Extracto
Recientemente, hemos encontrado que
ATP5J
estaba sobreexpresado en muestras de tejido de pacientes con cáncer colorrectal. Sin embargo, la significación clínica y la función de la sobre-expresión de
ATP5J
en estos pacientes sigue siendo poco clara. Hemos investigado estos temas en el estudio actual. Nuestros resultados indican que la expresión de
ATP5J
fue significativamente mayor en el tejido de cáncer colorrectal que en el tejido adyacente, y también fue significativamente mayor en los ganglios linfáticos metastásicos que en el tejido de cáncer primario (
P
& lt; 0,05). Se observó una correlación entre el
se detectó ATP5J
expresión y diferenciación del tumor, pero no hay correlación con el sexo, la edad, el estadio T, metástasis en los ganglios linfáticos, o el estado de supervivencia. Baja regulación de
ATP5J
expresión atenúa la capacidad de la migración celular y el aumento de la sensibilidad a la 5-fluorouracilo (5-FU) en las células de la línea celular DLD1. A la inversa, sobre regulación de
ATP5J
mayor expresión la migración celular y la disminución de 5-Fu sensibilidad, lo que sugiere que la función de ATP5J en el cáncer colorrectal podría implicar la migración celular y la sensibilidad de 5-FU.
Visto : Zhu H, Chen L, Zhou W, Huang Z, Hu J, Dai S, et al. (2013) La sobreexpresión de la
ATP5J
de genes se correlaciona con la migración celular y 5-fluorouracilo Sensibilidad en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (10): e76846. doi: 10.1371 /journal.pone.0076846
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 18 de febrero, 2013; Aceptado: August 31, 2013; Publicado: 4 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30700970 y 81272681), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades de Centroamérica y el Programa para el Equipo de Investigación innovadora en la provincia de Zhejiang (2010R50046). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es el segundo cáncer más común en los Estados Unidos y otros países desarrollados [1,2], y su incidencia está aumentando año tras año en los países en desarrollo [3,4]. Como sabemos, la carcinogénesis y el desarrollo de cáncer colorrectal comprende una serie de procesos complicados los que involucran múltiples genes y pasos. A pesar de un creciente conjunto de genes han sido reportados en la literatura [5-7], la búsqueda de nuevos genes que podrían estar relacionados con la carcinogénesis, el desarrollo, el diagnóstico o el tratamiento de cáncer colorrectal sigue. Por lo tanto, se realizaron búsquedas en la base de datos de Sage y confirmó los genes candidatos de interés por la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). En última instancia, hemos identificado un gen,
ATP5J
, que era sobreexpresada en el cáncer colorrectal.
Un componente de F
0, ATP5J es una proteína situada en la mitocondria que es una parte soluble en lípidos de ATP sintetasa [8]. El precursor de ATP5J consta de 108 aminoácidos y se despojado de 32 aminoácidos [9]. El producto que contiene los 76 aminoácidos residuales se retiene en la mitocondria para la transferencia de energía [9]. Tradicionalmente, ATP5J ha sido pensado para recuperar el intercambio entre el fósforo inorgánico y ATP, así como la actividad de ATPasa que se inhibe por oligomicina [10]. La investigación reciente, sin embargo, ha demostrado que ATP5J se distribuye ampliamente en la superficie de células endoteliales vasculares [11,12]. Por lo tanto, también puede ser secretada en la sangre y circular para combinar con la subunidad β de la ATP sintasa se encuentra en la superficie de las células endoteliales vasculares. Posteriormente, la actividad de la fosfolipasa A2 puede ser inhibida por la activación de la vía de señalización relacionada, que será seguida por la inhibición de la síntesis de prostaglandina que promueve la vasoconstricción [12]. Recenetly, algunas literaturas han demostrado que
ATP5J
gen se sobreexpresa en una serie de cánceres, incluyendo carcinoma de células renales y el carcinoma hepatocelular [13,14]. Sin embargo, la función de sobre-expresado
ATP5J Hoteles en cánceres todavía no se ha documentado.
De acuerdo con la introducción del Atlas de proteínas humanas (http://www.proteinatlas.org/ENSG00000154723 /normal), la proteína ATP5J puede ser expresado en muchos tejidos normales u órganos como el de colon y el recto. Nuestros datos preliminares también confirmó este fenómeno. Más importante aún, nuestros datos demuestran que
ATP5J
fue sobreexpresada en el cáncer colorrectal en comparación con el tejido normal. El objetivo del presente estudio fue investigar la importancia clínica y la función de la sobre-expresión de
ATP5J Hoteles en células de cáncer colorrectal. Nuestros resultados mostraron que
ATP5J
se sobre-expresan en muestras de tejido de pacientes con cáncer colorrectal y que había una correlación entre el
ATP5J
expresión y diferenciación del tumor. Por otra parte,.
Material y Métodos
Colección sobreexpresión de
ATP5J
migración celular mejorada y resistencia inducida a 5-fluorouracilo (5-FU) en las células del cáncer colorrectal de muestras de tejidos frescos
Este estudio fue aprobado por el hospital Sir Run Run Shaw y Comité de Ética de la Universidad de Zhejiang (NO.20100823). muestras de tejidos cancerosos frescas se obtuvieron directamente de las muestras de operación de 72 pacientes consecutivos que fueron sometidos a resecciones quirúrgicas para los adenocarcinomas colorrectales esporádicos primarias en el Departamento de Cirugía Colorrectal, Sir Run hospital Run Shaw, Hangzhou, Zhejiang, China, entre septiembre de 2010 y marzo de 2011 . escrito el consentimiento informado para la recogida de tejidos se obtuvo de todos los pacientes antes de sus procedimientos quirúrgicos. Ninguno de estos pacientes había tenido ninguna quimioterapia preoperatoria o radioterapia. Los tejidos adyacentes fueron recogidos de más de 5 cm de distancia del tejido canceroso.
Pacientes y recogida de datos clínicos
Las secciones en parafina de las muestras de un total de 79 pacientes con datos clínicos intactas que fueron diagnosticados con el cáncer colorrectal entre julio de 2006 y junio de 2007 en nuestro hospital se recogieron para la tinción inmunohistoquímica. El tiempo medio de seguimiento de estos pacientes fue de 52,6 meses, y la tasa de supervivencia global fue del 73,4% en el último seguimiento. Entre estos 79 casos, el tejido canceroso y pares de tejido normalmente adyacentes relativos se estudiaron en 51 casos, y se estudiaron muestras de tejido de ganglios linfáticos metastásicos en 26 casos. Todas las secciones se prepararon para inmunohistoquímica en las diapositivas que se utilizaron para comparar
ATP5J
expresión entre los diferentes tejidos.
Células y cultivo celular
líneas celulares de cáncer de colon humano DLD1, RKO, SW620, SW480, y Colo320 se adquirieron en el Instituto de Investigación de la célula en Shanghai, china. La línea celular de fibroblastos humanos normales (NHFB) se obtuvo de la bio-Centro-American Type Culture Collection Global (Manassas, VA, EE.UU.). Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 1% de glutamina, y una mezcla de antibióticos antimicótico 1 × (Invitrogen, Oficina de Beijing, Beijing , China). Todas las células se cultivaron a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2 y serían utilizadas para el análisis de RT-PCR. Además, DLD1 así como las células SW620 se utilizan posteriormente para una serie de otros experimentos.
transcripción inversa PCR
Las muestras de tejido fresco de 100 mg se homogeneizaron utilizando un molino con nitrógeno líquido seguido por lisis con el reactivo Trizol (Invitrogen Oficina de Beijing, Beijing, china). Las células cultivadas se mencionan como anteriormente se lisaron directamente usando el reactivo TRIZOL después del tratamiento. Se extrajo el ARN siguiendo las instrucciones del fabricante. Un microgramo de ARN de cada muestra fue inverso-transcrito en cDNA utilizando hexámeros aleatorios como cebadores de transcripción inversa (Oficina de Shanghai Applied Biosystems, Shanghai, China). A continuación, la reacción en cadena de la polimerasa típicas (PCR) para el
se realizó ATP5J
gen. El humano
GAPDH
gen se utilizó como un control interno para la normalización de la cantidad de ARNm. Las secuencias de los cebadores eran como sigue: 5'-TCAGCCGTCTCAGTCCATTT-3 'y 5'-CCAAACATTTGCTTGAGCTT-3' para
ATP5J
; 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 'y 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' para
GAPDH
.
tinción inmunohistoquímica
La inmunotinción se realizó utilizando un kit Maxvision (Maixin Biol, Fuzhou , China). Brevemente, las secciones de 4 micras de espesor, fueron cortadas de los bloques de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina, se montaron en portaobjetos recubiertos con polilisina, desparafinado en xileno, y rehidratada a través de una serie graduada de soluciones de etanol. Después de la desparafinación, los portaobjetos se trataron con peróxido de hidrógeno al 3% en solución de metanol durante 10 minutos para apagar la actividad de la peroxidasa endógena, el tratamiento a continuación, antígeno de recuperación se realizó a 121 ° C (autoclave) durante 5 minutos en tampón de citrato de sodio 10 mM (pH 7,4) . enlaces no específicos se bloquearon mediante el tratamiento de diapositivas con suero de cabra normal al 10% durante 10 minutos. Después de esto, los portaobjetos se incubaron con el anticuerpo ATP5J (Cell Applications, San Diego, CA, dilución 1: 8000) durante la noche a 4 ° C. A continuación, los portaobjetos se incubaron con una gota de reactivo Maxvision durante 30 minutos a temperatura ambiente. El desarrollo de color se llevó a cabo usando 0,05% de diaminobencidina y peróxido de hidrógeno 0,03% en 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, durante 5 minutos. Por último, las diapositivas se counterstained con hematoxilina de Meyer 1%. Como control negativo, secciones de tejidos fueron tratados con suero normal en lugar de anticuerpos ATP5J.
Evaluación de la tinción
Todas las secciones se puntuaron a ciegas con un microscopio óptico. Las células con una estructura clara y gránulos de color marrón-amarillo que eran más altos que el fondo se consideraron positivos; de lo contrario, se consideraron negativos células. Para cada diapositiva, se examinaron 5-10 campos de gran aumento (x400). A continuación, los portaobjetos se obtuvo de acuerdo con el porcentaje de células positivas: 0 (& lt; 5%), 1 (5-25%), 2 (26 a 50%), 3 (51-75%), o 4 (76- 100%). Al mismo tiempo, las diapositivas se obtuvieron de acuerdo con la intensidad de la tinción: 1 (amarillenta), 2 (marrón-amarillo) o 3 (marrón) [15]. La puntuación final se calcula como la suma de estos dos anotaciones.
Western blot
Las células se lavaron con PBS frío y se sometieron a lisis en tampón de lisis de Laemmli. Cantidades iguales de lisado se separaron usando electroforesis en 10% de dodecil sulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y después se transfirieron a Hybond aumento de quimioluminiscencia (ECL) membranas (Amersham Bioscience, Inglaterra). Las membranas se bloquearon a continuación con tampón de PBS que contenía 5% de leche baja en grasa y 0,05% de Tween-20 durante 1 hora o durante la noche a 4 ° C, se lavaron tres veces con PBS que contenía 0,05% de Tween-20 (PBST), y se incubaron con anticuerpo ATP5J durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. Después de ser lavado con PBST de nuevo, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y se revelaron con un kit de detección de quimioluminiscencia (kit ECL, Amersham Bioscience, Inglaterra). Anticuerpo de conejo anti-humano ATP5J se adquirió de Cell Applications. β-actina se utilizó como control de carga.
Construcción del plásmido que expresa
ATP5J
Un plásmido que contiene el pOTB7
ATP5J
secuencia fue adquirido de Invitrogen (ID clon 3357779). La
ATP5J
secuencia se clonó en un p △ E1sp1A plásmido utilizando enzimas EcoRI /XhoI. A continuación, se digirió adicionalmente y se clonó en un plásmido pcDNA3.1 (+) utilizando enzimas BamHI /HindⅢ para obtener un nuevo plásmido denominado pcDNA3.1 (+) /ATP5J. Después de la expresión de
ATP5J
se confirmó, se utilizó este nuevo plásmido para la siguiente parte del estudio.
transfección de células y colonias estables selección
Para la transfección, las células fueron en placas de 24 pocillos a una densidad de 1x10
5 células por pocillo y se dejaron crecer durante la noche a 90-95% de confluencia. El día siguiente, las células se transfectaron con la mezcla de 0,8 g de plásmido ATP5J shRNA (Origene, EE.UU.), pcDNA3.1 (+) /plásmido ATP5J, o plásmido de control negativo (Origene, EE.UU.) más 2 l Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) en 100 medio libre de suero l de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para producir las células transfectadas de manera estable después de la transfección con el plásmido correspondiente, se añadieron 10 g /ml de puromicina (Roche, Mannheim, Alemania) a las 48 horas para el medio (DMEM + 15% FBS). Las células se dejaron en medio selectivo durante 2 semanas; Después de este tiempo que se tripsinizaron y se volvieron a cultivar en un medio selectivo para la propagación.
viabilidad de las células de ensayo
viabilidad celular se determinó usando un ensayo de MTT (3- (4,5 dimetiltiazol-2-il) -2 , 5 difeniltetrazolio; Sangon, Shanghai, china). Brevemente, las células (5x10
3 por pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos para la observación a una serie de puntos de tiempo. Se añadió entonces 100 l de solución de MTT (10 mg /ml) a cada pocillo, y la incubación se continuó durante 4 horas antes de que se retiró el medio. A continuación, 100 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) se aplicó a cada pocillo durante otros 10 minutos. Por último, el valor de OD
570 nm se determinó; este valor representa la viabilidad celular. Cada experimento se realizó por cuadruplicado y se repitió al menos dos veces.
Cell ensayo clonogénico
1000 células se cultivaron en placas de 10 cm con medio de cultivo normal en un incubador que contenía 5% de CO
2 a 37 ° C durante 14 días. Las colonias individuales (& gt; 50 células por colonia) se fijaron y tiñeron con una solución que contiene 0,25% de cloruro de metilrosanilina y 20% de etanol durante 20 minutos. Las colonias se contaron usando el software Optimas (Media Cybernetics LP, Silver Spring, MD, EE.UU.). Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió dos veces.
citometría de flujo ensayo
Las células se tripsinizaron y se lavó una vez con PBS frío. A continuación, las células se fijaron con etanol durante la noche 70% frío a 4 ° C. Treinta minutos antes de que se sometieron a ensayo, se realizó con yoduro de propidio (PI) tinción como se describe anteriormente [16 a 18]. Citometría de flujo se realizaron ensayos en el laboratorio central del Hospital Sir Run Run Shaw.
cicatrización de heridas ensayo
La migración celular se estudió utilizando un ensayo de cicatrización de heridas cero. Las células (5x10
5 por pocillo) se sembraron en placas de seis pocillos y se dejaron adherir durante 24 horas. Las células se trataron con 10 mg /ml de mitomicina C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 3 horas, se lavaron con PBS, a continuación, simplemente heridos con una punta de pipeta. se añadió medio completo fresco, y se dejó que las células para cerrar la herida durante 48 horas o menos. Las fotografías de la misma posición de la herida fueron tomadas en puntos de tiempo correspondientes. El experimento se realizó por triplicado.
La migración de células de ensayo
Las células se trataron con tripsina y se resuspendieron en DMEM que contenía 1% de FBS a una densidad de 1x10
6 células /ml. En total, 100 l de la suspensión de células se sembraron en un 24 pocillos Transwell (Costar, Corning, NY). DMEM (600 l) que contiene 10% de FBS se colocó en la cámara inferior. Después de la incubación durante 24 horas, las células que quedan en la cámara superior se retiraron cuidadosamente con un bastoncillo de algodón, y la membrana se cortaron utilizando un cuchillo de funcionamiento. El lado que mira hacia la cámara inferior se tiñó con 0,05% de colorante cristal violeta, y se contaron las células unidas bajo un microscopio óptico. El experimento se repitió tres veces.
El análisis estadístico
Correlación entre los
ATP5J
expresión y características clínicas se evaluó mediante análisis de correlación, y se evaluaron las diferencias entre los grupos utilizando la Wilcoxon -par emparejado prueba o por ANOVA utilizando el software SPSS15.0 (SPSS, Inc., Chicago, EE.UU.).
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
ATP5J
estaba sobreexpresado en tejidos de cáncer colorrectal clínicos
En la base de datos de Sage (http:. //cgap.nci.nih.gov/SAGE/AnatomicViewer), se realizaron búsquedas para una serie de genes candidatos esos son expresados diferencialmente en el cáncer colorrectal. Se identificaron varios genes de interés, incluyendo tetraspanin TM4-C, oligophrenin 1, ATP5J, glicoproteína transmembrana A33 precursor, DHRS9, citidina deaminasa, uroguanilina, y la fosfatasa de especificidad dual 1. Sin embargo, nuestros resultados primarios de RT-PCR indicaron que sólo era uroguanilina reduce y que
ATP5J
estaba sobreexpresado en el cáncer colorrectal (Figura 1A). Los otros genes se mantuvieron sin cambios o indetectable en nuestro experimento (datos no mostrados). Dado que la expresión de la uroguanilina y su función en el cáncer de colon se ha aclarado en un informe anterior [19], pero no para el
ATP5J
gen, este último fue elegido como el único objetivo de nuestro estudio.
(a) RT-PCR para la
ATP5J
y
uroguanilina
genes. (B) los resultados de la tinción inmunohistoquímica para el tejido adyacente y el tejido canceroso. (C) Resultados de la tinción inmunohistoquímica para el tejido adyacente, el tejido canceroso y el tejido ganglionar metastásica.
Para confirmar la expresión de
ATP5J
en el cáncer colorrectal, además se analizó la expresión de
ATP5J
ARNm por RT-PCR en los tejidos tumorales frescos y los tejidos normales adyacentes de los 72 pacientes consecutivos (Tabla 1). Los resultados indicaron que los porcentajes positivos de RT-PCR para
ATP5J Hoteles en los tejidos de los pacientes con cáncer colorrectal alcanzaron aproximadamente 54,17%, que fue similar entre el cáncer de colon y cáncer rectal. Sin embargo, la expresión de
ATP5J
fue significativamente mayor en el tejido de cáncer colorrectal que en el tejido normal entre los pacientes PCR-positivos (Tabla 1,
P
& lt; 0,01). Nuestros resultados de la tinción inmunohistoquímica de secciones de parafina de un grupo de 51 pacientes mencionados en
Los pacientes y los datos clínicos colección
sección indican un resultado similar, pero con una relación positiva más alta (Figura 1B y Tabla 1,
P
& lt; 0,05). Además inmunotinción resultados también demostraron que
ATP5J
expresión fue significativamente mayor en los ganglios linfáticos metastásicos que en el tejido de cáncer primario (Figura 1C y Tabla 2,
P
& lt; 0,05). Condición ATP5J
seguir NO.
casos positivos
distribución de casos positivos 'por la expresión en el tumor ATP5J vs tejido adyacente
P
valor
T
* & gt; Un
*
T = A
T & lt; Un
ARNm por PCR7239 (54,2%) 32 (82,1%) 6 (15,4%) 1 (2.6%) & lt; 0.01Protein por IM
* 5149 (96,1%) 32 (65,3%) 15 (30,6%) 2 (4,1%) & lt; 0.05Table 1. Condición de expresión ATP5J en tumor colorrectal y del tejido adyacente
* T:. tumor; A: adyacente; . IM: tinción inmunohistoquímica CSV Descargar CSV ATP5J en MLN
*
seguir NO
MLN & gt; T = T
MLN
MLN & lt; T
P
valor
Positive25 (96,2%) 12 (46,2%) 8 (30,8%) 5 (19,2%) & lt; 0.05Negative1 (3,8%) - 1 (3,8%) Tabla 2. Condiciones de expresión ATP5J en tumor colorrectal metastásico y la linfa * nodos.
MLN: linfático metastásico nodos CSV Descargar CSV
la correlación entre la sobreexpresión de
ATP5J Opiniones y características clínicas de los pacientes con cáncer colorrectal
Para analizar la relación entre el exceso -expresión de ATP5J y las características patológicas clínicas de los pacientes con cáncer colorrectal, las secciones de parafina de 79 pacientes, tal como se mencionó en la sección de
pacientes y recopilación de datos clínicos
, se recogieron. La tinción inmunohistoquímica se realizó en estas diapositivas y las puntuaciones se calcularon como se mencionó anteriormente. De acuerdo con estos resultados,
ATP5J
expresión se puede subdividir en dos filas: débil (≤4) y fuerte (& gt; 4). A continuación, se realizó un análisis de correlación utilizando el software SPSS; los resultados se muestran en la Tabla 3. Entre las características clínicas de la lista, único grado de diferenciación tenía una correlación con
ATP5J
expresión. El género, la edad, el estadio T, metástasis en los ganglios linfáticos, así como el estado de supervivencia no mostró una correlación con el
ATP5J
expresión. Estos resultados indican que
ATP5J
expresión en tumores bien diferenciados era más débil que en los tumores pobremente diferenciados o moderadamente (
P Hotel & lt; 0,05).
Variable seguir NO
débil fuerte
P vaule
GenderFemale358270.281Male441529Age & gt; 65 yr286220.271≤65511734T stageT1,2196130.789T3,4601743DifferentiationWell4116250.045Poor /moderate38731Histologic MNV
* Absent3612240.408Present431132Survival statusSurvival5818400.538Died21516Table 3. Correlación entre ATP5J expresión y características patients'clinical
* MNV:. metástasis en los ganglios linfáticos CSV Descargar CSV
Detección de
ATP5J
expresión en líneas celulares de cáncer de colon
era difícil de aclarar la función subyacente de ATP5J en el cáncer colorrectal que sólo depende de los análisis clínicos. Se necesitan más estudios biológicos moleculares para este fin. Por lo tanto, nuestra atención se desplazó de los pacientes con cáncer colorrectal a líneas celulares. Para entender la expresión de
ATP5J
en líneas celulares de cáncer colorrectal, se recogieron cinco líneas celulares de cáncer colorrectal (DLD1, RKO, SW620, SW480, y Colo320), y la normal de fibroblastos humanos (NHFB) se utilizó como normales control de células. En primer lugar, se recogieron el producto de ARNm a partir de estas líneas de células y se realizó RT-PCR como se describe anteriormente. Estos resultados mostraron que ATP5J ARNm se sobre-expresa en todas las líneas celulares de cáncer de colon, pero no en NHFB (Figura 2A). A continuación realizó la transferencia Western de las muestras de proteína de estas líneas celulares. Los resultados demostraron un fenómeno similar. ATP5J proteínas se sobre-expresa en cuatro líneas celulares de cáncer de colon (excepto RKO), en comparación con NHFB (Figura 2B). Sobre la base de estos resultados, elegimos principalmente las células DLD1 para la siguiente parte de nuestro estudio; DLD1 mostró un moderado grado de
ATP5J
expresión, que era conveniente para la observación de la baja regulación, así como la regulación de la expresión génica en la misma línea celular utilizando técnicas moleculares.
RESULTADOS (a) RT-PCR para ARNm ATP5J. (B) los resultados de Western blot para la proteína ATP5J.
El descenso de regulación de
ATP5J
expresión atenuada migración celular y el aumento de 5-Fu sensibilidad en las células DLD1
Primeros , se redujeron reguladas
ATP5J
expresión en células DLD1 través de una transfección estable con un plásmido que expresa ARNhc ATP5J orientación. Después de la selección de colonias, transferencia de Western se llevó a cabo (Figura 3A). La expresión de ATP5J se había reducido regulado de manera espectacular en el clon 4 y marginalmente en el clon 9. Se eligió el clon 4 para su estudio y lo definió como ATP5J shRNA /4. Mientras tanto, el clon 2 de control de shRNA se utilizó como control de vector (Vector), y de tipo salvaje DLD1 (WT) se utilizó como control simulado.
(A) resultado de Western blot para la proteína ATP5J en diferentes clones de células DLD1 después de la transfección estable con el mismo plásmido ATP5J shRNA. (B) Ensayo de curación de heridas de WT, Vector, y ATP5J shRNA /4 células DLD1. Los datos representan uno de tres experimentos similares (aumento original: x100). (C) La migración de WT, Vector, y ATP5J shRNA /4 DLD1 células se ensayó usando un sistema de 24 Transwell. Las imágenes de células migraron fueron tomadas 24 horas después de la siembra (aumento original: x100). Los datos representan uno de tres experimentos similares. análisis (D) cuantitativa de tres ensayos de migración celular. Los valores representan las medias ± SD. *
P Hotel & lt; 0,05; relaciones (E) apoptóticos de WT, Vector, y ATP5J shRNA /4 células DLD1 después del tratamiento con 50 mmol /l de 5-FU durante 3 días. Los datos representan uno de dos experimentos similares. Los valores representan las medias ± SD. *
P
. & Lt; 0,05
Los resultados del ensayo de MTT, el ciclo celular por citometría de flujo, o la formación clon mediante ensayo clonogénico no revelaron diferencias en la supervivencia celular entre WT, Vector y ATP5J shRNA /4 grupos (datos no presentados). Sin embargo, los datos del ensayo de cicatrización de heridas indicaron que las células en el /4 grupo ATP5J shRNA tomaron & gt; 48 horas para cerrar una herida de cero, mientras que las células en los grupos de WT y del vector tomaron & lt; 48 horas para curar una herida de tamaño similar (Figura 3B). Este resultado sugiere que la baja regulación de
ATP5J
atenuada la capacidad de la migración celular en las células DLD1. Para cuantificar el efecto de
ATP5J
baja regulación de la migración celular, se realizó un ensayo de migración más. Los resultados de este ensayo adicionales mostraron que el número de células migradas en la /4 grupo ATP5J shRNA se redujo significativamente en comparación tanto con los grupos WT y vector (Figura 3C y 3D,
P
& lt; 0,05).
Además, hemos querido evaluar la respuesta de las células cancerosas a la terapia anti-cáncer después de la expresión ATP5J fue cambiado. Para este propósito, se optó por 5-fluorouracilo (5-FU) para el siguiente estudio, debido a que es un fármaco de quimioterapia contra el metabolito de uso frecuente en el cáncer colorrectal. Nuestros resultados indican que la proporción de apoptosis de ATP5J shRNA /4 grupo fue mayor que el de ambos grupos de WT y del vector después del tratamiento con 50 mmol /L 5-Fu durante 3 días (Figura 3E, P & lt; 0,05). Este resultado sugiere que la baja regulación de
ATP5J
aumentó la sensibilidad de las células DLD1 a 5-FU.
Para confirmar aún más la función de ATP5J en la otra línea celular, derribaron la
ATP5J
expresión en células SW620 mediante el mismo plásmido como se mencionó anteriormente. Después de la selección de colonias, se identificó un clon en el que
ATP5J
expresión fue drásticamente reducido regulado; lo nombramos ATP5J shRNA /3 (Figura 4A). Los resultados tanto de la detección de la apoptosis y ensayos de viabilidad celular sugirieron que grupo el ATP5J shRNA /3 derivado de las células SW620 fue más sensible a 5-FU en comparación con los grupos de WT y del vector después del tratamiento con 50 mmol /L 5-Fu durante 3 días (Figura 4B y 4C,
P Hotel & lt; 0,05). Este resultado es consistente con nuestros datos previos de células DLD1 y valida aún más la función de ATP5J en células de cáncer de colon
.
(A) resultado de Western blot para la proteína ATP5J en diferentes clones de células SW620 después de la transfección estable con el mismo ATP5J plásmido shRNA. (B) Relación de apoptótica de WT, Vector, y ATP5J shRNA /3 SW620 células después del tratamiento con 50 mmol /l de 5-FU durante 3 días. ensayos (C) de viabilidad celular de WT, Vector, y ATP5J shRNA /3 SW620 células después del tratamiento con 50 mmol /l de 5-FU durante 3 días. Los datos representan uno de dos experimentos similares. Los valores representan las medias ± SD. *
P
. & Lt; 0,05
Sobre regulación de
ATP5J
mayor expresión la migración celular y la disminución de 5-Fu sensibilidad en las células DLD1
a continuación, hemos querido confirmar nuestro resultado utilizando una condición opuesta en la que em
ATP5J
expresión fue aún más hasta reguladas. Para lograr este objetivo, el pcDNA3.1 (+) /plásmido se transfectó de forma estable ATP5J en células DLD1. Después de la selección de colonias, transferencia de Western se llevó a cabo (Figura 5A). La expresión ATP5J fue hasta reguladas de manera espectacular en los clones 2, 3 y 4. Se eligió al azar clones 2 y 4 para su posterior estudio y los definió como ATP5J /A2 y ATP5J /A4, respectivamente. Mientras tanto, el clon 7 del plásmido control se utilizó como control del vector (Vector) y las células de tipo salvaje (WT) DLD1 fueron utilizados como control simulado.
(A) Resultado de Western blot para la proteína ATP5J en DLD1 las células después de la transfección estable con plásmido pcDNA3.1 (+) /ATP5J. (B) Ensayo de curación de heridas de WT, Vector, ATP5J /A2, y las células ATP5J /A4. Los datos representan uno de tres experimentos similares (aumento original: x100). (C) Las migraciones de WT, Vector, ATP5J /A2, y las células ATP5J /A4 se analizaron utilizando un sistema de 24 Transwell. Las imágenes de células migraron fueron tomadas 24 horas después de la siembra (aumento original: x100). Los datos representan uno de tres experimentos similares. (D) Análisis cuantitativo de tres ensayos de migración celular. Los valores representan las medias ± SD. *
P Hotel & lt; 0,05. ratios (E) apoptótica de las células WT, Vector, ATP5J /A2 y ATP5J /A4 después del tratamiento con 50 mmol /l de 5-FU durante 3 días. Los datos representan uno de dos experimentos similares. Los valores representan las medias ± SD y *
P
. & Lt; 0,05
Los datos relativos a la supervivencia celular, ciclo celular y la formación de clon dieron resultados similares a los presentados anteriormente. No se observaron diferencias entre los grupos de WT, vector, ATP5J /A2, y ATP5J /A4 (datos no mostrados). El ensayo de cicatrización de heridas mostró que las células en los grupos ATP5J /A2 y ATP5J /A4 tomaron & lt; 44 horas para cerrar una herida de cero, mientras que las células en los grupos de WT y del vector tomaron & gt; 44 horas para curar una herida de tamaño similar ( Figura 5B). Este resultado sugiere que la regulación de los
ATP5J
migración celular mejorada en las células DLD1. Un análisis de migración celular más demostró que el número de células migradas en los grupos ATP5J /A2 y ATP5J /A4 se incrementó significativamente en comparación con los de los grupos WT y vector (Figura 5C y 5D,
P
& lt; 0,05). Mientras tanto, después del tratamiento con 50 mmol /L 5-Fu durante 3 días, las proporciones de apoptosis de los grupos ATP5J /A2 y ATP5J /A4 fue significativamente más bajos que los de los grupos de WT y del vector (Figura 5E, P & lt; 0,05), lo que indica que la regulación de los
ATP5J
células DLD1 inducidos a resistir al 5-FU.
Discusión
Nuestro estudio investigó el estado de
ATP5J
expresión en pacientes con cáncer colorrectal, y nuestros resultados demostraron que
ATP5J
se sobre-expresa en estos pacientes. Este resultado fue opuesta a la base de datos en Sage. Podría ser debido a la diferencia de tamaño de la muestra, así como el sesgo de selección de la muestra. De acuerdo con nuestros datos, hubo varias condiciones diferentes de expresión ATP5J en el cáncer colorrectal, uno de ellos se redujo. Además, el tamaño de muestra utilizado por la base de datos era muy pequeña. Por lo tanto, podría entenderse que teníamos una conclusión diferente sobre la expresión ATP5J en el cáncer colorrectal. Por otra parte, nuestros resultados se obtuvieron tanto en los niveles de proteína y debe, por lo tanto, ser convincente ARNm y.
Además, los resultados mostraron que el grado de diferenciación se correlacionó con
ATP5J
expresión. De acuerdo con la literatura publicada, la diferenciación del tumor fue un factor pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal [20,21]. En base a esto,
ATP5J
expresión puede estar correlacionado con el estado de supervivencia, sin embargo, nuestros datos no mostraron esta correlación. Adicional, nuestros resultados también indicaron que
ATP5J
expresión fue mayor en los ganglios linfáticos metastásicos en comparación con el tejido de cáncer primario correspondiente, pero no tuvo correlación con metástasis en los ganglios linfáticos. La discrepancia puede ser causada por muchos factores incontrolables clínicamente, en lugar de por las condiciones en los estudios de biología molecular, que fueron controladas exactamente. Podría ser también causada por el pequeño tamaño de los pacientes incluidos y necesita una investigación con muestras grandes. Independientemente de este desacuerdo, nuestros resultados adicionales perspicuously indicaron que la baja regulación de
ATP5J
expresión atenuada migración celular y el aumento de 5-Fu sensibilidad en las células DLD1.