Extracto
Antecedentes
Los microARN (miRNA) son pequeñas, los ARN no codificante (ácidos ribonucleicos) que regulan la traducción. Varios miRNAs se han demostrado para ser alterado en tejido de cáncer de conjunto en comparación con el tejido normal cuando se cuantifica por microarray. Sobre la base de tal evidencia previa de la expresión diferencial, optamos por estudiar el significado funcional de miRNAs
miR-30a
y
-191
alteraciones en el cáncer de pulmón humano.
Metodología /principales conclusiones
la importancia funcional de miRNAs
miR-30a
y
-191
se estudió mediante la creación de transfectantes estables de la línea de adenocarcinoma de pulmón de células A549 y las células epiteliales bronquiales inmortalizado la línea BEAS-2B con modesta sobreexpresión de
miR-30a
o
-191
usando un sistema lentiviral. En comparación con los controles correspondientes, ambas líneas celulares que sobreexpresan
miR-30a
o
-191
no demuestran ningún cambio significativo en la distribución del ciclo celular, la proliferación celular, la formación de colonias adherentes, suave colonias en agar la formación, la formación de xenoinjerto en un modelo de ratón SCID por vía subcutánea, y el fármaco sensibilidad a la doxorrubicina y cisplatino. Hay un modesto incremento en la migración celular en líneas celulares que sobreexpresan
miR-30a
en comparación con sus controles.
Conclusiones /Importancia
La sobreexpresión de
miR-30a
o
-191
no da lugar a una alteración en el ciclo celular, la proliferación, la formación de xenoinjertos, y quimiosensibilidad de A549 y líneas de células BEAS-2B. Usando datos de microarrays de tumores enteros para seleccionar miRNAs específicos para el estudio funcional puede ser una estrategia subóptima
Visto:. Patnaik SK, Kannisto E, Yendamuri S (2010) La sobreexpresión de microARN
miR-30a
o
miR-191 en
A549 cáncer de pulmón o BEAS-2B líneas celulares de pulmón normal no altera el fenotipo. PLoS ONE 5 (2): e9219. doi: 10.1371 /journal.pone.0009219
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: December 11, 2009; Aceptado: 24 Enero 2010; Publicado: 15 Febrero 2010
Derechos de Autor © 2010 Patnaik et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo es apoyado por becas de investigación de la Fundación para la investigación Cirugía Torácica y Educación y el cáncer y Leucemia Grupo B; SY es apoyado por una beca de la Fundación Buswell. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la importancia de los ARN no codificantes en la regulación de procesos celulares ha llegado a ser cada vez más apreciado [1]. Los ARN no codificantes mejor estudiados son los microRNAs (miRNAs), 18-25 nt de longitud pequeña de ARN que regulan epigenetically traducción mediante la unión a una secuencia complementaria "semilla" común a su "objetivo" ARNm [2]. Como esta complementariedad no tiene que ser perfecto, un solo miARN puede regular la expresión de varios cientos de genes simultáneamente [3]. La explosión de la tecnología de microarrays ha llevado a su aplicación en la genómica de los genes miARN. Por lo tanto, antes de que se conoce la función de una proporción significativa de miRNAs, miARN perfiles de varios tejidos humanos normales y anormales se han realizado [4]. La clara diferencia entre los datos obtenidos entre miARN perfiles y perfiles de mRNA está en la magnitud de la expresión diferencial se observa en los grupos de comparación. Mientras que varias veces los cambios se observan con frecuencia en la expresión del ARNm utilizando estas tecnologías, los cambios veces con experimentos miARN son más modestos y están típicamente en el rango de 1 a 2 veces. Por lo tanto, los experimentos para estudiar la importancia biológica de estos cambios veces modestos son importantes para evaluar la importancia de estos cambios. Basado en datos publicados anteriormente de microarrays miARN que demuestran diferencias en la expresión en cánceres humanos en comparación con el tejido normal correspondiente, dos miRNAs fueron elegidos en este estudio para tales experimentos biológicos. Estos dos miRNAs fueron escogidos debido a alteraciones consistentes en su expresión entre los tejidos normales y cancerosas de varios órganos, un análisis bioinformático de sus objetivos previsto que sugiere un papel importante en la proliferación celular y la migración y poco trabajo publicado sobre sus roles funcionales en el cáncer de pulmón .
miR-30a
se encuentra en el cromosoma humano 6q.13 y se genera a partir de una unidad transcripcional intrónica que produce tres miRNAs:
miR-30a
,
-30C
y
-30e
[5]. Dos formas maduras de los genes existen -
miR-30a-3p
y
miR-30a-5p
. Varios estudios han detectado cambios en
miR-30a
expresión en el cáncer humano. Calin et al. demostrado una baja regulación de
miR-30a
en pacientes de leucemia linfocítica crónica (LLC) [6]. Del mismo modo,
miR-30a
es el regulado en el cáncer de pulmón [7], el cáncer de colon [8], el cáncer de páncreas [9], cáncer hepatocelular metastásico (en comparación con primaria) [10] y en la leucemia mieloide aguda (LMA) en pacientes con (11q23) translocación (en comparación con otros pacientes con LMA) [11].
miR-30a
es importante para el desarrollo de la corteza prefrontal a través de la regulación del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) [12] y en el desarrollo de los vertebrados hepatobiliar [13]. Otros objetivos de forma experimental confirmó
miR-30a ¿Cuáles son adenilato quinasa (AK1) y la proteína GW182 (Tnrc6a), un componente de la interferencia de ARN silenciar complejo [13].
MIR -191
se encuentra en el cromosoma humano 3p21.31 y se genera a partir de una unidad transcripcional intrónica que se pueden producir dos miRNAs:
miR-191
y
-425
[5]. Sólo una única forma madura de
miR-191
se sabe que existe.
miR-191
expresión está regulada en marcha en el páncreas [14], de colon, [7] cánceres de pulmón y de próstata. También es hasta reguladas en los pacientes con LMA con cariotipos anormales [11], y las reguladas en los pacientes con LLC [6].
miR-191
expresión también se altera en los pulmones expuestos al humo del cigarrillo [15]. No hay objetivos de mRNA
miR-191
se han verificado experimentalmente.
En este estudio, evaluamos los cambios fenotípicos observados por la sobreexpresión constitutiva de
miR-30a y
-191
, en una línea celular de adenocarcinoma de pulmón (A549) [16] y un bronquial línea de células epiteliales (BEAS-2B) inmortalizado [17]. La línea celular A549 fue elegido debido a la existencia de una gran cantidad de datos experimentales sobre su uso en diversos ensayos. La línea celular BEAS-2B fue elegido porque es la línea celular inmortalizada más cerca de epitelio bronquial normal. A medida que los efectos de la sobreexpresión de un microARN es un contexto específico, se compararon las alteraciones en el fenotipo de las células malignas y no malignas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
todos los estudios in vivo fueron aprobados por el Comité de Cuidado y uso de Animales institucional del Instituto del cáncer Roswell Park.
Cell Culture
humana de carcinoma bronquioloalveolar de pulmón A549 y BEAS-2B líneas de células epiteliales bronquiales normales eran obtenido a partir de ATCC® (Manassas, VA). Las células se cultivaron, respectivamente, en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM +; Invitrogen®, Carlsbad, CA) con suero bovino fetal al 10% (PAA Laboratories, Austria), y LHC-9 medio (Invitrogen®) a 37 ° C en 5% de CO
2. Las células transfectadas de forma estable se cultivaron en presencia de 2 g /ml de puromicina (Roche®, Indianapolis, IN).
Generación de líneas celulares transfectadas de forma estable
oligonucleótidos de ADN de cadena simple con humanos
pre-miR-30a
o secuencias y con voladizos sitio de enzimas de restricción
-191 gratis (miRBase adhesión identificadores MI0000088 y MI0000465, respectivamente) se obtuvieron de Integrated DNA Technologies ® (Coralville, IA). Las secuencias complementarias se hibridaron y el ADN de doble cadena resultante se ligó a Xho I /Not I digerido con vector pLemiR ™ (Open Biosystems®, Huntsville, AL). A549 células fueron infectadas con plásmidos usando el sistema Trans-Lentiviral ™ GIPZ embalaje (Open Biosystems, Huntsville, AL) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células TLA-HEK293TTM fueron transfectadas utilizando Arrest-In ™ con 37,5 g de ADN de plásmido en medio libre de suero durante 4 horas. entonces Se reemplazó el medio con medio que contenía suero durante 36 horas. Se recogieron los medios, se centrifugaron para eliminar los restos celulares y se utiliza para transfectar las células A549 y BEAS-2B. Cuarenta y ocho horas después de la adición de virus, se seleccionaron células transfectadas para mediante la adición de 2 mg /ml de puromicina al medio de crecimiento.
Tiempo real RT-PCR (qPCR) para la cuantificación de ARN pequeños
Total ARN (20 ng), aislado a partir de células usando el kit PureLink ™ Micro-to-Midi total de aislamiento de ARN (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante, se sometió a transcripción inversa utilizando TaqMan ™ kit de transcripción inversa (Applied Biosystems®, Foster City, CA) y cebadores de ARN específico, siempre con los ensayos de microARN TaqMan ™ (Applied Biosystems®) en 15 l, con recocido a 16 ° C durante 30 min, seguido de extensión a 42 ° C durante 30 min. 1,33 l de la reacción de RT se utilizó luego con 1 mu L cebadores específicos para cualquiera de
RNU6B
,
miR-30a
, o
miR-191 gratis (Applied Biosystems®, Foster City, CA) en pocillos por triplicado para 44 ciclos de PCR en un termociclador 7900HT (Applied Biosystems®). El paso de desnaturalización a 95 ° C fue de 15 s, y la etapa de hibridación y extensión a 60 ° C fue de 1 min. Se utilizó el software SDS (Applied Biosystems®, Foster City, CA) para determinar los valores de ciclo umbral (Ct) de la fluorescencia medida durante la PCR. el software Prism 5.0b (GraphPad®; La Jolla, CA) se utilizó para el análisis estadístico y la representación gráfica
Camino de Enriquecimiento Análisis
El software miRgator a disposición del público (http: //genome.ewha.. ac.kr/miRGator/miRGator.html) se utilizó para realizar el análisis de enriquecimiento vía. El miRNAs específicos seleccionados fueron
miR-191 y
-
30a-5p
. El algoritmo de selección de destino elegido fue de Miranda [3]