Extracto
Antecedentes
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, con una supervivencia global a cinco años tasa de sólo el 15%. inhibidor canceroso de PP2A (CIP2A) es un ser humano inhibir oncoproteína PP2A en muchos tumores malignos humanos. Sin embargo, si CIP2A puede ser una nueva diana terapéutica para el cáncer de pulmón es en gran medida poco clara.
Metodología /Principales conclusiones
normal y los tejidos malignos de pulmón se obtuvieron de 60 pacientes con cáncer de pulmón desde el sur de China. RT-PCR, transferencia de Western e inmunohistoquímica se utilizaron para evaluar la expresión de CIP2A. Encontramos que entre los 60 pacientes, CIP2A era indetectable o muy bajo en los tejidos normales paratumor, pero fue elevado dramáticamente en las muestras tumorales en 38 (63,3%) pacientes. CIP2A sobreexpresión se asocia con el consumo de cigarrillos. Silenciando CIP2A de siRNA inhibe la proliferación y la actividad clonogénico de células de cáncer de pulmón. Curiosamente, se encontró un compuesto natural, rabdocoetsin B que se extrae de un chino Medicinal coetsa hierba Rabdosia tradicional, podría inducir a la baja regulación de CIP2A y la inactivación de la vía de Akt, e inhibir la proliferación e inducir la apoptosis en una variedad de células de cáncer de pulmón.
conclusiones /Importancia
Nuestros hallazgos indican fuertemente que CIP2A podría ser un blanco eficaz para el desarrollo de fármacos cáncer de pulmón, y los potenciales terapéuticos de agentes CIP2A-dirigidos requieren más investigación.
cita: Ma L, Wen ZS, Liu Z, Z Hu, Ma J, Chen XQ, et al. (2011) La sobreexpresión de moléculas pequeñas y activado por regulación a la baja de CIP2A en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (5): e20159. doi: 10.1371 /journal.pone.0020159
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 31 Enero, 2011; Aceptado: April 12, 2011; Publicado: 31 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Ma et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Programa Nacional clave de Investigación básica (973, 2010CB529201), el Proyecto clave del Programa de Innovación del conocimiento de la Academia china de Ciencias (KSCX1-YW-R-26 y KSCX2-YW-R-235), el Fundación nacional de Ciencias Naturales de China (81071930, 30871110), el Programa nacional de Ciencia tecnológico importante y para el descubrimiento de medicamentos (2009ZX09103-101), y de la Ciencia y Tecnología de Proyectos Planificación de Guangzhou (2009Y-C011-2). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Casi 1,5 millones de personas fueron diagnosticadas con cáncer de pulmón y 1,4 millones de personas fueron estimados a morir de ella en 2007 [1]. Las dos formas principales de cáncer de pulmón son el cáncer no microcítico de pulmón (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). Alrededor del 85% de los cánceres de pulmón son NSCLC, que se pueden dividir en tres grandes subtipos histológicos: carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de células grandes. SCLC representa alrededor del 15% de los cánceres de pulmón [2]. El tabaquismo causa todos los tipos de cáncer de pulmón, pero está más fuertemente relacionada con SCLC y el carcinoma de células escamosas; adenocarcinoma es el tipo más común en pacientes que nunca han fumado [2]. El tratamiento actual está determinado por el tipo histológico de cáncer de pulmón y de la etapa en el diagnóstico, incluyendo la cirugía, la terapia de doblete de platino, radioterapia y terapia dirigida. Por desgracia, el pronóstico del cáncer de pulmón es pobre, con un 15% de tasa de supervivencia global a cinco años para todos los estadios combinados [1]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar dianas moleculares más eficaces y nuevas terapias dirigidas para el cáncer de pulmón.
canceroso inhibidor de PP2A (CIP2A) es una oncoproteína humana que estabiliza c-Myc mediante la inhibición de la proteína fosfatasa 2A (PP2A ) desfosforilación mediada de MYC en la serina 62 [3]. Además de inhibir la degradación de c-Myc, CIP2A parece estar regulada en un bucle de realimentación positiva con c-Myc mediante la promoción de la expresión de cada uno [4]. CIP2A se sobre-expresa en cuello humano y el cáncer de cabeza, de colon, de mama y cáncer gástrico, y está inversamente correlacionada con la evolución de la enfermedad en el cáncer gástrico [3] - [7]. Sin embargo, si CIP2A podría ser una nueva diana terapéutica para el cáncer no está totalmente investigado, y sigue siendo en gran parte desconocida la actividad antitumoral de los agentes CIP2A-dirigidos. Se estudió la expresión de CIP2A en cáncer de pulmón y se exploró para los compuestos de plomo que podrían dirigirse CIP2A [8]. Aquí nos muestran que CIP2A es aumentada considerablemente en los tumores de cáncer de pulmón en comparación con tejidos pulmonares normales adyacentes de pacientes emparejados, y el informe que un compuesto natural que desencadena la regulación a la baja de CIP2A muestra actividad antitumoral significativa en líneas celulares de cáncer.
Resultados
CIP2A se sobreexpresa en el cáncer de pulmón y se asocia con el consumo de cigarrillos
Hemos probado la expresión de CIP2A a nivel de proteínas en las células no malignas y malignas, y se encontró que CIP2A fue altamente expresado en el cáncer de pulmón líneas celulares (A549, H1975, 95D y L78) en comparación con los fibroblastos normales humanos embrionarias pulmonares (HLF y MRC5) y células normales humanas bronquiales epiteliales (HBEpiC) (Figura 1A). A continuación, analizó CIP2A en muestras de cáncer de pulmón de 60 pacientes procedían del sur de China, cuyas características de línea de base fueron listados en la Tabla 1. Hemos demostrado que CIP2A estaba sobreexpresado en 38 muestras (63,3%) tumorales ensayadas por el Western Blot (Figura 1B). Sin embargo, en los 60 tejidos pulmonares normales adyacentes de pacientes emparejados, CIP2A fue indetectable en 57 muestras (95%), y se expresó débilmente en 3 (5%) los especímenes donde su expresión era mucho menor que en las muestras tumorales de los mismos pacientes . En las muestras de 2 pacientes con seudotumor inflamatorio, CIP2A no se detectó tanto en el pseudotumor y tejidos pulmonares adyacentes (Figura 1C). ensayo de inmunohistoquímica confirmó que CIP2A fue elevado dramáticamente con una puntuación más alta inmunoreactividad en muestras de tumores en 26 de 39 pacientes (66,7%) ensayados (Figura 1D). En el nivel de ARNm,
CIP2A
fue también sobre-expresado en tejidos tumorales de pulmón en comparación con tejidos pulmonares normales en 39 de 58 (67,2%) de los pacientes analizados (Figura 1E). Tomados en conjunto, CIP2A se eleva drásticamente en las muestras de tumor de cáncer de pulmón en comparación con tejidos pulmonares normales emparejados
(A):. Análisis de transferencia Western de CIP2A en células de cáncer de pulmón humano (A549, H1975, 95D y L78), embrionario de pulmón de células de fibroblastos (HLF y MRC-5), y las células normales humanas bronquiales epiteliales (HBEpiC). (B): análisis de transferencia Western de la proteína CIP2A en los tumores primarios de pulmón (T) y los tejidos pulmonares normales adyacentes (N). β-actina se usa como control de carga. Los resultados representativos se muestran y se hace referencia a los números de los pacientes individuales. (C): análisis de transferencia Western de la proteína CIP2A en seudotumor inflamatorio (P) y los tejidos pulmonares normales adyacentes (N). β-actina se usa como control de carga. (D): Imágenes representativas (panel izquierdo) y la puntuación (panel derecho) de la tinción inmunohistoquímica para la expresión CIP2A en los tumores primarios de pulmón (T) y los tejidos pulmonares normales adyacentes (N). (E): análisis de RT-PCR de
CIP2A
mRNA en tumores primarios de pulmón (T) y los tejidos pulmonares normales adyacentes (N).
GAPDH
se emplea como control de carga. Los resultados representativos se muestran y los números se refieren a los pacientes individuales.
sobreexpresión CIP2A se asocia con el consumo de cigarrillos
Se analizó la correlación entre la sobreexpresión CIP2A y algunas variables clínico-patológicas. Los datos demostraron que CIP2A sobreexpresión en el cáncer de pulmón se correlacionó significativamente con el tipo histológico de carcinoma de células escamosas (p = 0,003) y el sexo masculino (p = 0,008) (Tabla 1) que se muestra para enlazar fuertemente con el consumo de cigarrillos [2], [ ,,,0],9]. Además, nuestros datos muestran claramente que la alta expresión de CIP2A se asoció con pacientes fumadores (p = 0,004). No se observó ninguna diferencia significativa en el estado CIP2A de acuerdo con el estadio patológico (p = 0,639) y la edad (0,082) (Tabla 1). En un intento por aclarar los factores más importantes relacionados con CIP2A sobreexpresión, se realizaron los análisis multivariados, y el análisis de regresión logística multivariante (tabla 2) demostraron que el consumo de cigarrillos fue la única variable significativa asociada con CIP2A sobreexpresión en cáncer de pulmón (p = 0,008 ).
la nitrosamina 4- (methylnitro-Samino) -1- (3-piridil) -1-butanona, o la nitrosamina cetona nicotina derivados (NNK), es un ingrediente clave del tabaco carcinógeno humo que sistémicamente induce tumores de pulmón en ratas, ratones y hámsters y también juega un papel importante en la carcinogénesis pulmonar [10], [11]. a continuación, se investigó si NNK podría inducir directamente la regulación al alza de CIP2A o no. Para ello, HBEpiC (Figura 2A) y BEAS-2B (Figura 2B) de las células epiteliales bronquiales fueron expuestos a NNK a la concentración indicada para los puntos de tiempo indicados, se lisaron, y Western blot se realizó para analizar la expresión de CIP2A. Los resultados mostraron que el tratamiento con NNK en 0,1 a 10 micras para un máximo de 18 días no pudo perturbar expresión CIP2A (Figura 2, A y B). En este estudio, no hemos probado el efecto a largo plazo de NNK en la expresión CIP2A
in vitro
o
in vivo
(A):. Se trataron células HBEpiC con NNK a diversas concentraciones para los puntos de tiempo indicados, y de transferencia de Western se realizó para analizar la expresión CIP2A. (B): BEAS-2B células fueron tratadas con NNK a las concentraciones indicadas para los puntos de tiempo indicados, y Western Blot se llevó a cabo para analizar la expresión CIP2A. 0,05% y 0,1% de DMSO se utilizaron como un control de disolvente que corresponde a 5 μΜ y 10 μΜ NNK, respectivamente.
se requiere CIP2A para el crecimiento de células de cáncer de pulmón y la transformación
CIP2A siRNA específico para evaluar su papel en la patogénesis del cáncer de pulmón, y los resultados mostraron que en comparación con el control negativo (NC), CIP2A silenciamiento (Figura 3A) condujo a la inhibición de la actividad clonogénica de las células A549, detectado por la formación de focos ( la figura 3, B y C) y la formación de colonias en agar blando (Figura 3, D y e) los ensayos de [3]. Estos fenómenos fueron confirmadas por los resultados de CIP2A silenciamiento en células L78 (Figura S1, la A a la E). A continuación, las células A549 fueron transfectadas con siRNA-NC o CIP2A específica (Figura 3F), y se inyecta por vía subcutánea en el flanco derecho e izquierdo de 8 ratones desnudos, respectivamente, y se calcularon los volúmenes tumorales cada dos días [12]. Curiosamente, siRNA significativamente el crecimiento tumoral inhibido CIP2A específica en comparación con NC-siRNA (Figura 3, G a través de I). En conjunto, estos datos indican que CIP2A es esencial para la proliferación del cáncer de pulmón y la tumorigénesis, y podría ser una diana terapéutica eficaz
(A):. El análisis de transferencia Western de la expresión de proteínas en células A549 CIP2A 72 h después de la transfección con negativo control (NC) o siRNA CIP2A-específico. (B y C): ensayo de formación de clon de placa plana para la actividad clonogénico de las células A549 72 h después de la transfección con NC o siRNA CIP2A-específico. (B): luz representante miscroscopy imágenes. (C): La cuantificación de recuento de focos. Se muestra la media ± SD es de cuatro experimentos independientes. (D y E): ensayo de formación de colonias en agar blando de las células A549 transfectadas con NC o siRNA CIP2A-específico. (D): luz representante miscroscopy imágenes. (E): La cuantificación de recuento de focos. (F): El análisis de transferencia Western de la proteína CIP2A en células A549 transfectadas con NC o siRNA CIP2A específico para 72 h. (G): ratones Nude inyecta por vía subcutánea con células A549 transfectadas con NC o siRNA CIP2A-específico. (H): La curva de crecimiento del tumor para el experimento que se muestra en (G). Se muestra la media ± SD de los volúmenes tumorales medios. (I) Imagen de xenoinjertos de tumores obtenidos a partir de ratones que se muestran en (G). * P & lt; 0,01, prueba de la t de Student
Rabdocoetsin B es un compuesto natural CIP2A de metas de
Nuestro objetivo central es identificar nuevas dianas de medicamentos y proporcionar los compuestos de plomo para el desarrollo de fármacos.. Tenemos pruebas de CIP2A de metas de moléculas pequeñas mediante el análisis de sus efectos sobre la expresión CIP2A, y se identificaron un compuesto natural que se extrae de un medicamento coetsa Robdosia herbal china, rabdocoetsin B [13], [14] (Figura 4A), podría regular negativamente CIP2A a nivel de proteínas en 5 a 20 micras de células A549 (Figura 4B). En las células H1975, Rabdocoetsin B también ha disparado regulación a la baja de CIP2A a los 5 a 10 mM (Figura 4C). Se analizó el mecanismo de CIP2A baja regulación causada por Rabdocoetsin B, y se encontró que rabdocoetsin B, inhibió la transcripción de CIP2A en una forma dependiente de la dosis (Figura 4D) evaluada por tiempo real de RT-PCR.
(a): Estructura de rabdocoetsin B. (B): células A549 se trataron con rabdocoetsin B (RdB) a diversas concentraciones durante 48 h. Las transferencias Western se utilizaron para detectar la expresión de la proteína CIP2A (panel superior) y expresión de la proteína CIP2A se cuantificaron y se normalizó contra la expresión β-actina (panel inferior) (C): H1975 células fueron tratadas con rabdocoetsin B a varias concentraciones durante 24 h. Las transferencias Western se utilizaron para detectar la expresión de la proteína CIP2A (panel superior) y expresión de la proteína CIP2A se cuantificó y se normalizó contra la expresión β-actina (panel inferior) (D): células A549 se trataron con rabdocoetsin B a varias concentraciones durante 48 h, y la expresión de ARNm de
CIP2A
se analizó utilizando en tiempo real de RT-PCR.
Rabdocoetsin B inhibe CIP2A modulada Akt fosforilada
En las células de carcinoma hepatocelular, CIP2A hasta regula fosfo-Akt (pAkt) y disminuye la actividad de PP2A relacionados Akt-, mientras que el silenciamiento CIP2A vuelve a activar PP2A [15]. Desde Akt es constitutivamente activa en células de cáncer de pulmón y promueve la supervivencia celular y la resistencia a la quimioterapia y la radiación [16], [17], se examinó el efecto de CIP2A en pAkt en el cáncer de pulmón. Demostramos que CIP2A silenciamiento de siRNA específico dio lugar a baja regulación de pAkt pero no Perk, PCNA, β-catenina, EGFR o Src (Figura 5A). a continuación, se investigó si rabdocoetsin B podría modular la expresión de pAkt, y encontramos que el tratamiento con rabdocoetsin B en 5 a 10 M-regulado también pAkt en el A549 (Figura 5B) y las células H1975 (Figura 5C). Hemos demostrado, además, que en las células H1975 sobre rabdocoetsin B en 10 M, CIP2A se downregulated notablemente en 6 a 12 h, y se hizo indetectable en 48 h (Figura 5D), mientras que pAKT se redujo en 18 h (Figura 5D). Estos resultados se confirmaron en células A549 tratadas con rabdocoetsin B (Figura 5E), lo que indica que este compuesto puede inhibir la vía CIP2A-Akt en el cáncer de pulmón
(A):. Las células A549 se transfectaron con NC o CIP2A- siRNA específico durante 72 h, y la expresión de las proteínas indicadas se detectaron usando transferencias Western. (B y C): células H1975 (C) A549 (B) y se trataron con rabdocoetsin B (RdB) a las concentraciones indicadas durante 48 y 24 h, respectivamente, y se realizaron transferencias de Western para analizar la expresión de las proteínas indicadas. (D y E): H1975 (D) y A549 células (E) fueron tratados con rabdocoetsin B (RdB) para los puntos de tiempo indicados, y Western blot se llevó a cabo con anticuerpos específicos para las proteínas indicadas. β-actina se utilizó como control de carga.
Efectos de Rabdocoetsin B en células de cáncer de pulmón
Se evaluaron los efectos de rabdocoetsin B en células de cáncer de pulmón que expresan en todo tipo (WT ) o EGFR mutante. Demostramos que rabdocoetsin B exhibió efectos citotóxicos significativos sobre A549, NCI-H1975, HCC827, SPC-A-1, GLC-82, L78 y líneas celulares de cáncer de pulmón 95D (Figura 6, A y B). Rabdocoetsin B induce apoptosis de las células A549 (Figura 6C) con la activación de casp-8 y casp-9 y la escisión de PARP (Figura 6D). Rabdocoetsin B también causó la activación de Casp-8 y casp-9 y la escisión de PARP en NCI-H1975 células (Figura 6E). Estos resultados indican que rabdocoetsin B inhibe la proliferación e induce la apoptosis de células de cáncer de pulmón a través de la activación de las vías de la apoptosis endógenos y exógenos
(A):. Las células de cáncer de pulmón fueron tratados con concentraciones de Rabdocoetsin B (RdB) aumentar (de 1 mM a 10 mM) y la viabilidad celular se midió 48 h mediante el ensayo de MTT. (B): la IC50 de células tratadas con rabdocoetsin B. (C): Rabdocoetsin B induce la apoptosis de las células A549, ensayados por citometría de flujo. (D y E): Se realizaron transferencias de Western para detectar la expresión de reguladores de la apoptosis en el A549 (D) y H1975 células (E) guía empresas
Discusión
CIP2A es un auto. antígeno [7] que se sobreexpresa en los tumores humanos [3] - [7], [18] - [21]. Peng [22] mostró que en pacientes con sede en América, CIP2A se incrementa en 61 de los 72 (84,7%) muestras de tejido de cáncer de pulmón, que es significativamente mayor que en los tejidos pulmonares normales (14,3%, 9/63). Recientemente, Dong et al [23] informó de que en 29 pacientes procedentes del norte de China,
CIP2A
se sobreexpresa en el nivel de ARNm en 24 casos (82,7%) en muestras de tumores en comparación con sus correspondientes tejidos normales; CIP2A proteína (detectada por inmunohistoquímica) se encuentra que es sobreexpresado en el 72,2% de las muestras de cáncer de pulmón 90 y se correlacionó con la supervivencia pobre. Probamos la expresión CIP2A en 60 pacientes del sur de China [8], y el informe que CIP2A se incrementa drásticamente en un 63,3% (detectado por Western Blot) o 67,2% (a nivel de ARNm) de las muestras tumorales en comparación con tejidos normales adyacentes (Figura 1) .
se demuestra por primera vez que CIP2A sobreexpresión se asocia con el consumo de cigarrillos. En el 60 de pulmón los pacientes de cáncer examinados en este estudio, 28 de 36 (77,8%) pacientes fumadores mostrar incremento en la expresión de CIP2A en las muestras tumorales en comparación con sus muestras normales adyacentes, mientras que 10 de 24 (41,7%) casos que no fumaban exhibición regulada arriba CIP2A a nivel de proteína (p = 0,004) (Tabla 1). Actualmente el tabaquismo sigue siendo más frecuente entre los hombres (63%) que en mujeres (3,8%) [24]. Presentamos aquí que CIP2A se sobre-expresa en 30/40 (75%) y 8/20 (40%) en hombres y mujeres pacientes (p = 0,008) (tabla 1), respectivamente. También encontramos que CIP2A es elevada en 17/19 (89,5%) pacientes con carcinoma de células escamosas, mientras que 17/35 (48,6%) pacientes con adenocarcinoma tienen sobreexpresada CIP2A (p = 0,003) (Tabla 1). El análisis de regresión logística multivariante demuestra claramente que el tabaquismo es la única variable significativa asociada con CIP2A sobreexpresión en cáncer de pulmón en nuestro medio (p = 0,008) (Tabla 2). Mientras que la tasa general de fumar en los sectores norte y el nordeste es más alta que en el sur y el este de China, la prevalencia de la exposición al humo ambiental de tabaco entre los no fumadores en el norte de China es significativamente mayor que en los no fumadores en el sur de China [24], [ ,,,0],25]. Estos pueden contribuir a la diferencia en la expresión CIP2A entre los pacientes en nuestro medio y el informe de Dong [23]. El humo del tabaco que causa aproximadamente 5-6 millones de muertes al año y el 31% y el 6% de todas las muertes por cáncer de pulmón en hombres y mujeres de mediana edad, respectivamente [26], puede inducir cambios genéticos y epigenéticos y reducir la capacidad de reparación del ADN [2]. Zhao et al [27] mostró recientemente que, en líneas de células gástricas humanas,
Helicobacter pylori
puede inducir la expresión CIP2A a través de la activación oncogénica bacteriana causada CagA-de la Src y las vías de señales /ERK MEK. Aunque NNK (0,1 a 50 mM) no regular al alza CIP2A en las células HBEpiC y BEAS-2B en un máximo de 18 días en nuestro estudio (Figura 2), no podemos excluir la posibilidad de que NNK puede perturbar la expresión de la oncoproteína en un más largo por supuesto el tiempo de exposición, y esta hipótesis de nuevas investigaciones.
CIP2A es crítico para el crecimiento de células de cáncer de pulmón, ya que CIP2A desmontables por resultados siRNA específicos en una inhibición significativa de la proliferación celular y la transformación in vitro e in vivo (Figura 3 y Figura S1). Estos datos indican que CIP2A podría ser un objetivo atractivo para nuevos fármacos contra el cáncer de pulmón. Curiosamente, se identifica un compuesto natural rabdocoetsin B, puede regular a la baja la proteína CIP2A en células de cáncer de pulmón (Figura 4, A a C) mediante la inhibición de su expresión a nivel de mRNA (Figura 4D). Los estudios demuestran que CIP2A puede regular por incremento pAkt [15], y nuestros resultados confirman que CIP2A silenciamiento puede disminuir pAkt (Figura 5A). Además, muestran que rabdocoetsin B también inhibe pAkt (Figura 5, B a E). Rabdocoetsin B inhibe el crecimiento e induce la apoptosis de una variedad de células de cáncer de pulmón (Figura 6, A a E). Así, nuestros datos proporcionan un compuesto de plomo para CIP2A de metas de terapias antitumorales.
Materiales y Métodos
Las muestras de pacientes
El uso de las muestras fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Instituto de Zoología de la Academia china de Ciencias y el hospital del cáncer, Universidad de Sun Yat-Sen. Todo tumor y muestras de tejidos normales adyacentes fueron obtenidas con el consentimiento informado por escrito de los pacientes en el Hospital del Cáncer, Universidad de Sun Yat-Sen. Para el análisis de RT-PCR, las muestras de tejido se molieron en un mortero enfriado con nitrógeno líquido, se extrajo el ARN usando el Trizol (Invitrogen), y los experimentos de RT-PCR se realizaron usando PrimeScript® One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Takara) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las secuencias de los primers utilizados para la
CIP2A ¿Cuáles son los siguientes: adelante 5'-CCATATGCTCACTCAGATGATGT-3 ', 5'-_ revertir GTGTATCATCTCCACAGAGAGTT-3' [5]
Para el ensayo de Western blot, los tejidos. muestras se molieron en un mortero enfriado con nitrógeno líquido, polvo de tejido se suspendió en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS, 1 mM Na
3Vo
4, mM NaF 1 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1, completa proteasa cóctel inhibidor) y se aclaró por centrifugación. Cantidades iguales de muestras se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a inmunotransferencia con anti-CIP2A o anti-β-actina de anticuerpos.
ensayo inmunohistoquímico y la puntuación de la inmunorreactividad se realizaron como se describe [28]. , muestras de tejido de cáncer de pulmón en parafina fijados con formol (5 micras) se deparaffinized y se sometieron a una etapa de recuperación del epítopo inducida por calor durante 2 minutos. El H
2O
2 (3%) se utilizó para bloquear la actividad peroxidasa endógena durante 10 min. A continuación, las secciones se lavaron con PBS. El anticuerpo anti-CIP2A policlonal de conejo se aplicó a los portaobjetos a una dilución de 1:500 a 4 ° C durante la noche. La detección se logra con el kit de inmunohistoquímica (PV-6001) (Zhongshan puente Golden Biotecnología Co, Ltd, Beijing, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las secciones se colorean con 3, 3'-diaminobencidina (DAB) y de contraste con hematoxilina, se deshidrataron, se trata con xileno, y se montaron. los niveles de proteína CIP2A se calificaron como se describe [29].
Agentes
Rabdocoetsin B fue extraído de Robdosia coetsa por el profesor Han Dong-Sol El 3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (-z-y1) -3, phenytetrazoliumromide 5-di- (MTT) se adquirió de Amresco, Inc. (Solon, OH). Kit de PE Anexina V-7AAD de detección de apoptosis se obtuvo de BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.)
Los anticuerpos
Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron los siguientes:. anti-β-actina (Sigma); anti-casp-9 (C9), anti-casp-8 (1C12); anti-PARP, anti-fosfo-p44 /42 MAPK, anti-EGFR, anti-Src y anti-β-catenina (señalización de la célula), anti-CIP2A (2G10-3B5), anti-pAKT y ATK (Santa Cruz Biotechnology) ; anti-ERK2 (Abcam); anti-PCNA (Abmart); anti-conejo o anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-ratón (Pierce); Policlonal de conejo anti-CIP2A (Novus Productos Biológicos, Inc). La detección se realizó mediante el uso de un kit de detección quimioluminiscente Western (Señalización Celular).
Cultivo celular
Las líneas de cáncer de pulmón NCI-H1975 y A549 y células de riñón embrionario humano HEK-293 se obtuvieron de la American Tissue Culture Collection (ATCC) y fibroblastos de pulmón embrionario humano células MRC-5 se adquirieron en el Centro de recursos de la célula, la Academia china de Ciencias médicas (Beijing). Las células normales epiteliales bronquiales humanas (HBEpiC, número de catálogo: 3210) fueron adquiridos de Sciencell (Laboratorios de Investigación Sciencell, San Diego, California). líneas celulares de carcinoma escamoso de pulmón humano líneas celulares de cáncer de pulmón de células grandes y altamente metastásicas L78 95D se obtuvieron del banco de células de la Academia China de Ciencias (Shanghai), y las células de fibroblastos de pulmón HLF embrionarias humanas se adquirieron de Kenqiang Instrument Co., Ltd ( Shanghai, China). células epiteliales bronquiales BEAS-2B fueron proporcionados por el profesor Ji Hongbin en Shanghai Instituto de Ciencias Biológicas de la Academia China de Ciencias. A549, HLF y BEAS-2B células fueron cultivadas en Dulbecco modificado medio de Eagle (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina. HBEpiC células se cultivaron en una célula epitelial bronquial medio libre de suero (BECM, Cat. No. 3211, Laboratorios de Investigación Sciencell) que contiene ácidos esenciales y no esenciales, aminoácidos, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento y los oligoelementos. L78, 95D y NCI-H1975 células fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina. Células MRC-5 se cultivaron en medio MEM /EBSS complementado con ácidos no esenciales aminoácidos, suero bovino fetal 10%. (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina
Evaluación de la proliferación celular y la apoptosis
Las células se trataron con Rabdocoetsin B de los puntos de concentración y tiempo indicados. La proliferación celular se determinó usando el ensayo de MTT. La viabilidad celular se estimó por exclusión de tripan colorante azul. Externalización de la fosfatidilserina se puso a prueba utilizando un kit de detección de apoptosis AAD PE Anexina V-7 (BD Biosciences, San Jose, CA) según las instrucciones del fabricante.
Cuantitativo PCR en tiempo real
real cuantitativa tiempo de PCR se realizó en CFX
TM96 real Time System (Bio-Rad) utilizando SYBR Premezcla Ex Taq ™ (Perfecto tiempo real) (Código de Takara: DRR041) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores para CIP2A y actina fueron los siguientes: CIP2A: secuencia adelante, 5'-TGCGGCACTTGGAGGTAATTTC-3 ', la secuencia inversa, 5'-AGCTCTACAAGGCAACTCAAGC-3'; Actina: secuencia adelante, 5'-ATCGTCCACCGCAAATGCTTCTA-3 ', a la inversa, 5'-AGCCATGCCAATCTCATCTTGTT-3'. Los niveles de mRNA CIP2A se expresaron como la relación frente a la actina en base a los valores de CT.
ensayos de siRNA
Uso HiPerFect reactivo de transfección (Qiagen, Crawley, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante, las células se transfectadas con 100 oligonucleótidos de doble cadena siRNA nM de [3]. Las secuencias de siRNA fueron 5'-CUGUGGUUGUGUUUGCACUTT-3 '(CIP2A siRNA1), 5'-ACCAUUGAUAUCCUUAGAATT-3' (CIP2A siRNA2) [3], y 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '(control negativo (NC) siRNA).
ensayo clonogénico
Para la formación de focos, A549 o L78 células transfectadas con siRNA de control negativo o CIP2A-específicos se sembraron por triplicado en placas de 35 mm (300 células por placa). Después de 14 días de cultivo, las células fueron teñidas con Giemsa y los clones que contienen más de 50 células fueron contadas. Para el ensayo de formación de colonias en agar blando, las células se suspendieron en 1 ml de DMEM (para células A549) o RPMI 1640 (por L78 células) que contenían de agarosa 0,3% de bajo punto de fusión (Amresco, Solon, OH) y 10% de FBS y se sembraron en una capa inferior que contiene 0,6% de agarosa en 35 mm plat (1.000 células /placa) por triplicado. Después de 2-3 semanas de cultivo, las placas se tiñeron con Giemsa y se contaron las colonias con un microscopio óptico.
Los modelos murinos
Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité de Ética Animal de el Instituto de Zoología de la Academia china de Ciencias, con el ID de autorización de AEC2010070202. Todos los ratones utilizados en este estudio fueron criados y mantenidos en un ambiente libre de patógenos específicos. ratones Nude (n = 8) fueron inyectados por vía subcutánea con células A549 (4 × 10
6) transfectadas con NC o siRNA-CIP2A específica en derecha e izquierda flancos, respectivamente, y el tumor se calculó como se describe [12].
El análisis estadístico
se evaluaron las diferencias entre grupos de datos utilizando importancia para Estudiantes
t-test
de datos no apareados, χ
2 de ensayo o en un solo sentido el análisis de varianza y de Bonferroni -prueba. El volumen del tumor se analizaron con ANOVA de una vía y muestra independiente
t
prueba utilizando el software SPSS 12.0 para Windows (Chicago, IL). La asociación entre CIP2A alta expresión y función clinicopatológica se evaluó utilizando χ
2 test o la prueba exacta de Fisher, y un análisis de regresión por pasos hacia atrás multivariante logística se llevó a cabo para investigar las variables más significativas relacionadas con CIP2A sobreexpresión después del ajuste . Los valores de p & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces y los datos se presentan como la media ± SD a menos que se indique lo contrario.
Apoyo a la Información
Figura S1.
los efectos del agotamiento CIP2A en el crecimiento y trasnsformation las células L78 '. (A): análisis de transferencia de Western de la expresión de proteínas en CIP2A L78 células 72 h después de transfección con NC o siRNA CIP2A-específico. (B y C): ensayo de formación de clon de placa plana para la actividad clonogénico de células L78 72 h después de la transfección con NC o siRNA CIP2A-específica. (B): Imágenes de microscopía de luz representativos. (C): La cuantificación de recuento de focos. Se muestra la media ± SD es de tres experimentos independientes. (D y E): ensayo de formación de colonias en agar blando de las células transfectadas con L78 NC o siRNA CIP2A-específico. (D): Imágenes de microscopía de luz representativos. (E): La cuantificación de conteo de focos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0020159.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
Agradecemos a los profesores Zhu Chen, SAI- Juan Chen y Zhen-Yi Wang en Shanghai Instituto de Hematología por su apoyo a largo plazo. Los autores agradecen al profesor Jukka Westermarck en la Universidad de Turku, Finlandia para proporcionar el constructo pcDNA3.1-CIP2A, y el profesor Ji Hongbin en Shanghai Instituto de Ciencias Biológicas de la Academia China de Ciencias para proporcionar a las células BEAS-2B.