFS) libre de enfermedad en el grupo sobreexpresión EIF5A2 eran más cortos que los del grupo de expresión EIF5A2 normal (
P Hotel & lt; 0,001 y
P = 0,001
, Fig. 4 G, H). Consistentemente, los pacientes con sobreexpresión MTA1 muestran un mal pronóstico para el sistema operativo y DFS (
P Hotel & lt; 0,001 y
P
= 0,001)
Las variables con significación en el análisis univariado por. los métodos de Kaplan-Meier se incluyeron en el análisis multivariado de regresión de Cox. Como se muestra en la Tabla S1 y S2 tabla, el análisis multivariado identificó que la sobreexpresión de EIF5A2 fue un factor independiente que influyen en ambos OS (cociente de riesgos instantáneos 1.831, 1.135 IC del 95% a 2.857,
P = 0,012
, S1 Tabla) y DFS (cociente de riesgos instantáneos 1.880, el 95% CI1.177 a 3.002,
P = 0,008
, S2 Tabla) de los pacientes que recibieron resección curativa para GC. Sin embargo, la sobreexpresión de MTA1 no produjo significado pronóstico independiente para el sistema operativo y DFS en el análisis multivariante.
Discusión
eucariótica factor de iniciación 2 5A (EIF5A2) se localiza en una región cromosómica frecuentemente observado para la inestabilidad cromosómica en GC y muchos otros tipos de cáncer, 3q. [17-20] EIF5A2, como uno de los únicos dos isoformas de la familia eIF5A, se confirma como una proteína oncogénica y también puede ser un biomarcador importante para el pronóstico y la diana terapéutica de muchos tipos de tumores humanos. [21] a pesar de que un estudio anterior había examinado
EIF5A2
la expresión génica en GC primaria, el presente estudio proporciona la primera evidencia de la importancia clínica de expresión EIF5A2 en GC humana y su posible papel en la la regulación de la agresividad de células GC. [22]
en primer lugar, realiza EIF5A2 desmontables y los experimentos de sobreexpresión
in vitro
. Los resultados mostraron que la supresión de EIF5A2 en HGC27 células condujeron a una disminución significativa en la proliferación celular, la migración y la invasión, mientras que su regulación por incremento en células MKN45 dio lugar a la inversa. Estos resultados son consistentes con los hallazgos previos en otros tumores. [8, 10, 23] también se encontró que desmontables MTA1 en HGC27 células inhibió significativamente la proliferación celular, la migración y la invasión. Sin embargo, el mecanismo por el cual EIF5A2 aumenta la agresividad de células GC es aún desconocido.
Por lo tanto, hemos realizado más estudios sobre los posibles objetivos de EIF5A2
in vitro
. Nuestros resultados mostraron que EIF5A2 regulada positivamente ciclina D1 y ciclina D3, que juegan un papel importante en la proliferación celular GC y la regulación del ciclo celular. [24, 25] Todos estos resultados apoyan la hipótesis de que EIF5A2 promueve la proliferación celular GC a través de la regulación positiva de la ciclina D1 y ciclina D3. Al mismo tiempo, los estudios anteriores demostraron que EIF5A2 promueve la invasión de células /metástasis y epitelio-mesenquimal transición (EMT) a través de la activación de MTA1 /C-MYC en el cáncer colorrectal. [8] MTA1 y C-MYC, así como el programa de EMT, también estuvieron involucrados en la regulación de la metástasis GC. [26-28] tanto, nuestro estudio MTA1, C-MYC y dos marcadores de EMT-asociado, e-cadherina y vimentina. Nuestros estudios demostraron que EIF5A2 MTA1 regulada positivamente, C-MYC y vimentina y negativamente regulado E-cadherina. Todos estos resultados sugieren que EIF5A2 podría regular la migración celular y la invasión de regulación de MTA1, C-MYC y EMT
in vitro
, pero se necesitan más estudios para investigar los mecanismos exactos
.
Los resultados del presente estudio también mostró que la proteína EIF5A2 se correlacionó positivamente con el estadio pT y pN etapa. Resultados similares se observaron también en el cáncer de ovario humano. [5] Estos resultados sugieren que EIF5A2 puede estar asociada con la invasión tumoral y la metástasis de los ganglios linfáticos en ciertos tipos de cánceres humanos, incluyendo GC. Más interesante aún, en el presente estudio, la sobreexpresión EIF5A2 se encuentra también en la invasión de células cancerosas (invasión de vasos), y la sobreexpresión de la proteína en el tejido EIF5A2 GC primaria correlacionado con la presencia de invasión linfovascular. De acuerdo con los resultados encontrados en estudios previos de otros tumores malignos humanos incluyendo tumores epiteliales de ovario, carcinoma de vejiga, cáncer de pulmón y cáncer colorrectal, la sobreexpresión de EIF5A2 en el presente estudio se correlacionó con una baja supervivencia de los pacientes con GC. [5, 8, 29] Además, el análisis multivariante mostró que la proteína EIF5A2 es un predictor independiente de mal supervivencia en pacientes sometidos a cirugía para GC.
MTA1, como un gen candidato asociados a metástasis, se ha demostrado que desempeñan el papel crítico en agresividad celular de cáncer gástrico. [27] La sobreexpresión de MTA1 se asocia significativamente con un mal pronóstico en pacientes pN0 GC. [30] El presente estudio demostró que la expresión EIF5A2 se correlacionó positivamente con la expresión MTA1 en los tejidos humanos GC. El análisis inmunohistoquímico combinado en estudios in vitro muestra que la MTA1-eje EIF5A2 puede jugar un papel importante en la agresividad del cáncer gástrico.
En resumen, los resultados del presente estudio mostraron que la sobreexpresión de EIF5A2 estaba estrechamente relacionada con GC la proliferación celular, la migración y la invasión a través de la metástasis asociada a proteínas MTA1. Al mismo tiempo, EIF5A2 puede ser importante en la regulación de EMT en GC. La sobreexpresión de EIF5A2 podría ser un factor predictor independiente de supervivencia de los pobres y una atractiva diana terapéutica para GC, pero se necesitan más estudios.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Análisis de los factores asociados con la supervivencia global (SG)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0119229.s001 gratis (DOC) sobre Table S2. Análisis de los factores asociados con la supervivencia libre de enfermedad (DFS) guía doi:. 10.1371 /journal.pone.0119229.s002 gratis (DOC)
Reconocimientos
Los autores desean agradecer al Sr. de-Tian Wang, Sra Yu-Feng Luo y el profesor Pei Gu por sus soportes técnicos.